CN109517225A - 坑-孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种坑‑孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法，该方法包括如下步骤：(1)配制多聚糖水溶液；(2)将乳化剂加入油相中制备含乳化剂的油相；将多聚糖水溶液滴加到含乳化剂的油相中，搅拌乳化，得到均匀乳液；(3)将多价金属交联剂溶于超纯水配成交联剂水溶液，将交联剂水溶液，滴加到均匀乳液中；(4)用正己烷或石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层，保留水相，清洗水相，冻干，得到坑‑孔复合微纳结构多聚糖微球。(1)本发明的微球，表面具有微米级的凹坑，坑内表面又有纳米级的细孔；粒径分布均匀，孔隙率高，吸水率高，吸附性强。具有良好的生物相容性，在20s～50s内能够有效完成止血。

Description

坑-孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法
技术领域
本发明涉及一种坑-孔复合微纳结构多聚糖微球及制备方法，属于高分子材料制备技术领域。
背景技术
天然高分子多糖具有资源丰富、绿色无污染、生物相容性好，可生物降解的优点，拥有多孔结构的高分子多糖微球在止血、载药、组织工程支架、蛋白纯化、金属离子吸附分离等领域具有很大的应用。
专利申请号为201610011690.X的专利报道了一种核壳结构复合多孔微球的制备方法，其使用海藻酸钠、壳聚糖、纤维素、明胶等为壳材，以壳聚糖多孔微球、纤维素多孔微球、聚乳酸多孔微球、明胶多孔微球等为内核，通过复乳液法，得到分散性好、不团聚，微球，但其表面壳层致密，不具有坑-孔结构。专利申请号为201611024927.4的专利以乳化交联法制备的海藻酸钙为核心球，利用层层自组装法在外层依次包覆了壳聚糖、海藻酸钠和壳聚糖，得到十微米级的多层核壳型载药微球，其中内核负载了内皮生长因子，外壳层负载了万古霉素，兼具促进血管生成和抗菌功能，但是，这种微球粒径小，表面没有分布均匀的微孔。
专利申请号为201710935220.7的专利用静电喷射法将羧甲基纤维素溶液喷射到稀硫酸凝固浴中，再生成型，然后洗涤和干燥，得到羧甲基纤维素多孔止血微球，该方法制备速率快、绿色环保、粒径均一，所制备的微球具有丰富的孔结构，但其表面不具有微米级坑状结构。专利申请号为201710318416.1的专利将明胶溶液通过乳化-脱水-洗涤-干燥-筛滤过程得到微球粗品，然后再以京尼平交联得到明胶微球，所制备的明胶微球毒性小，降解效果好。总之，采用以上方法制得的微球，存在结构单一、微观形貌难以调控、粒径分布过大的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种增加了高分子多糖微球形貌的多样性和应用的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
本发明的第二个目的是提供一种坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将天然多聚糖溶到超纯水中，配成质量浓度为2％～10％的多聚糖水溶液；
(2)将乳化剂加入油相中，使乳化剂的质量分数为0.4％-5％，在40-80℃，搅拌溶解，得含乳化剂的油相；在室温下将所述多聚糖水溶液滴加到含乳化剂的油相中，搅拌乳化，得到均匀乳液；所述含乳化剂的油相和多聚糖水溶液的质量比为(10-3):1；
(3)将多价金属交联剂溶于超纯水配成质量浓度为20％～30％的交联剂水溶液，将交联剂水溶液，滴加到搅拌下的步骤(2)获得的均匀乳液中，所述交联剂水溶液和均匀乳液的体积比(2-5):10，滴完后继续搅拌反应2～12h；
(4)用相当于步骤(3)获得的液体体积3～10倍的正己烷或石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层，保留水相，用正己烷或石油醚清洗水相；再用乙醇清洗，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
天然多聚糖为取代度:≥80％，粘度为10-80mPa.s的羧甲基壳聚糖、粘度为1500-4500mPa.s羧甲基纤维素、重均分子量为50000-100000的羧甲基葡聚糖、重均分子量为100000-500000透明质酸钠和粘度100-200mpa.s海藻酸钠至少一种。
步骤(2)所述油相为液体石蜡、植物油、正己烷中的至少一种，所述植物油为花生油，大豆油或菜籽油。
所述乳化剂为司盘85、司盘80、司盘60、吐温-80、吐温-60和Triton X-100中至少一种。
多价金属交联剂为CaCl2、ZnCl2、CuCl2或FeCl3中的至少一种。
步骤(2)的搅拌乳化的速率为500～800rpm，搅拌时间为1～4h。
步骤(3)的搅拌速率为300～500rpm。
步骤(4)为：用相当于步骤(3)获得的液体体积3～10倍的正己烷或石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层,保留水相，再用相当于水相体积3～10倍的正己烷或石油醚清洗水相1-3次；再用相当于水相体积3～10倍的乙醇清洗2-4次，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
上述方法制备的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
本发明的优点：
(1)本发明的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，表面具有微米级的凹坑，坑内表面又有纳米级的细孔，具有独特的表面“坑-孔”复合微纳米结构。
(2)本发明的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球粒径分布均匀，孔隙率高，吸水率高，吸附性强。
(3)制备过程简单，不需要加热，能耗低。所制备的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球在制备止血药物的应用。
(4)根据GB/T16886.5-2003体外细胞毒性评判标准，本发明各实施例获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球浸提液在10～40μg/mL具有0级细胞毒性，显示出良好的生物相容性。
(5)经检测，本发明的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球在20s～50s内能够有效完成止血。
按照此技术制备得到的可吸收多孔止血粉综合性能优良，便于操作和保存，并且制备工艺简单，适合工业化生产。
(6)经检测，本发明的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球具有良好理化性能。溶血率均小于5％，符合国家标准。
(7)结果表明坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，对于肝脏损伤创面，具有瞬间止血功能(止血时间小于5s)，并且在72h后，止血材料完全降解，无任何残留。对于股动脉大量出血，坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，能够在20s内完成止血，1周后手术创面回复正常，无任何止血微球样品残留。
附图说明
图1为实施例1所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球放大300倍的SEM图。
图2为实施例2所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球放大1200倍的SEM图。
图3为实施例3所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球放大10000倍的SEM图。
图4为实施例1所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的横截面放大1000倍的SEM图。
图5为实施例2所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的横截面放大5000倍的SEM图。
图6为实施例3所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球表面放大10000倍的SEM图。
图7为实施例1、实施例2和实施例3所制备微球的细胞毒性统计结果。
(A)利用MTT法测定的细胞存活率；
(B)采用荧光染色的方法，染色24小时后细胞，所示为细胞数目和细胞的存活状态。
图8为实施例3所得微球用于SD大鼠的肝脏止血实验(A)和SD大鼠股动脉止血实验(B)。
图9为实施例1-3所得止血微球的全血凝血指数测试结果，其中，伤口不做任何处理作为对照组。
具体实施方式
多孔微球的粒径大小、形貌结构和比表面积等对其性能有很大影响，本发明采用天然多聚糖为主要原材料，通过调控组分的分子量、溶液黏度、制备工艺条件等方法，克服了现有技术存在的问题，得到了一种坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
以下通过具体实施例，对本发明作进一步的说明。以下结合实施例及附图进一步阐明本发明的发明内容和实施方式，仅供参考和说明使用，不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将质量比为1:2:2的比例，将取代度:≥80％，粘度为10mPa.s的羧甲基壳聚糖、重均分子量为100000透明质酸钠和粘度100mpa.s海藻酸钠溶到超纯水中，配成质量浓度为2％的多聚糖水溶液；
(2)将质量比为1:1的司盘85和吐温-80混合得乳化剂加入液体石蜡中，使乳化剂的质量分数为0.4％，在40℃，搅拌溶解，得含乳化剂的油相；在室温下将多聚糖水溶液滴加到含乳化剂的油相中，500rpm搅拌乳化，搅拌时间为4h，得到均匀乳液；含乳化剂的油相与多聚糖水溶液的质量比为10：1；
(3)将CaCl2溶于超纯水配成质量浓度为20％的交联剂水溶液，将交联剂水溶液，滴加到在300rpm搅拌下的步骤(2)获得的均匀乳液中，所述交联剂水溶液和均匀乳液的体积比2:10，滴完后在继续在300rpm搅拌反应2h；
(4)用相当于步骤(3)获得的液体体积10倍的石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层，保留水相，再用相当于水相体积10倍的石油醚清洗水相1次；再用相当于水相体积10倍的乙醇清洗2次，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球平均粒径为10.01μm，微球表面具有平均直径为0.98μm的圆形凹坑，凹坑内表面有平均孔径为50.05nm的孔，微球内部有平均孔径为0.502μm的孔隙，见图1和图4。
实验证明，用取代度:≥80％，粘度为80mPa.s的羧甲基壳聚糖替代本实施例的取代度:≥80％，粘度为10mPa.s的羧甲基壳聚糖；并用粘度200mpa.s海藻酸钠替代本实施例的粘度100mpa.s海藻酸钠，其它同本实施例，获得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，其性状与本实施例获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球相似。
实验证明，用吐温-60替代本实施例中的吐温-80，其它同本实施例，可以制备出性状与本实施例获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球相似。
实施例2.
坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将质量比为1:1:1的粘度为4500mPa.s羧甲基纤维素、重均分子量为100000的羧甲基葡聚糖、重均分子量为500000透明质酸钠溶到超纯水中，配成质量浓度为10％的多聚糖水溶液；
(2)将乳化剂司盘80加入大豆油中，使乳化剂的质量分数为5％，在80℃，搅拌溶解，得含乳化剂的油相；然后在室温下将多聚糖水溶液滴加到含乳化剂的油相中，800rpm搅拌乳化，搅拌时间为1h，得到均匀乳液；含乳化剂的油相与多聚糖水溶液的质量比为3：1；
(3)将ZnCl2溶于超纯水配成质量浓度为30％的交联剂水溶液，将交联剂水溶液，滴加到500rpm搅拌下的步骤(2)获得的均匀乳液中，所述交联剂水溶液和均匀乳液的体积比5:10，滴完后在继续在500rpm搅拌反应12h；
(4)用相当于步骤(3)获得的液体体积3倍的正己烷加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层，保留水相，再用相当于水相体积3倍的正己烷清洗水相3次；再用相当于水相体积3倍的乙醇清洗4次，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球平均粒径为198μm，微球表面具有平均直径为5.23μm的圆形凹坑，凹坑内表面又具有平均孔径为200.04nm的孔，微球内部具有平均孔径为2.1μm的孔隙，见图2和图5。
实验证明，用粘度为1500mPa.s羧甲基纤维素替代本实施例的粘度为4500mPa.s羧甲基纤维素；用重均分子量为50000的羧甲基葡聚糖替代本实施例的重均分子量为100000的羧甲基葡聚糖，其它同本实施例，获得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，其性状与本实施例获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球相似。
实验证明，本实施例中的大豆油用其它植物油，如花生油或菜籽油替代，获得的获得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，其性状与本实施例获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球相似。
实施例3
坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)将质量比为2:1:1的重均分子量为80000的羧甲基葡聚糖、重均分子量为400000透明质酸钠、粘度150mpa.s海藻酸钠溶到超纯水中，配成质量浓度为6％的多聚糖水溶液；
(2)将质量比为4:1的司盘60和Triton X-100混合得乳化剂加入质量比为5：1的液体石蜡和正己烷中，使乳化剂的质量分数为1％，在50℃，搅拌溶解，得含乳化剂的油相；然后在室温下将多聚糖水溶液滴加到含乳化剂的油相中，600rpm搅拌乳化，搅拌时间为2h，得到均匀乳液；含乳化剂的油相和多聚糖水溶液的质量比为5：1；
(3)将CuCl2溶于超纯水配成质量浓度为25％的交联剂水溶液，将交联剂水溶液，滴加到400rpm搅拌下的步骤(2)获得的均匀乳液中，所述交联剂水溶液和均匀乳液的体积比3:10，滴完后在继续在400rpm搅拌反应6h；
(4)用相当于步骤(3)获得的液体体积5倍的石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层，保留水相，再用相当于水相体积5倍的石油醚清洗水相2次；再用相当于水相体积5倍的乙醇清洗3次，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
所得坑-孔复合微纳结构多聚糖微球平均粒径为100.04μm，微球表面具有平均直径为2.88μm的圆形凹坑，凹坑内表面又具有平均孔径为99.99nm的孔，微球内部具有平均孔径为1.1μm的孔隙，见图3和图6。
实验例1
细胞毒性实验
实验细胞使用48h～72h生长旺盛的L929细胞系细胞(市售)。
培养基为加入10％(V/V)胎牛血清的RAPI1640。
阴性对照组为加入10％(V/V)胎牛血清的RAPI1640；
实验组(分别取0.5g实施例1、实施例2和实施例3制备的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球与10mL加入10％(V/V)胎牛血清的RAPI1640，于37℃浸提24h，得到浸提液)；
阳性对照组(质量分数为5％的苯酚水溶液)；
试验在96孔板上进行。初始培养液的细胞(L929细胞系细胞)密度约为5万/mL，每孔加入200μL细胞培养液,使每孔中细胞个数约10000个。每孔重复三次，在37℃5％(V/V)二氧化碳/空气的恒温培养箱内培养24h，然后弃去原培养基。
阴性对照组中加200μL；
实验组分别加10μL、20μL、30μL、40μL、50μL浸提液，再加入阴性对照液使每孔中溶液体积为200μL；
阳性对照组分别加10μL、20μL、30μL、40μL、50μL质量分数为5％的苯酚溶液，再加入阴性对照液使每孔中溶液体积为200μL。
随后，将该96孔板放入37℃恒温培养箱中再培养48h后取出培养板，弃去培养板内溶液，每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h,接着吸去原液，加入150μL二甲亚砜，震荡十分钟，在免疫酶标仪上570nm波长处测定吸光度值(ABS)。
相对细胞活性(％)＝(ABS570实验组/ABS570阴性对照)×100％
根据GB/T16886.5-2003体外细胞毒性评判标准，实施例1、实施例2和实施例3所述的微球浸提液在10～40μg/mL具有0级细胞毒性，显示出良好的生物相容性。结果如图7所示。图7(A)中所得数据表明，实施例1-实施例3所得微球的细胞毒性为0级，没有明显的细胞毒性。图7(B)为实施例1-实施例3细胞荧光染色结果，图示细胞生长状态良好，细胞的生长状态未受到微球浸提液的影响。
实验例2
体表止血性能测试
对实施例1、实施例2和实施例3获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，进行体外止血功能检测，具体检测方法为：
将SD大鼠麻醉，固定，在背部左右两侧对称制造4个圆形伤口(直径2cm，深度0.5cm)，出血后，在出血部位涂洒0.05g坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
经检测，本发明的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球在20s～50s内能够有效完成止血(表3)。
表1 SD为实施例1-3大鼠体表止血时间统计结果
编号 阴性对照 实施例1 实施例2 实施例3
止血时间(s) 170±20 20±3 25±5 22±2
注：阴性对照为国产金创(壳聚糖止血粉)(商品名：壳聚糖止血粉，湖北普爱药业有限公司)
实验例3
溶血率：按照GB/T 16175-1996规定方法测定实施例1-3坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的溶血率。经检测，本发明的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球具有良好理化性能。微球的溶血率均小于5％(表2)，符合国家标准。
表2为实施例1-3的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的溶血率统计结果
注：阳性对照组为蒸馏水；阴性对照组为生理盐水；实验组为坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的生理盐水浸提液；X为545nm波长下吸光度；s为吸光度测量值偏差。
实验例4
以SD大鼠的肝脏损伤出血为模型：
对实施例3获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，进行体内止血功能检测，具体检测方法为：以SD大鼠的肝脏损伤出血为模型，通过水合氯醛水溶液腹腔注射麻醉，用手术刀在肝脏表面制造1cm×1cm伤口。喷涂量为20μg的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球于创面。观察血情，记录时间和出血量,如图8A，其中a为创面形成，开始流血；b喷涂上坑-孔复合微纳结构多聚糖微球；c用生理盐水清除表面微球，创面止血完成。术后，缝合腹部。1周后，开线观察恢复情况。结果表明实施例3制备的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，对于肝脏损伤创面，具有瞬间止血功能(止血时间小于5s)，并且在72h后，残留的微球完全降解。
实验例5.
坑-孔复合微纳结构多聚糖微球止血功能测试(股动脉出血模型)：
以SD大鼠的股动脉损伤大量成出血模型，测试实施例3获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的止血性能。
SD大鼠麻醉后，解剖露出股动脉，利用手术刀剪切动脉制造大出血。将0.2g样品洒在伤口处，直到止血结束，观察出血和止血情况(图8B，a为创面形成，开始喷血；b喷涂上坑-孔复合微纳结构多聚糖微球；c用生理盐水清除表面微球)。术后，缝合腹部。1周后，开线观察恢复情况。实验结果表明，对于股动脉大量出血，实施例3获得的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，能够在20s内完成止血，1周后手术创面恢复正常，无任何微球样品残留。
实验例6.
全血凝血指数测定：
对实施例1-3所制备的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球，进行全血凝血指数测定
具体实验步骤：20mg样品放置于塑料盘上，37℃下放置5min，200μL抗凝血缓慢滴加到样品表面，然后加入20μl 0.2M氯化钙水溶液，继续37℃培养5min。加入25ml蒸馏水，摇床30rpm震荡培养10min，分离上清，将上清在540nm处测得的吸光度记作A值，抗凝血在去离子水中的吸光度用作参考B值。
血液凝固指数计算：所得结果如图9所示。
全血凝血指数结果表明与对照组相比，实施例1-3的凝血指数显著降低。这表明实施例1-3所制备的多孔微球，具有很好的促凝血功能。
以上实施例为本发明相对较优的实施例，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化、改进和等效置换，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.坑-孔复合微纳结构多聚糖微球的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将天然多聚糖溶到超纯水中，配成质量浓度为2％～10％的多聚糖水溶液；
(2)将乳化剂加入油相中，使乳化剂的质量分数为0.4％-5％，在40-80℃，搅拌溶解，得含乳化剂的油相；在室温下将所述多聚糖水溶液滴加到含乳化剂的油相中，搅拌乳化，得到均匀乳液；所述含乳化剂的油相和多聚糖水溶液的质量比为(10-3):1；
(3)将多价金属交联剂溶于超纯水配成质量浓度为20％～30％的交联剂水溶液，将交联剂水溶液，滴加到搅拌下的步骤(2)获得的均匀乳液中，所述交联剂水溶液和均匀乳液的体积比(2-5):10，滴完后继续搅拌反应2～12h；
(4)用相当于步骤(3)获得的液体体积3～10倍的正己烷或石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层，保留水相，用正己烷或石油醚清洗水相；再用乙醇清洗，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述天然多聚糖为取代度:≥80％，粘度为10-80mPa.s的羧甲基壳聚糖、粘度为1500-4500mPa.s羧甲基纤维素、重均分子量为50000-100000的羧甲基葡聚糖、重均分子量为100000-500000透明质酸钠和粘度100-200mpa.s海藻酸钠至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(2)所述油相为液体石蜡、植物油、正己烷中的至少一种，所述植物油为花生油，大豆油或菜籽油。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述乳化剂为司盘85、司盘80、司盘60、吐温-80、吐温-60和Triton X-100中至少一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述多价金属交联剂为CaCl2、ZnCl2、CuCl2或FeCl3中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(2)的搅拌乳化的速率为500～800rpm，搅拌时间为1～4h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(3)的搅拌速率为300～500rpm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(4)为：用相当于步骤(3)获得的液体体积3～10倍的正己烷或石油醚加入到步骤(3)获得的液体中，溶液分层后倒出上层油相层,保留水相，再用相当于水相体积3～10倍的正己烷或石油醚清洗水相1-3次；再用相当于水相体积3～10倍的乙醇清洗2-4次，冻干，得到坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
9.权利要求1-8之一的方法制备的坑-孔复合微纳结构多聚糖微球。
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