CN109517836A - 短n导入片段在烟草中的应用及其筛选和估算方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了短N导入片段在烟草中的应用及其筛选和估算方法，所述短N导入片段与Coker176类型烟草的N导入片段相比减少了N基因右端至少0.93Mb、优选至少1.56Mb的累赘基因组分，包含该短N导入片段的烟草植株高抗TMV，且无明显产量和质量劣势，并且在产量、落黄和烘烤等性状得到了最大程度的改善。本发明提供的估算包含短N导入片段的烟草植株中缺失的累赘基因组分数量的方法，能够快速准确地从多个短N导入片段的植株中筛选出N导入片段最短的植株，挑选一个N导入片段最短的植株进入育种程序，可显著减少育种工作量、提高育种效率。

Description

短N导入片段在烟草中的应用及其筛选和估算方法

技术领域

本发明涉及烟草育种技术领域，特别涉及短N导入片段在烟草中的应用及其筛选和估算方法。

背景技术

烟草花叶病毒病(Tobacco mosaic virus,TMV)是我国烟草上的重要病害，每年造成的损失位列十大烟草侵染性病害名单前列。种植TMV抗病品种依然是防控TMV最根本同时也是最经济有效的手段。抗病品种的推广需要抗性高、且无产量和农艺性状劣势的品种。

目前栽培烟草的TMV抗源主要来源于烟草野生种心叶烟(Nicotiana.glutinosa)，其抗性由一个显性单基因(N)控制。N基因的基因组序列大小为6656bp，包括5个外显子和4个内含子，属于TIR-NBS-LRR类型抗病基因。通过一系列的常规杂交和回交转育，N基因的抗性从心叶烟转育至香料烟中，然后转育至烟草品种中。采用杂交育种转育N基因的抗性，实际上是转育包含N基因的野生烟染色体片段(简称为N导入片段)。世界上抗TMV烟草育种利用的几乎都是N导入片段。代表性品种是较早商业化种植的包含N导入片段的抗TMV烟草品种Coker176和Speight H20。与N基因连锁的非目的基因带来产量较低、上部叶落黄较慢等连锁累赘，连锁累赘来源于长度同Coker176的N导入片段上与N基因连锁的非目的基因组分(简称累赘基因组分)。包含长度同Coker176的N导入片段的烟草品种不能满足生产的需要。减少长度同Coker176的N导入片段上与N基因连锁的非目的基因组分，可望减少N导入片段的连锁累赘，育种利用潜力较大。然而常规育种技术难以从大量植株中筛选出包含短N导入片段的染色体交换单株，且难以估算短N导入片段的染色体交换植株缺失的基因组分数量，因此，不能快速评估短N导入片段植株在产量、落黄和烘烤等性状的改善状况。在保留N基因的情况下，短N导入片段植株缺失N导入片段的基因组组分数量越多，与N基因连锁的累赘基因组分缺失越多，短N导入片段植株在产量、落黄和烘烤等性状的改善程度越高，育种应用的前景越好。因此，如何快速准确地从多个短N导入片段的植株中筛选出N导入片段最短的植株，进入育种程序，减少育种工作量、提高育种效率是目前烟草抗TMV育种技术领域亟需解决的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明实施例公开了短N导入片段在烟草中的应用及其筛选方法。具体技术方案如下：

本发明提供了短N导入片段在烟草植株中的应用，所述短N导入片段与Coker176类型烟草的N导入片段相比减少了N基因右端至少0.93Mb、优选至少1.56Mb的累赘基因组分。

在本发明的上下文中，术语“N导入片段”是指包含TMV抗病基因(N基因)的野生烟染色体片段。

术语“短N导入片段”是指N导入片段上与N基因连锁的非目的基因组分(简称累赘基因组分)部分缺失或全部缺失，并保留完整N基因功能的DNA片段。

术语“累赘基因组分”是指N导入片段上包含累赘基因、但不包含N基因的基因组组分。

在本发明的一个实施方案中，将短N导入片段应用在烟草植株中，选自以下的烟草植株：

a)N基因特异分子标记N1N2检测为阳性，且TN5.20引物对、TN5.34引物对和TN5.51引物对检测均为阴性的烟草植株；

b)N基因特异分子标记N1N2检测为阳性，且TN4.99引物对、TN5.20引物对、TN5.34引物对和TN5.51引物对检测均为阴性的烟草植株。

在本发明的具体实施方案中，所述短N导入片段通过染色体交换、基因组编辑、化学诱变或物理诱变的方法获得。

本领域技术人员应理解，获得短N导入片段、或包含短N导入片段的烟草植株的方法包括但不限于，杂交育种方法、化学诱变方法或者物理诱变方法、生物技术的基因组编辑方法。化学诱变的方法包括叠氮化钠、溴化乙锭、甲基磺酸乙酯等诱变剂处理。物理诱变方法包括X-射线、伽马射线、快中子辐射、重离子辐射和紫外线辐射。生物技术的基因组编辑方法包括采用CRISPR/Cas9技术、锌指核酸内切酶(ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)敲除技术等。

在本发明的具体实施方案中，所述烟草植株来源于烤烟、白肋烟、香料烟、晒晾烟和雪茄烟。

本领域技术人员应理解N导入片段长度类型为Coker176类型的普通烟草包括但不限于6349，7402，7915，8100，8211，8212，78-3013，8902-42，B09，Burley21，B22，B49，B64，Banket-A-1，BG4，BYS，CV85，CV87，Coker 86，Coker 51，Coker 176，EMH14，Ergo，ETWM10，GH12，K10，K14，Ky10，Ky12，Ky 41A，Ky14，Ky15，Ky17，Ky171，Ky56，Ky8959，Ky8959(BC4)，Ky9，Ky907(BC4)，Ky908，MS ky17，MBN2，MS Burley21×Ky14，MRS-3，MS B21，MS Ky10，MSKy14XL8，NC3，NC567，NC7，NC86，PVH01，PVH02，PVH05，PVH06，PVH07，PVH08，RGH04，SC71，SC72，TN97，Vamoor48，Virginia 1，Virginia3160，Virginia645，Virginia770，Virginia80，Va 1048，WE-12，WB68，RT32，巴引一号，大白筋2518，辽烟9号，辽烟14号，牡单80-7，牡单81-56，台烟5号，台烟6号，梧桐烟1012，中卫一号，引巴1，云烟202402，521，911，8358，Blue star100，Burley mammoth ky16，Burley21，C6160，CCC-h，CCC-L，Coker51，Ex12，Gen164，Gen224，Gr38a，Havana 425，Havana 426，Havana 503b，Havanan 503，Holmesbreeding line-1，KHD926，KY165，KY21，KY22，KY35，KY8654，lancaster seed，M-1，Massck-1，MD A30，MD B100，MD40，MD402，Metacomet，MRS-1，MRS-3，NC102，NC297，NC-BMR 90，NIC112，NIC 112B(PL10)，NIC 112b(PL11)，NIC 112C-G(PL271)，NIC 112C-G(PL37)，NIC117D-1B，OS 802，Poquonock，Southern beauty，Vamorr48，WB68。

本领域技术人员应理解短N导入片段可以应用于烟草属的常见烟草品种，包括但不限于K326，云烟87，云烟97，云烟85，云烟116，云烟121，NC89，中烟100，红花大金元，翠碧1号。

本发明还提供了一种包含短N导入片段的烟草植株的筛选方法，其包括以下步骤：

a)利用N导入片段纯合的烟草植株与基因型为nn的烟草植株杂交，获得基因型为Nn的F1烟草植株，再将F1烟草植株与基因型为nn的烟草植株杂交，获得用于筛选短N导入片段的群体材料；

b)在步骤a)获得的群体材料的苗期接种TMV，在群体材料中筛选出表现枯斑的Nn基因型植株；

c)采用TN5.20引物对、TN5.34引物对、TN5.51引物对和N基因特异分子标记N1N2对步骤b)筛选出的Nn基因型植株进行基因型分型，筛选出N基因特异分子标记N1N2检测为阳性且TN5.20引物对、TN5.34引物对和TN5.51引物对检测均为阴性的植株。

在一个优选的实施方案中，上述步骤(c)中，采用TN4.99引物对、TN5.20引物对、TN5.34引物对、TN5.51引物对和N基因特异分子标记N1N2对步骤b)筛选出的Nn基因型植株进行基因型分型，筛选出N基因特异分子标记N1N2检测为阳性且TN4.99引物对、TN5.20引物对、TN5.34引物对和TN5.51引物对检测均为阴性的植株。

本发明所采用的引物对的序列总结于下表1中。

本领域技术人员熟知，在上述SEQ ID NO.3-6所示序列中，可在其5’端或3’端分别增加1～30个碱基，所增加的碱基类型可根据烟草基因组DNA上与SEQ ID NO.3-6相匹配区域的碱基类型并依据碱基配对原则来确定，由此得到的引物对与SEQ ID NO.3-6的扩增产物基本相同(上游和下游引物之间的DNA序列相同)。因此，上述在SEQ ID NO.3-6的5’端或3’端分别增加1～30个碱基并能扩增得到基本相同DNA片段的引物对，均包括在本发明的引物对中。在本发明具体的实施方式中，本发明的引物对优选为SEQ ID NO.3-6所示序列。

本发明还提供了估算包含短N导入片段的烟草植株中缺失的累赘基因组分数量的分子标记，所述分子标记的序列包括SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明还提供了估算包含短N导入片段的烟草植株中缺失的累赘基因组分数量的引物对，所述引物对包括TN5.20引物对或TN4.99引物对。

本发明还提供了估算包含短N导入片段的烟草植株中缺失的累赘基因组分数量的方法，其包括，采用引物对TN5.20通过PCR扩增检测序列为SEQ ID NO.1的分子标记，采用引物对TN4.99通过PCR扩增检测序列为SEQ ID NO.2的分子标记。

与N基因连锁的非目的基因组分，即累赘基因组分通过分子标记检测确定，所述分子标记为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列所示。如果这两个分子标记检测为阴性，则该植株缺失了该分子标记对应的基因组分。

本发明的分子标记序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)是通过以下技术方案获得的。利用参考基因组学的方法，以及已测序的含N基因烟草品种TN90基因组[Sierro,N.,Battey,J.N.,Ouadi,S.,Bakaher,N.,Bovet,L.,Willig,A.,Goepfert,S.,Peitsch,M.C.and Ivanov,N.V.(2014)The tobacco genome SEQuence and its comparison withthose of tomato and potato.Nat.Commun.,5,doi:10.1038/ncomms4833]。利用烟草抗TMV的N基因序列(Genbank登录号U15605.1)，比对番茄基因组(http://solgenomics.net/)。烟草N基因匹配至番茄基因Solyc11g011350.1.1，该基因位于番茄染色体Chr11:4,391,578..4,397,668处。根据番茄N基因同源体所在11号染色体4.39Mb右侧1.5M周围的低拷贝基因，采用BLAST方法调取TN90基因组中对应的基因序列(番茄的基因在TN90中有两个拷贝)，将TN90中的基因序列分别与野生祖先种N.sylvestris和N.tomensformis基因组(http://solgenomics.net/)进行blastn比对，选取比对identity值最高的两个结果(TN90的同一位点的两个拷贝)。根据TN90的同一位点的两个拷贝与野生祖先种N.sylvestris和N.tomensformis比对identity值判断该拷贝是否来自心叶烟。若同一位点的两个拷贝在野生祖先种基因组比对匹配最好值均低于或等于95％，即该拷贝为来自心叶烟的导入片段，从而得知来自心叶烟的导入片段替代了普通烟草基因组的片段。若比对的identity小于95％的序列为来自心叶烟的渐渗片段，根据在TN90基因组数据库中调取的序列，设计TN90特异引物。在Coker176，心叶烟，Samsun NN，SR1(不含N)中扩增，心叶烟与不含N基因普通烟草相比的特异条带为N位点渐渗片段的特异标记。若比对的identity均大于99％，设计保守引物，在Coker176，心叶烟，Samsun NN，SR1(不含N)中扩增，将扩增片段测序，比对测序结果，设计心叶烟特异的引物，再次在上述品种中扩增，筛选心叶烟特异条带，开发为N导入片段的特异标记。将特异条带的PCR产物回收测序。获得包含本发明的分子标记序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)。

目前，菲利普·莫里斯公司公开了包含N导入片段的TN90的基因组草图数据[Sierro N,Battey J N D,Ouadi S,et al.The tobacco genome sequence and itscomparison with those of tomato and potato.Nature Communications,2014,5(5):3833.]。由于尚未组装为可计算物理距离的染色体，利用N基因序列只能调取到大小为34Kb的一个Scaffold(未列出数据)。而和烟草同属于茄科的番茄公开了染色体基因组数据[Consortium T T G.The tomato genome sequence provides insights into fleshyfruit evolution.Nature,2012,485(7400):635-41.]，该番茄基因组11号染色体包含N基因的同源体，番茄11号染色体上N基因同源体两侧的基因具有明确的物理距离。本发明N导入片段特异分子标记是根据番茄11号染色体上N基因同源体两侧的共线性基因开发的，标记名称中的数字对应于番茄11号染色体上的物理距离。因此，烟草N导入片段的长度以参比番茄11号染色体上标记间的物理距离表示。番茄的基因组大小为0.8Gb，二倍体烟草祖先种的基因组大小约为2.5Gb。烟草二倍体祖先种基因组大小为番茄的3倍左右，烟草N导入片段的长度可按照番茄物理距离的3倍粗略估算。

在本发明的一个实施方案中，所述分子标记为烟草基因组中SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示核苷酸序列的DNA片段，即所包含的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是烟草基因组中的序列，优选的为烟草基因组中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的5’端和/或3’端的上下游序列。本领域技术人员可以理解，只要扩增或者检测包含N导入片段的烟草基因组DNA中的该分子标记，必然能够检测或扩增到含有SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的5’端和/或3’端的上下游序列的长度为适当长度，并不特别限定，例如，满足分子标记的长度小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。

对本领域技术人员而言，可以理解，也可以DNA化学合成的方法得到本发明的分子标记。

在本发明的一个优选的实施方案中，其中PCR的反应体系如下：

PCR反应程序如下：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。

本领域技术人员应该理解，上述PCR体系中各组分对应的浓度均为终浓度，也就是工作浓度。其中，引物的浓度为0.75μmol/L，表示上下游引物的浓度各为0.75μmol/L。

本领域技术人员应该理解扩增产物不仅限于用电泳检测，还可以采用测序的方法来确定。

本发明提供了短N导入片段在烟草植株中的应用，包含短N导入片段的烟草植株的筛选方法，估算包含短N导入片段的烟草植株中缺失的累赘基因组分数量的分子标记、引物对和方法，所述短N导入片段与Coker176类型烟草的N导入片段相比减少了N基因右端至少0.93Mb、优选至少1.56Mb的累赘基因组分，是目前发现的最短的、累赘基因组分最少的N导入片段，包含该短N导入片段的烟草植株高抗TMV，且无明显产量和质量劣势，并且在产量、落黄和烘烤等性状得到了最大程度的改善。与文献已报道的N基因抗性相关分子标记相比，本发明所述分子标记是用于估算短N导入片段植株与N基因连锁的非目的基因组分的减少数量，而不是用于评价N基因介导抗性的有无。通过N导入片段右末端的分子标记辅助选择，可以在分离群体中筛选到缺失右末端分子标记的短N导入片段植株。本发明提供的估算包含短N导入片段的烟草植株中缺失的累赘基因组分数量的方法，能够快速准确地从多个短N导入片段的植株中筛选出N导入片段最短的植株，挑选一个N导入片段最短的植株进入育种程序，可显著减少育种工作量、提高育种效率。本发明可以快速、准确地应用于创制新型抗TMV种质资源、选育烟草抗TMV品种，有利于减少与N基因连锁的累赘。

附图说明

图1为本发明以TN4.99、TN5.20、TN5.34、TN5.51为引物对估算短N导入片段植株的扩增产物电泳检测结果；

其中，从左至右第1、第7、第13、第19泳道为100bp DNA Ladder；第2至第6泳道分别为引物对TN4.99扩增Coker176、2-9D、2-1398、1-1002、5F；8至12泳道分别为引物对TN5.20扩增Coker176、2-9D、2-1398、1-1002、5F；14至18泳道分别为引物对TN5.34扩增Coker176、2-9D、2-1398、1-1002、5F。20至24泳道分别为引物对TN5.51扩增Coker176、2-9D、2-1398、1-1002、5F。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

包含N导入片段的抗TMV烟草材料：Coker176、未包含N导入片段的感TMV材料5F。以上烟草材料均为常见的烟草种质资源，公众可从烟草种质资源保存单位或云南省烟草农业科学研究院获得。

N.tabacum(TN90)、番茄、N.sylvestris、N.tomensformis的参考基因组序列，公众可从http://solgenomics.net/获得。

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒和DNA提取试剂和购自QIAGEN公司。DNA Marker、Taq DNA聚合酶均购自大连宝生物公司。其他化学试剂均为市售产品。。

实施例1植物材料的制备与DNA提取

1、N导入片段的回交转育

种植Coker176(基因型为NN)与5F(基因型为nn)，开花时采集Coker176花粉授粉至去雄的5F花朵上，收获F1种子(基因型为Nn)。种植F1植株，开花时采集F1花粉授粉至去雄的5F花朵上，收获BC1F1种子(基因型为Nn：nn＝1:1)。播种BC1F1，苗期接种TMV，筛选出抗TMV的植株。开花时采集花粉与5F回交，获得回交种子。通过连续回交，获得回交五代(BC5F1)种子。

2、抗TMV植株筛选

采用32孔盘定植的BC5F1回交群体4-5片烟苗，每孔1株，人工接种TMV，接种后5-7d调查接种叶是否产生过敏反应(枯斑)，挑选产生枯斑个体叶片(基因型为Nn)，提取DNA，用于筛选包含短N导入片段的染色体植株。

3、DNA提取

用常规CTAB法分别提取烟草基因组DNA，方法为：

(1)称取烟草叶片100mg左右置于1.5mL离心管中，加液氮用研棒研磨至粉末状；

(2)加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液(Tris-HCl pH为7.5 100mM，EDTA20mM，NaCl 1.4M，CTAB质量百分浓度为2％)，65℃度水浴20分钟后取出冷却；

(3)加入200μl氯仿-异戊醇混合液(氯仿和异戊醇的体积比为24:1)摇匀，4℃、7200rpm离心10min后转移上清至1.5mL EP管；

(4)再次加入200μl氯仿-异戊醇混合液(氯仿和异戊醇的体积比为24:1)摇匀，4℃、7200rpm离心10min；

(5)取出上清置于新的EP管中，加入该上清1/10体积的3M pH5.2醋酸钠，同时加入与该上清等体积的异丙醇，摇匀后4℃、12000rpm离心20min；

(6)弃上清，用体积百分浓度为75％乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲液溶解，放置－20℃保存备用。

实施例2短N导入片段的染色体植株筛选

以感TMV的烟草种质5F为感病对照，以已知包含N基因抗TMV的烟草品种Coker176为抗病对照；以TN5.51引物对，以待检测的烟草基因组DNA、感病对照的烟草基因组DNA、抗病对照的烟草基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测；

PCR反应体系如下：

所述的引物对为TN5.51引物对。

所用试剂均购自宝生物公司。

PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，运行35个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物可以在4℃保存。

PCR产物电泳检测：用质量百分浓度为1.2％的琼脂糖凝胶120V电泳25min，EB染色10min，照胶并记录，结果如图1所示。

N基因特异分子标记N1N2，按照文献的方法(Lewis,R.S.,S.R.Milla,andJ.S.Levin.Molecular and genetic characterization of Nicotiana glutinosaL.chromosome segments in tobacco mosaic virus-resistant tobaccoaccessions.Crop Sci.2005,45:2355–2362.)进行的PCR扩增。

先筛选出烟草材料中TN5.51引物对检测为阴性且N1N2标记检测为阳性的植株，然后估算这些短N导入片段植株缺失基因组分的大小。

采用TN5.51引物对进行扩增，抗病对照有845bp扩增产物，感病对照无845bp扩增产物。表明PCR扩增正常。然后按照如下的标准筛选包含短N导入片段的染色体交换植株：N1N2阳性且无845bp扩增产物，初步判断该植株为包含短N导入片段的染色体交换植株；N1N2阳性且有845bp扩增产物，判断该植株未发生N导入片段的染色体交换。结果表明：从11000株Coker176Х5F的BC5F1植株中，通过接种TMV挑选出5000株表现枯斑的植株。采集表现枯斑植株叶片，提取DNA。采用TN5.51标记和N1N2标记检测，筛选到1-1002、2-1398和2-9D等3个植株为N1N2阳性且无845bp扩增产物。这3个植株为包含短N导入片段的染色体交换植株。

实施例3与N基因连锁的非目的基因组分减少数量检测

以感TMV的烟草种质5F为感病对照，以已知包含N基因抗TMV的烟草品种Coker176为抗病对照；以实施例2获得的N1N2阳性且无845bp扩增产物的3个植株DNA、感病对照的烟草基因组DNA、抗病对照的烟草基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测；

PCR反应体系如下：

所述的引物对为TN5.51引物对、TN5.34引物对、TN5.20引物对和TN4.99引物对。

所用试剂均购自宝生物公司。

PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，运行35个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物可以在4℃保存。

PCR产物电泳检测：用质量百分浓度为1.2％的琼脂糖凝胶120v电泳25min，EB染色10min，照胶并记录，结果如图1所示。

采用TN4.99引物对，TN5.20引物对或TN5.34引物对进行扩增，抗病对照有供试引物对的扩增产物，感病对照无供试引物对的扩增产物。表明PCR扩增正常。然后按照如下的标准估算包含短N导入片段的染色体交换植株缺失的基因组分：若TN5.34引物对检测为阴性，则该植株缺失了TN5.34对应标记至TN5.51对应标记之间的基因组分。若TN5.20引物对和TN5.34引物对检测都为阴性，则该植株缺失了TN5.20对应标记至TN5.51对应标记之间的基因组分。若TN4.99和TN5.20引物对和TN5.34引物对检测都为阴性，则该植株缺失了TN4.99对应标记至TN5.51对应标记之间的基因组分。

结果表明1-1002植株用TN4.99引物对和TN5.20引物对和TN5.34引物对检测为阴性，用N1N2引物对检测为阳性。TN4.99引物对扩增的标记相对番茄11号染色体的物理距离为4.99Mb，TN5.51对应标记相对番茄11号染色体的物理距离为5.51Mb，推算出1-1002植株至少缩短了0.52Mb(相对番茄11号染色体的物理距离)，按照烟草野生种基因组大小为番茄基因组大小的3倍推算，1-1002植株N导入片段至少缩短了1.56Mb。

结果表明2-1398和2-9D植株用TN5.20引物对和TN5.34引物对检测为阴性，用N1N2引物对和TN4.99引物对检测为阳性。TN5.20引物对对应标记相对番茄11号染色体的物理距离为5.20Mb，TN5.51对应标记相对番茄11号染色体的物理距离为5.51Mb，推算出2-1398和2-9D植株至少缩短了0.31Mb(相对番茄11号染色体的物理距离)，按照烟草野生种基因组大小为番茄基因组大小的3倍推算，2-1398和2-9D植株N导入片段至少缩短了0.93Mb。

以上对本发明所提供的短N导入片段在烟草植株中的应用，包含短N导入片段的烟草植株的筛选方法，估算包含短N导入片段的烟草植株中缺失的累赘基因数量的分子标记、引物对和方法进行了详细介绍。本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。

序列表

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 短N导入片段在烟草中的应用及其筛选和估算方法

<130> PP171256

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 950

<212> DNA

<213> 心叶烟(Nicotiana glutinosa)

<400> 1

cgactttcaa agggaatcca gtttggatca tgtctttaac ctcaatatgg ccagtagtaa 60

accctataac attcgaaggc gttgacgtgg ggagcaagaa agcgaattgt gcaccaatgg 120

cgccggggat cataagaaga agaggatgaa tatgcatagt ttgagcaatc tggatgagca 180

atggaaccat aactgttgtg gttgcattat ttgatgtgat aaactcagtg agaattgcac 240

ttattaaaca aactgatggt gcaatggcta agtatggtgt ttttgataag aaatctaggg 300

attttgttag tatatcagca agtccacttg acctaattcc atcagctatg gcaaaacctg 360

ctcctagtag aaggattatg ttccatggca atttcttgca tttgttccaa tccattagct 420

tctctcctgg ttgcttcttg tttggaatta tgaacagtaa agttgccatc atcacctata 480

tatatgcagt gaaaaaatca atatcgtgag cagacatttt aggaactatt tttgaacgtc 540

aaatttcaac atgtaataca gtcaaacctc tatagaatag tctcgttcgt cagtagcgaa 600

gccaggaatg tttcttagag tgttcaaact tagaagaagt aaaaaaaaaa aatccatgac 660

aaagggtgtt cactatatgt tatatacctc taaaacctaa tattttacct atatacccag 720

tgttattttc cgacgaagga tggtcaatta accaccctta ccctaatgta gcttcgccca 780

tgtcgttcgt tccgaaattt tttagctgct atagtgaagt gttattatag aggatatata 840

ttataacata acataaaagt cggttccgag aaaacttggc ttttatagta aatgactgtt 900

agataaagat tctgctatag agaggtagga ctgtagtcac ttggcaggca 950

<210> 2

<211> 1071

<212> DNA

<213> 心叶烟(Nicotiana glutinosa)

<400> 2

tgccacacag ggtgactaga gaattgtgac attacctgtt tgtaacacaa ggttttttct 60

tagcacacaa acattgatgt ctagtatttg tcttgtttct aagtatttac ttcttcatgt 120

atagtttctc ccttgttcta aatacggtcg gaccttacta taataccatt catatatagc 180

aacactttaa tataaaagcc aatctttttc cggaactaat tttcatgtta tgttctctat 240

aacaacacct cgttataaca tccaaaaata ttcagatcaa acgaggttgt tattgagagg 300

tttgattgta cttaatttcg tcataactct ggcttagcta cagctttagt tgttctgcgc 360

ggatgaagtt ccccgtgttc tgtctctagg aagattctga ttttcaaatg catcttccat 420

cttttaatgt tcagctgtca aaactcaaca tgctgtcctc gaccatcagc aacatcgaaa 480

aagcaaaaaa gaaataggcg gttgctcttt gcatttcttg agaaaataaa aacaagatct 540

gtgtagtttg cccacgctaa tcagtggcga agccagaaaa ttcaataaca agtagtaata 600

ttttacctta tacatagcat atttttttgg cgaaggatat tcagttaacc accctcggcc 660

atacatagct tcgcctctga gtgcaattca tatttatgtt gagaatgagc ttgactgtta 720

cttactaaaa aacaaaaggc atgagcttga ttatttaggc ttcctaaatg ggcagtataa 780

acaaagatac tattcattga gcggttttgc tgtgtgctac actgtgtaga ctctccagcc 840

gcacccgtat cagatcctcc aaaatgcact acttttggag gattcgacac gcacctggcg 900

gcatttttct agagtcagag caacataggt tgtgtgggat ctttcaagtt tatagctttt 960

cttgtttcta atttttatat ctgtgaatta gactgtcaat ttggattcca taaacttgtg 1020

caacttctat aatctattgt caaatgtttg cctaatgaca cagttttgct t 1071

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgactttcaa agggaatcca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgcctgccaa gtgactacag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgccacacag ggtgactaga 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcaaaact gtgtcattag gc 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcgggtttt tagttcggtt t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggcaccatg tcacaaaaca 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cactttggcc tctcacacaa 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaacttgttc atagtctgcg aat 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgtcgacaca ttatgccatc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaggggtctt accccattgt 20

Claims (10)

1.短N导入片段在烟草植株中的应用，所述短N导入片段与Coker176类型烟草的N导入片段相比减少了N基因右端至少0.93Mb、优选至少1.56Mb的累赘基因组分。

2.根据权利要求1所述的应用，其得到选自以下的烟草植株：

a)N基因特异分子标记N1N2检测为阳性，且TN5.20引物对、TN5.34引物对和TN5.51引物对检测均为阴性的烟草植株；

b)N基因特异分子标记N1N2检测为阳性，且TN4.99引物对、TN5.20引物对、TN5.34引物对和TN5.51引物对检测均为阴性的烟草植株。

3.根据权利要求1或2所述的应用，所述短N导入片段通过染色体交换、基因组编辑、化学诱变或物理诱变的方法获得。

4.根据权利要求1或2所述的应用，所述烟草植株来源于烤烟、白肋烟、香料烟、晒晾烟和雪茄烟。

5.一种包含短N导入片段的烟草植株的筛选方法，其包括以下步骤：

a)利用N导入片段纯合的烟草植株与基因型为nn的烟草植株杂交，获得基因型为Nn的F1烟草植株，再将F1烟草植株与基因型为nn的烟草植株杂交，获得用于筛选短N导入片段的群体材料；

b)在步骤a)获得的群体材料的苗期接种TMV，在群体材料中筛选出表现枯斑的Nn基因型植株；

c)采用TN5.20引物对、TN5.34引物对、TN5.51引物对和N基因特异分子标记N1N2对步骤b)筛选出的Nn基因型植株进行基因型分型，筛选出N基因特异分子标记N1N2检测为阳性且TN5.20引物对、TN5.34引物对和TN5.51引物对检测均为阴性的植株。

6.根据权利要求5所述的筛选方法，其中步骤(c)中，采用TN4.99引物对、TN5.20引物对、TN5.34引物对、TN5.51引物对和N基因特异分子标记N1N2对步骤b)筛选出的Nn基因型植株进行基因型分型，筛选出N基因特异分子标记N1N2检测为阳性且TN4.99引物对、TN5.20引物对、TN5.34引物对和TN5.51引物对检测均为阴性的植株。

7.估算包含短N导入片段的烟草植株中缺失的累赘基因组分数量的分子标记，所述分子标记的序列包括SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列。

8.估算包含短N导入片段的烟草植株中缺失的累赘基因组分数量的引物对，所述引物对包括TN5.20引物对或TN4.99引物对。

9.估算包含短N导入片段的烟草植株中缺失的累赘基因组分数量的方法，其包括，采用引物对TN5.20通过PCR扩增检测序列为SEQ ID NO.1的分子标记，采用引物对TN4.99通过PCR扩增检测序列为SEQ ID NO.2的分子标记。

10.根据权利要求9所述的方法，其中PCR的反应体系如下：

PCR反应程序如下：94℃预变性5min；然后进入35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后72℃延伸10min；4℃保存。