CN107050040A - Hifu控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统及其制备方法和用途 - Google Patents

Hifu控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种HIFU控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统及其制备方法和用途，该递药系统包括靶向分子、药物、发泡剂和纳米载体，所述靶向分子为Angiopep‑2短肽，药物为阿霉素，发泡剂为全氟辛烷，纳米载体为末端羧基修饰的聚乳酸‑羟基乙酸共聚物为主的高分子材料；所述药物与发泡剂以包裹的方式共包载在纳米载体内；所述靶向分子通过共价连接的方式连接在纳米粒表面。本发明递药系统能够靶向高表达LRP受体的血脑屏障以及脑胶质瘤细胞，有效提高药物在脑胶质瘤部位的蓄积，当药物充分蓄积后给予HIFU辐照，诱导药物在脑胶质瘤部位瞬时充分释放，极大地提高脑胶质瘤细胞内的药物浓度，从而显著提高脑胶质瘤的治疗效果，同时有效降低药物对正常组织的毒副作用。

Description

HIFU控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种脑靶向递药系统，具体涉及一种短肽Angiopep-2修饰的、由高强度聚焦超声(HIFU)控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统及其制备方法和用途。
背景技术
多形性神经胶质母细胞瘤Glioblastoma multiforme(GBM)作为颅内最常见且死亡率最高的原发性恶性肿瘤，其平均生存期仅有14个月。传统的外科切除难以将肿瘤组织完全清除而易导致复发。化疗效果又受血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的限制，仅有10～20％的诸如替莫唑胺、卡莫司汀等化疗药物能透过血脑屏障，致使药物入脑率极低，加之目前临床化疗药物多缺乏靶向性，最终到达肿瘤组织的药量少之又少，使得化疗效果并不理想，同时一系列的毒副作用也严重影响到患者的生存质量，术后生存期一般不超过半年。1986年肿瘤的增强穿透与滞留(enhanced permeability and retention,EPR)效应的发现为大分子药物被动靶向递送开启了一扇窗，然而脑部肿瘤的EPR效应相对较弱，其平均孔径仅为7～100nm，为此脑部肿瘤递药系统的尺寸受到了很大限制。
近年来，纳米靶向递药系统凭借其在尺寸及表面修饰方面的优势，受到越来越多的关注。作为四大入胞途径之一，内源性受体介导的转胞吞作用被广泛应用于血脑屏障及脑肿瘤的靶向药物递送。其中，低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-densitylipoproteinreceptor-related protein,LRP)作为近年来公认且有效的脑靶向marker之一，同时高表达于血脑屏障及脑胶质瘤细胞表面。其配体Aniopep-2短肽常用于脑靶向递药系统的修饰，从而实现对血脑屏障以及脑胶质瘤细胞的双重靶向作用。
阿霉素(Doxorubicin,Dox)作为最有效的广谱抗肿瘤药之一，被用于循环肿瘤以及脑胶质瘤在内的等多种实体瘤的治疗。它能插入DNA双链、抑制拓扑异构酶Ⅱ的活性，从而阻断DNA的转录，进而达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。然而由于缺乏靶向性，对正常组织尤其是心脏的毒副作用很大程度上限制了阿霉素的发展。现用于临床的脂质体阿霉素虽然显著提高了阿霉素的体内安全性，但增加靶向性仍是阿霉素递药系统改良优化的主要方向之一。
随着科学家们对肿瘤微环境的研究深入，针对肿瘤微环境来调控药物释放的递药系统层出不穷，大致分为对内源性刺激响应和外源性刺激响应的两大类药物控释系统。其中，外源性的机械力刺激一般可从声、电、磁等途径获得。超声，是指大于20kHz的声波，广泛应用于医学造影、碎石、组织消融、经皮给药等用途。超声以其高频聚焦的特性，通过对空间及温度的调控，以微创且远程的方式实现对“刺激”的控制。医学应用中，超声通过热效应及空穴效应两方面来发挥作用。跟据频率的高低，超声可分为低频超声(20～200kHz)和高频超声(＞200kHz)两类。低频超声具有强穿透力、低衰减的优势，但难以聚焦以及产生的强大空穴效应均会对人体造成损伤。而高频超声的高聚焦能力及高衰减特性则对焦点以外的组织不会造成损伤，因此被广泛应用于疾病的诊断和治疗。近些年兴起的高强度聚焦超声(High-Intensity Focused Ultrasound,HIFU)---“海扶刀”(0.8～3.2MHz)因其毫米级的超高聚焦能力在肿瘤组织消融方面备受青睐，高频超声波到达组织后急剧衰减转化为热能，使得焦点温度瞬间升高至60℃以上，导致蛋白变性及组织细胞不可逆凝固性坏死；而空穴效应也使组织间液、细胞间液汽化膨胀以致爆破，所产生的辐向力最终导致细胞损伤、坏死。
同时，超声也应用于合成化学尤其是高分子化学中，有文献报道高频超声可以诱导高分子解聚，这为药物的控释提供了新的思路。但目前由普通高频超声调控的递药系统还比较局限，多为脂质体或胶束，粒径均偏大，所适用的疾病类型范围较窄。而高强度聚焦超声HIFU的治疗目前也主要集中在乳腺癌、前列腺癌等皮下瘤的可视化组织消融方面，HIFU的其他应用领域还未被开发。
发明内容
本发明的目的：
1)提供一种HIFU控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统，该递药系统通过纳米粒表面修饰的短肽(Angiopep-2)对血脑屏障以及脑胶质瘤细胞的双重靶向作用，来增强药物阿霉素(Dox)在脑胶质瘤细胞内的蓄积，再通过高强度聚焦超声(HIFU)诱导药物阿霉素(Dox)在脑胶质瘤部位瞬时充分释放，从而显著提高对脑胶质瘤的治疗效果。
2)提供构建该HIFU控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统的制备方法及用途。
本发明的目的是这样实现的：
一种HIFU控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统，特点是，该递药系统包括靶向分子、药物、发泡剂和纳米载体，所述靶向分子为Angiopep-2短肽，药物为阿霉素Dox，发泡剂为全氟辛烷PFOB，纳米载体为末端羧基修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA-COOH、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺DSPE-PEG-MAL三者的混合物；所述靶向分子Angiopep-2通过共价连接的方式与纳米载体表面的聚乙二醇相连；所述药物和发泡剂以包裹的方式共包载在纳米载体内；所述发泡剂在HIFU作用下瞬时汽化，产生的辐向力使纳米载体迅速崩解，加速释药；所述靶向分子的序列为5’-Tyr-Glu-Glu-Thr-Lys-Phe-Asn-Asn-Arg-Lys-Gly-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Phe-Phe-Thr-3’；所述纳米载体中PLGA-COOH与DSPE-PEG、DSPE-PEG-MAL之和的质量比为4:1～5:1；所述纳米载体中DSPE-PEG与DSPE-PEG-MAL的摩尔比为15:1～20:1；所述递药系统即Angiopep-2修饰的载阿霉素/发泡剂的纳米粒ANP-D/P的粒径为35～45nm，粒径分散度为0.1～0.2。
一种上述HIFU控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统的制备方法，该方法包括以下具体步骤：
步骤1：取末端羧基修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA-COOH、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺DSPE-PEG-MAL溶于丙酮，再加入阿霉素Dox甲醇溶液和全氟辛烷PFOB并混合均匀；其中PLGA-COOH与DSPE-PEG、DSPE-PEG-MAL之和的质量比为4:1～5:1；DSPE-PEG与DSPE-PEG-MAL的摩尔比为15:1～20:1；Dox与PLGA-COOH、DSPE-PEG、DSPE-PEG-MAL之和的质量比为1:100～2:100；PFOB与PLGA-COOH、DSPE-PEG、DSPE-PEG-MAL之和的质量比为1:100～2:100；PLGA-COOH的分子量为50000～70000；DSPE-PEG的分子量为2000；DSPE-PEG-MAL的分子量为3400；Dox甲醇溶液浓度为5～10mg/mL；PFOB的浓度为15～20mg/mL；丙酮、甲醇、全氟辛烷均为分析纯；
步骤2：将步骤1所得的混合溶液快速注入至Tris-HCl溶液中，其中丙酮与Tris-HCl溶液的体积比为1:1～1:3；Tris-HCl溶液的浓度为10mM，pH为8.0；40℃真空旋转蒸发除去有机溶剂，即可得到Tris-HCl分散的载Dox和PFOB的纳米粒NP-D/P溶液；
步骤3：将步骤2所得纳米粒溶液移至超滤管，2000g离心10min后再加入去离子水重悬，其中截留分子量为20000～50000；重复此步骤2～3次，即可得到去离子水分散的纳米粒NP-D/P溶液；
步骤4：向步骤3所得纳米粒溶液中逐滴加入Angiopep-2短肽水溶液，其中DSPE-PEG-MAL与Angiopep-2的摩尔比为2:1～4:1；25℃、350rpm条件下磁力搅拌2h，即可得到Angiopep-2短肽修饰的纳米粒ANP-D/P溶液；
步骤5：将步骤4所得纳米粒溶液移至超滤管，2000g离心10min后再加入去离子水重悬，其中截留分子量为20000～50000；重复此步骤2～3次，除去未结合的Angiopep-2短肽，即得到纯化后的纳米粒ANP-D/P溶液；
步骤6：将步骤5所得纳米粒溶液真空冷冻干燥，即得到所述的HIFU控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统。
一种权利要求1所述HIFU控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统的用途，该纳米递药系统作为化疗药物，用于对脑胶质瘤的治疗，具体包括以下步骤：
步骤1：静脉注射该递药系统；
步骤2：当该递药系统在脑胶质瘤部位充分蓄积后，即给药后24～48h，在脑胶质瘤部位给予HIFU辐照，诱导药物在肿瘤部位瞬时充分释放。
本发明的HIFU控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统通过以下几方面来发挥作用：
1)本发明所述递药系统具有对血脑屏障(BBB)及脑胶质瘤细胞的双重靶向功能。首先，通过增强药物的血脑屏障穿透效率来提高药物的入脑量，其次，通过对脑胶质瘤细胞的靶向作用进一步地提高药物在脑胶质瘤部位的蓄积，从而达到显著提高脑胶质瘤细胞内药物浓度的目的，进而提高脑胶质瘤的化疗效果。
2)本发明所述递药系统在对脑胶质瘤的靶向递药基础上，通过HIFU辐照诱导药物在脑胶质瘤部位的瞬时充分释放，从而进一步增强对脑胶质瘤的化疗效果。
3)本发明所述递药系统中，HIFU辐照本身所产生的热效应和空穴效应也可以对脑胶质瘤细胞起到诱导凋亡的作用。
4)本发明所述递药系统通过药物的靶向递送以及HIFU控制的药物定点释放这两方面来大大减少药物对正常组织的毒副作用。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
1)本发明递药系统具有较小的粒径(35～45nm)和较好的均一度(PDI＝0.1～0.2)。相比粒径100nm左右的普通纳米递药系统，该递药系统非常适合脑部肿瘤的递药。
2)本发明递药系统具有血脑屏障、脑胶质瘤的双重靶向作用。相比临床中用于脑胶质瘤的非靶向药物以及普通非靶向纳米递药系统，能够显著增加药物在脑胶质瘤部位的蓄积，从而提高脑胶质瘤的化疗效，同时有效降低药物对正常组织的毒副作用。
3)本发明递药系统具有定点释药的显著优势。在显著增加药物在脑胶质瘤部位蓄积的基础上，给予高强度聚焦超声(HIFU)辐照，可以使得药物在脑胶质瘤部位瞬时充分释放，从而进一步提高脑胶质瘤的化疗效果，同时也从另一方面有效降低药物对正常组织的毒副作用。而没有定点控释的普通递药系统在肿瘤部位的释药往往不充分，化疗效果并不理想，普通递药系统一般通过提高药物的长循环能力来提高化疗效果，但这往往会增加药物对正常组织毒副作用。
4)本发明递药系统首次将药物的靶向递送与HIFU诱导的定点释药有效地结合在一起并用于脑胶质瘤的治疗。本发明递药系统中给予的HIFU辐照，其产生的热效应和空穴效应本身也可以对脑胶质瘤细胞起到诱导凋亡的作用，可以协同药物的化疗作用进一步提高脑胶质瘤的治疗效果。相比单一的靶向递送或HIFU热疗，该递药系统取得了极佳的治疗效果。
5)本发明递药系统通过药物的靶向递送以及HIFU控制的定点释药这两方面来减少药物对正常组织的毒副作用。相比单一的靶向递送或定点控释，该递药系统可以显著降低药物对正常组织的毒副作用。
附图说明
图1为本发明递药系统的制备及释药流程图；
图2为本发明中不同纳米粒NP，NP-D/P，ANP和ANP-D/P的粒径对比图；
图3为本发明中不同纳米粒NP，NP-D/P，ANP和ANP-D/P的表面电势对比图；
图4为本发明纳米粒ANP-D/P稳定性测定；
图5为本发明纳米粒ANP-D/P在有无HIFU辐照条件下的表面形态对比图；
图6为本发明纳米粒ANP-D/P在不同HIFU辐照条件下的粒径变化对比图；
图7为本发明纳米粒ANP-D/P在不同HIFU辐照条件下的表面电势变化对比图；
图8为有无HIFU辐照对本发明纳米粒ANP-D/P药物释放的影响；
图9为U87MG细胞对本发明中不同纳米粒的摄取---共聚焦显微镜荧光定性对比图；
图10为U87MG细胞对本发明中不同纳米粒的摄取---流式细胞荧光定性对比图；
图11为U87MG细胞对本发明中不同纳米粒的摄取---流式细胞荧光定量对比图；
图12为本发明中不同纳米粒的跨血脑屏障转运量对比图；
图13为本发明中不同纳米粒的跨血脑屏障渗透速率对比图；
图14为本发明中不同纳米粒的体内靶向性---荷瘤小鼠体内荧光成像对比图；
图15为本发明中不同纳米粒的体内靶向性---荷瘤小鼠脑部离体荧光成像对比图；
图16为本发明中不同纳米粒的体内靶向性---荷瘤小鼠脑部荧光定量对比图；
图17为本发明中不同治疗组荷瘤小鼠的生存曲线对比图；
图18为本发明中不同治疗组荷瘤小鼠的脑胶质瘤切片H&E染色对比图；
图19为本发明中不同治疗组荷瘤小鼠的脑胶质瘤切片TUNEL染色对比图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面将结合附图及具体实施例来进一步阐述本发明，但本发明内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
纳米粒NP的制备：
1)纳米粒NP采用改良的纳米沉淀法制备，准确称量末端羧基修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA-COOH(分子量50000,16mg)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG(分子量2000,3.6mg,1.8μmol)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺DSPE-PEG-MAL(分子量2000,0.4mg,0.1μmol)，溶于1mL的丙酮并充分混匀。再将该溶有高分子聚合物的丙酮溶液快速注入至2mL的Tris-HCl(10mM,pH 8.0)溶液中，40℃真空旋转蒸发除去丙酮，即得到Tris-HCl分散的纳米粒NP溶液。
2)将步骤1)所得的溶液加入4mL超滤管(截留分子量30000)，2000g离心10min后，加入去离子水重悬至4mL，重复此步骤3次，即得到去离子水分散的纳米粒NP溶液。
实施例2
Angiopep-2修饰的纳米粒ANP的制备：
1)向实施例1所得的纳米粒NP溶液中逐滴加入100μL的Angiopep-2短肽水溶液(1mg/L)，25℃、350rpm磁力搅拌2h，即得到Angiopep-2短肽修饰的纳米粒ANP溶液。
2)将步骤2)所得的纳米粒ANP溶液加入4mL超滤管(截留分子量30000)，2000g离心10min后，加入去离子水重悬至4mL，重复此步骤3次，除去未结合的Angiopep-2短肽。
实施例3
Angiopep-2修饰的载阿霉素Dox、阿霉素/全氟辛烷(Dox/PFOB)、荧光素DiR、荧光素DiD的纳米粒ANP-D、ANP-D/P、ANP-DiR、ANP-DiD的制备：
1)准确称量末端羧基修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA-COOH(分子量50000,16mg)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG(分子量2000,3.6mg,1.8μmol)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺DSPE-PEG-MAL(分子量2000,0.4mg,0.1μmol)，溶于1mL的丙酮并充分混匀后，再加入60μL阿霉素Dox甲醇溶液(6.66mg/mL)，或60μL阿霉素Dox甲醇溶液(6.66mg/mL)与10μL全氟辛烷PFOB(19.23mg/mL)的混合溶液，或2μL荧光素DiR溶液(1mg/mL)，或2μL荧光素DiD溶液(1mg/mL)。接着再将该高分子聚合物、药物、发泡剂、荧光素的混合溶液快速注入至2mL的Tris-HCl(10mM,pH 8.0)溶液中，40℃真空旋转蒸发除去有机溶剂，即可得到Tris-HCl分散的载阿霉素Dox、阿霉素/全氟辛烷(Dox/PFOB)、荧光素DiR、荧光素DiD的纳米粒NP-D、NP-D/P、NP-DiR、NP-DiD溶液。
2)向步骤1)所得的溶液中分别加入4mL超滤管(截留分子量30000)，2000g离心10min后，加入去离子水重悬至4mL，重复此步骤3次，即可得到去离子水分散的载阿霉素Dox、阿霉素/全氟辛烷(Dox/PFOB)、荧光素DiR、荧光素DiD的纳米粒NP-D、NP-D/P、NP-DiR、NP-DiD溶液。
3)向步骤2)所得的溶液中分别逐滴加入100μL的Angiopep-2短肽水溶液(1mg/L)，25℃、350rpm磁力搅拌2h，即可得到Angiopep-2短肽修饰的载阿霉素Dox、阿霉素/全氟辛烷(Dox/PFOB)、荧光素DiR、荧光素DiD的纳米粒ANP-D、ANP-D/P、ANP-DiR、ANP-DiD溶液。
4)将步骤3)所得的溶液分别加入4mL超滤管(截留分子量30000)，2000g离心10min后，加入去离子水重悬至4mL，重复此步骤3次，除去未结合的Angiopep-2短肽，即可得到纯化后的纳米粒ANP-D、ANP-D/P、ANP-DiR、ANP-DiD溶液。
如图1所示，①为载阿霉素/全氟辛烷的纳米粒NP-D/P；②为Angiopep-2修饰的载阿霉素/全氟辛烷的纳米粒ANP-D/P。③为在HIFU辐照下的Angiopep-2修饰的载阿霉素/全氟辛烷的纳米粒ANP-D/P。图中①→②代表本发明递药系统——纳米粒ANP-D/P的制备过程。
实施例4
1)纳米粒ANP-D/P中Dox包封率的测定：实施例3所得的ANP-D/P溶液，50000g超速离心1h后，用紫外分光光度计测定上清中的阿霉素Dox含量。ANP-D/P中Dox的包封率根据以下公式算得：本实验ANP-D/P中Dox的包封率为91％。
2)纳米粒ANP-D/P中Dox载药量的测定：实施例3所得的ANP-D/P溶液，50000g超速离心1h后，用紫外分光光度计测定上清中的阿霉素Dox含量。ANP-D/P中Dox的载药量根据以下公式算得：本实验ANP-D/P中Dox的载药量为1.8％。
3)纳米粒ANP-D/P中Angiopep-2接枝率的测定：将实施例3中步骤3)4mL超滤管收集的未结合的Angiopep-2短肽，用高效液相法(HPLC)测定其含量。其中流动相A为含0.1％三氟乙酸的去离子水溶液，流动相B为含0.09％三氟乙酸的乙腈溶液。Angiopep-2短肽的接枝率根据以下公式算得：本实验中Angiopep-2的接枝率为89.0％。
实施例5
纳米粒的粒径、电位测定：
分别制备纳米粒NP，NP-D/P，ANP和ANP-D/P溶液并稀释至1mg/mL，震荡混匀后，用马尔文激光粒度测定仪测定其粒径、粒径分布以及表面电势。如图2所示，A、B、C、D分别代表NP，ANP，NP-D/P和ANP-D/P，其粒径大小分别为33nm，39nm，36nm和41nm，且测得NP，ANP，NP-D/P和ANP-D/P的粒径分布PDI分别为0.166，0.187，0.181和0.161。由图2可知，纳米粒载药物及发泡剂后、连接Angiopep-2后，其粒径均有增加，尽管如此，ANP-D/P的粒径也仅为41nm，相比较常见的100nm左右的纳米粒，该纳米粒更容易通过血脑屏障，更适合脑肿瘤的递药。另外，各种纳米粒的粒径分布均在0.1～0.2之间，说明该方法制备的纳米粒大小非常均一。如图3所示，A、B、C、D分别代表NP，ANP，NP-D/P和ANP-D/P，其的表面电势分别为-48mV，-20mV，-49mV和-20.7mV。由图3可知，表面连接Angiopep-2后纳米粒的表面电势显著升高，较为中性的电势具有更高的稳定性也更有利于肿瘤细胞对纳米粒的摄取。
实施例6
纳米粒ANP-D/P的稳定性测定：
将制备的纳米粒ANP-D/P溶液并稀释至1mg/mL，按照实施例5的方法分别监测其一周内的粒径及表面电势变化情况。如图4所示，D-1和D-2分别代表ANP-D/P一周内的粒径变化和表面电势变化，由图4可看出ANP-D/P在一周内粒径及表面电势几乎没有太大变化，说明ANP-D/P具有良好的稳定性。
实施例7
纳米粒ANP-D/P在有无HIFU辐照条件下的表面形态鉴定：
将制备的纳米粒ANP-D/P溶液并稀释至0.1mg/mL并分成2份，一份为无HIFU辐照组，另一份为接受8.5W，5min的HIFU辐照组，之后进行2％磷钨酸染色，最后用透射电镜观察两组纳米粒的表面形态。如图5所示，D组代表无HIFU辐照下的ANP-D/P纳米粒；H组代表接受HIFU辐照后的ANP-D/P纳米粒；图中标尺为50nm。由图5可以看出，D组中的ANP-D/P纳米粒均匀且表面圆整，粒径约为40nm；而H组中的ANP-D/P纳米粒在接受HIFU辐照后粒径显著增大，结构崩塌，崩解为两个甚至多个小纳米粒。
实施例8
纳米粒ANP-D/P在不同HIFU辐照条件下的粒径及表面电势变化监测：
将5mg/mL的纳米粒ANP-D/P样品溶液平均分成5份，分别接受不同条件的HIFU辐照。对照组不接受HIFU辐照，其余4组分别接受8.5W，5min；8.5W，10min；10.5W，5min；10.5W，10min的HIFU辐照。之后5组样品震荡混匀，并用马尔文激光粒度测定仪测定其粒径和表面电势。如图6所示，D、H-1、H-2、H-3、H-4分别代表对照组、(8.5W，5min)组、(8.5W，10min)组、(10.5W，5min)组和(10.5W，10min)组，其粒径大小分别为39nm、69nm、78nm、104nm和171nm。由图6可以看出，经过HIFU辐照后的纳米粒ANP-D/P粒径显著变大，且粒径大小分别与HIFU辐照的功率(W)和时间(min)成正比。如图7所示，D、H-1、H-2、H-3、H-4分别代表对照组、(8.5W，5min)组、(8.5W，10min)组、(10.5W，5min)组和(10.5W，10min)组，其表面电势分别为-20.0mV、-48.0mV、-48.6mV、-50.0mV和-50.7mV。由图7可以看出，经过HIFU辐照后的纳米粒ANP-D/P表面电势显著变小，这是由纳米粒结构崩塌后更多带负电的羧基裸露在纳米粒表面所致。综合图6与图7可以看出，HIFU辐照有助于纳米粒ANP-D/P的结构崩解。
实施例9
有无HIFU辐照对纳米粒ANP-D/P药物释放的影响：
将新制备好的5mg/mL的纳米粒ANP-D/P样品溶液平均分成2份，一份用于监测无HIFU辐照条件下纳米粒ANP-D/P的药物释放情况，另一份于60min时接受10.5W，10min的HIFU辐照。两组分别于0min、60min、HIFU辐照后的2min、5min、10min用紫外分光光度计测定样品溶液中阿霉素Dox的含量。如图8所示，D和H-4分别代表对照组和(10.5W，10min)组，由图8可以看出，在无HIFU辐照情况下即0min～59min内，纳米粒ANP-D/P药物释放缓慢，但H-4组在接受HIFU辐照后2min、5min、10min内纳米粒ANP-D/P的药物释放分别达到47％、65％、76％，而未接受HIFU辐照的D组70min内的药物释放仅为2.5％。显而易见，HIFU辐照极大的加速了纳米粒ANP-D/P药物释放。如图1中③所示，即为本发明递药系统——纳米粒ANP-D/P的释药机制，在HIFU辐照下，发泡剂PFOB瞬时汽化使得纳米粒ANP-D/P崩解，加速药物Dox的释放。
实施例10
纳米粒ANP-D/P对脑胶质瘤U87细胞的体外靶向性实验(共聚焦定性实验)：
将脑胶质瘤U87MG细胞以2×104cell/mL的密度接种于24孔细胞培养板，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下用完全培养基(DMEM+10％FBS+1％S/P)培养细胞24h，再向每孔分别加入600μmL含药物Lip-D、NP-D、ANP-D、ANP-D/P或ANP-D/P+A(Dox含量为50μg/mL)的新鲜培养基继续培养0.5h，PBS清洗细胞2次除去多余药物后，用4％多聚甲醛固定15min，DAPI染色5min。最后通过激光共聚焦显微镜观察U87MG细胞对不同药物的摄取情况。其中，ANP-D/P+A为药物ANP-D/P与200μg的Angiopep-2的混合物。如图9所示，C代表蓝色荧光(DAPI)通道，R代表红色荧光(Dox)通道，M代表蓝色荧光(DAPI)通道与红色荧光(Dox)通道的叠加；U代表U87MG细胞空白对照组，L代表Lip-D给药组，A代表NP-D给药组，B代表ANP-D给药组，D代表ANP-D/P给药组，E代表ANP-D/P+A给药组；图中标尺代表100μm。由图9可看出，B组和D组荧光强度明显高于A组和E组，且远高于L组和U组，表明相比NP-D，连接Angiopep-2后的ANP-D与ANP-D/P对U87MG细胞具有显著增强的靶向性；而E组与A组荧光强度并无显著性差异，也同时说明ANP-D与ANP-D/P是通过Angiopep-2与U87MG表面高表达的LRP受体结合后在胞吞作用下进入U87MG细胞内，而不是非特异性摄取。该实验也同时证明了相比临床用的Lip-D，ANP-D/P对脑胶质瘤U87MG细胞具有显著增强的体外靶向性。
实施例11
纳米粒ANP-D/P对脑胶质瘤U87细胞的体外靶向性实验(流式细胞仪定量实验)：
将脑胶质瘤U87MG细胞以2×104cell/mL的密度接种于24孔细胞培养板，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下用完全培养基(DMEM+10％FBS+1％S/P)培养细胞24h，再向每孔分别加入600μmL含药物Lip-D、NP-D、ANP-D、ANP-D/P或ANP-D/P+A(Dox含量为50μg/mL)的新鲜培养基继续培养0.5h，PBS洗去多余药物，用胰蛋白酶-EDTA(0.25％)消化细胞，1000rpm离心4min后用PBS重悬细胞，最后由流式细胞仪检测细胞摄取情况。其中，ANP-D/P+A为药物ANP-D/P与200μg的Angiopep-2的混合物。如图10为U87MG细胞对不同药物摄取的流式结果，图11为图10中的荧光定量结果。如图10、11所示，U代表U87MG细胞空白对照组，L代表Lip-D给药组，A代表NP-D给药组，B代表ANP-D给药组，D代表ANP-D/P给药组，E代表ANP-D/P+A给药组。由图10、11可以看出，B组和D组荧光强度均远高于U、L组，且B组和D组的荧光强度分别是A组的3.6和3.8倍，而E组与A组荧光强度并无显著性差异，这与图9中细胞摄取的共聚焦定性结果一致，再次证明相比NP-D，Angiopep-2修饰后的ANP-D和ANP-D/P显著增强了对U87MG细胞的靶向性。其中，图11中***代表配对T检验P＜0.001，****代表配对T检验P＜0.0001，表明两组具有显著性差异。
实施例12
纳米粒ANP-D/P跨血脑屏障BBB转运实验：
将BCEC细胞以5×104cell/cm2的密度接种于孔径为3μm的transwell细胞培养小室内，在相应的24孔板中每孔加入1mL完全培养基(DMEM+10％FBS+1％S/P)，于37℃、5％CO2、饱和湿度下培养细胞并隔天换液，用Millicell ERS电阻仪监测细胞融合情况，当电阻值TEER超过200Ω时BCEC构建的BBB单层细胞模型可用于下一步实验。向transwell每个小室中加入400μL浓度为2mg/mL的载DiD的NP-D/P或ANP-D/P药物，于1、2、3、4、6小时分别从每个小室下方对应的孔板中取出100μL样品并补充等体积新鲜完全培养基，取出样品中的纳米的粒浓度通过酶标仪进行定量。其中DiD的激发波长/发射波长分别为644/663。最后计算两种药物的透BBB的转运量和渗透速率，其中渗透速率根据以下公式算得：如图12、13所示，C和D分别代表NP-D/P和ANP-D/P组。由图12可以看出，D组药物透过BBB的量显著高于C组且药物转运量与时间成正比，表明Angiopep-2修饰后的ANP-D/P相比NP-D/P具有显著增强的BBB靶向性，故透过BBB的药物量显著提高。由图13可以看出，D组药物BBB的渗透速率量显著高于C组，也说明Angiopep-2修饰后的ANP-D/P相比NP-D/P具有显著更强的BBB穿透能力。其中，图13中****代表配对T检验P＜0.0001，表明两组具有显著性差异。综合图12、13可以证明Angiopep-2的修饰可以显著提高纳米粒ANP-D/P对BBB的体外靶向能力。
实施例13
纳米粒ANP-D/P的体内靶向性---荷瘤小鼠活体成像实验：
U87MG原位脑胶质瘤荷瘤鼠，接种20天后，随机分成3组，每组3只，分别尾静脉注射200μL载DiR的药物NP-D、ANP-D或ANP-D/P(DiR为2μg)。分别于6h、12h、24h、48h由小动物活体成像仪测定小鼠体内的DiR荧光信号。48h后将每组小鼠PBS心脏灌流，取出脑组织用于脑部离体荧光成像，之后匀浆处理并用酶标仪测定其DiR含量。如图14、15、16所示，A、B、D分别代表NP-D、ANP-D和ANP-D/P组。由图14中6h、12h、24h、48h可以看出四个时间段B、D组小鼠脑部荧光信号均高于A组；图15为图14各组48h时的离体脑组织，由图15可以看出B、D组脑胶质瘤部位的荧光强度明显高于A组；图16为图15中脑组织的荧光定量结果，定量结果显示B、D组的荧光强度分别是A组的9.1和13.4倍。其中，图16中***代表配对T检验P＜0.001，表明两组具有显著性差异。综合图14、15、16可以看出相比A组，B、D组药物具有良好的体内脑胶质瘤靶向性，即Angiopep-2的修饰显著提高了ANP-D和ANP-D/P的体内脑胶质瘤靶向性。
实施例14
纳米粒ANP-D/P的体内药效学---平均生存期监测实验：
U87MG原位脑胶质瘤荷瘤鼠，随机分成6组(saline、Lip-D、NP-D、ANP-D、ANP-D/P、ANP-D/P H+)，每组6只，分别于细胞接种后的第2、5、8、11天，分别尾静脉注射100μL的saline、Lip-D、NP-D、ANP-D、ANP-D/P或ANP-D/P(Dox药物剂量：每公斤动物体重给予2mg的Dox)。最后一次给药24h后对ANP-D/P H+组荷瘤鼠给予10.5W、60s(间隔3s)的HIFU辐照治疗。每天监测动物死亡情况并绘制Kaplan-Meier生存曲线。如图17所示，U、L、A、B、D、H分别代表saline对照组以及Lip-D、NP-D、ANP-D、ANP-D/P、ANP-D/P H+治疗组。由图17可知，U、L、A、B、D、H各组平均生存时间为17、21.5、23、35、37.5、56天；可以看出，相比L、A治疗组，B、D两治疗组明显延长了荷瘤鼠的生存期，表明Angiopep-2的修饰显著提高了药物对脑胶质瘤的靶向性，进而提高了脑胶质瘤的治疗效果；而H组在B、D两组基础上又进一步地显著延长了荷瘤鼠的生存期，表明H组在提高药物靶向性的基础上，通过HIFU诱导药物的加速释放使得脑胶质瘤的治疗效果有了进一步地显著提高。
实施例15
纳米粒ANP-D/P的体内药效学---脑胶质瘤病理切片实验：
U87MG原位脑胶质瘤荷瘤鼠，随机分成6组(saline、Lip-D、NP-D、ANP-D、ANP-D/P、ANP-D/P H+)，每组6只，分别于细胞接种后第2、5、8、11天，尾静脉给药100μL(Dox药物剂量：每公斤动物体重给予2mg的Dox)。最后一次给药24h后对ANP-D/P H+组荷瘤鼠给予10.5W、60s(间隔3s)的HIFU辐照治疗。
细胞接种后第15天，对荷瘤鼠进行PBS心脏灌流，取出脑组织并用4％多聚甲醛固定48h，每组中3只为一组，分别做石蜡、冰冻切片，分别用于H&E、TUNEL染色分析。如图18为各组脑胶质瘤石蜡切片的H&E染色结果，图19为脑胶质瘤冰冻切片的TUNEL染色结果，图18、19中的U、L、A、B、D、H分别代表saline对照组以及Lip-D、NP-D、ANP-D、ANP-D/P、ANP-D/P H+治疗组。图19中的细胞凋亡表现为细胞核破碎，而图19中虚线及箭头指向区域为脑胶质瘤组织，荧光点为凋亡细胞阳性信号。由图18、19可以看出，对照组中脑胶质瘤细胞未出现凋亡，而L、A、B、D治疗组中均出现不同程度的细胞凋亡。其中，B、D治疗组中肿瘤细胞凋亡比例显著高于L、A治疗组，表明Angiopep-2的修饰提高了ANP-D及ANP-D/P的体内脑胶质瘤靶向性，进而提高了对脑胶质瘤细胞抑制效果。而H组中的契型空白原为脑胶质瘤组织，在药物ANP-D/P治疗的基础上给予HIFU辐照，诱导ANP-D/P中药物Dox瞬时充分释放，加之HIFU辐照本身具有的空穴效应及热效应，使得原有的脑胶质瘤细胞基本全部凋亡或被消融，呈现出其余治疗组所无法达到的极佳的治疗效果。综合图18、19可得出相较NP-D、Lip-D，ANP-D和ANP-D/P能更有效地诱导脑胶质瘤细胞凋亡，而在此基础上的HIFU辐照治疗能进一步极大地提高脑胶质瘤的治疗效果。

Claims (3)

1.一种HIFU控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统，其特征在于，该递药系统包括靶向分子、药物、发泡剂和纳米载体，所述靶向分子为Angiopep-2短肽，药物为阿霉素Dox，发泡剂为全氟辛烷PFOB，纳米载体为末端羧基修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA-COOH、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺DSPE-PEG-MAL三者的混合物；所述靶向分子Angiopep-2通过共价连接的方式与纳米载体表面的聚乙二醇相连；所述药物和发泡剂以包裹的方式共包载在纳米载体内；所述发泡剂在HIFU作用下瞬时汽化，产生的辐向力使纳米载体迅速崩解，加速释药；所述靶向分子的序列为5’ -Tyr-Glu-Glu-Thr-Lys-Phe-Asn-Asn-Arg-Lys-Gly-Arg-Ser-Gly-Gly-Tyr-Phe-Phe-Thr-3’；所述纳米载体中PLGA-COOH与DSPE-PEG、DSPE-PEG-MAL之和的质量比为4:1~5:1；所述纳米载体中DSPE-PEG与DSPE-PEG-MAL的摩尔比为15:1~20:1；所述递药系统即Angiopep-2修饰的载阿霉素/发泡剂的纳米粒ANP-D/P的粒径为35~45 nm，粒径分散度为0.1~0.2。
2.一种权利要求1所述HIFU控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统的制备方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：
步骤1：取末端羧基修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA-COOH、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇DSPE-PEG和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺DSPE-PEG-MAL溶于丙酮，再加入阿霉素Dox甲醇溶液和全氟辛烷PFOB并混合均匀；其中PLGA-COOH与DSPE-PEG、DSPE-PEG-MAL之和的质量比为4:1~5:1；DSPE-PEG与DSPE-PEG-MAL的摩尔比为15:1~20:1；Dox与PLGA-COOH、DSPE-PEG、DSPE-PEG-MAL之和的质量比为1:100~2:100；PFOB与PLGA-COOH、DSPE-PEG、DSPE-PEG-MAL之和的质量比为1:100~2:100；PLGA-COOH的分子量为50000~70000；DSPE-PEG的分子量为2000；DSPE-PEG-MAL的分子量为3400；Dox甲醇溶液浓度为5~10mg/mL；PFOB的浓度为15~20 mg/mL；丙酮、甲醇、全氟辛烷均为分析纯；
步骤2：将步骤1所得的混合溶液快速注入至Tris-HCl溶液中，其中丙酮与Tris-HCl 溶液的体积比为1:1~1:3；Tris-HCl溶液的浓度为10 mM，pH为8.0；40℃真空旋转蒸发除去有机溶剂，即可得到Tris-HCl分散的载Dox和PFOB的纳米粒NP-D/P溶液；
步骤3：将步骤2所得纳米粒溶液移至超滤管，2000 g离心10 min后再加入去离子水重悬，其中截留分子量为20000~50000；重复此步骤2~3次，即可得到去离子水分散的纳米粒NP-D/P溶液；
步骤4：向步骤3所得纳米粒溶液中逐滴加入Angiopep-2短肽水溶液，其中DSPE-PEG-MAL与Angiopep-2的摩尔比为2:1~4:1；25℃、350 rpm条件下磁力搅拌2 h，即可得到Angiopep-2短肽修饰的纳米粒ANP-D/P溶液；
步骤5：将步骤4所得纳米粒溶液移至超滤管，2000 g离心10 min后再加入去离子水重悬，其中截留分子量为20000~50000；重复此步骤2~3次，除去未结合的Angiopep-2短肽，即得到纯化后的纳米粒ANP-D/P溶液；
步骤6：将步骤5所得纳米粒溶液真空冷冻干燥，即得到所述的HIFU控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统。
3.一种权利要求1所述HIFU控释的脑胶质瘤靶向纳米递药系统的用途，其特征在于，该纳米递药系统作为化疗药物，用于对脑胶质瘤的治疗，具体包括以下步骤：
步骤1：静脉注射该递药系统；
步骤2：当该递药系统在脑胶质瘤部位充分蓄积后，即给药后24~48 h，在脑胶质瘤部位给予HIFU辐照，诱导药物在肿瘤部位瞬时充分释放。
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