CN109503687B - 一种尿苷三磷酸的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种尿苷三磷酸的分离纯化方法。所述分离纯化方法包括如下步骤：1)上样：将尿苷三磷酸粗品过滤后上样到层析柱中，所述层析柱填料是基质为聚丙烯酸酯的单分散微球；2)洗脱：对吸附在层析柱中的UTP用洗脱液进行洗脱；3)收集汇总：对洗脱后的尿苷三磷酸溶液进行分段收集，对符合目的峰值要求的组份液进行汇总。本发明的尿苷三磷酸的分离纯化方法，简单方便，纯化周期短，仅需一步层析纯化即可满足尿苷三磷酸高纯度的要求，纯度达99％以上，纯化收率高而且稳定。

Description

一种尿苷三磷酸的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及药物纯化技术领域，具体涉及一种尿苷三磷酸的分离纯化方法。

背景技术

尿苷三磷酸(Uridine triphosphate，简称UTP)是一种尿嘧啶核苷酸，由一个尿嘧啶、一个核糖、三个磷酸连接而成，其中，磷酸基团连于5’碳上。UTP与糖类代谢有密切关系，由UTP与1-磷酸葡糖经酶催化生成UDP-葡糖与焦磷酸。另外，也生成UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-萄糖醛酸等。

UTP参与嘧啶核糖核苷酸的合成，是RNA合成(转录)时的原料，另外，UTP也可用作能量来源，功能类似ATP，但较ATP少见。在有机体的很多能量代谢途径中，也有UTP的参与。

UTP还参与某些G蛋白偶联受体(例如P2Y、P2Y2、P2Y11等)的活化过程，从而激活上皮细胞氯离子通道，增加纤毛的摆动频率，诱导呼吸道上皮细胞中的杯状细胞脱颗粒作用，也能影响炎症细胞作用和血管反应度。另外，UTP也常应用于某些疾病(例如INS316、肺癌等)的诊断和治疗。其在鼻窦炎、慢性支气管炎、中耳炎、干眼症及胃肠道疾病方面也起着较重要的作用，其市场价格可以达到12000元/kg，在药物市场上有广阔的应用前景。

其中，尿苷三磷酸的结构式如下：

UTP的主要合成工艺是利用微生物细胞酶系合成，目前，国内外专利、文献等鲜有公开对尿苷三磷酸纯化工艺的报道。

GB1167288公开了一种尿苷三磷酸的纯化方法，该发明提供了一种通过使用离子交换方法从其水溶液中纯化UDP和/或UTP的改进方法，由此可以获得UDP或UTP的浓缩溶液。该方法使用两步离子交换树脂分离UTP，纯化后样品纯度为97％，收率72.2％，纯化效果较差，收率也相对较低。

肖明芳等在其硕士论文《离子交换法分离纯化5，-尿苷三磷酸》中使用离子交换法纯化了尿苷三磷酸，纯化后样品纯度为97.17％，收率92.25％，纯化工艺中使用的树脂为实验室自行合成的，难以实现稳定性和产业化。

因此，为了得到高纯度、高收率的尿苷三磷酸且纯化周期短、稳定性高的分离纯化工艺，有必要对尿苷三磷酸的精细纯化工艺做更进一步的研究。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种尿苷三磷酸的分离纯化方法，仅需一步层析纯化即可满足尿苷三磷酸高纯度的要求，纯化收率高而且稳定，纯度达99％以上，收率为86.54～90.24。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种尿苷三磷酸的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括如下步骤：

1)上样：将尿苷三磷酸粗品过滤后上样到层析柱中，所述层析柱填料是基质为聚丙烯酸酯的单分散微球；

2)洗脱：对吸附在层析柱中的UTP用洗脱液进行洗脱；

3)收集汇总：对洗脱后的尿苷三磷酸溶液进行分段收集，对符合目的峰值要求的组份液进行汇总。

本发明的分离纯化方法，仅需一步层析纯化即可满足尿苷三磷酸高纯度的要求，纯化收率高而稳定，纯度达99％以上，纯化收率高而且稳定，同时本发明分离方法简单方便，纯化周期短，且整个纯化过程中无需使用任何有机溶剂，可用于规模化生产，大大降低了生产成本。

步骤1)中，所述单分散微球为粒径呈单分散的、具有孔道结构的微球。

优选地，步骤1)中，所述单分散微球的粒径为40～60μm，例如单分散微球的粒径为40μm、41μm、42μm、43μm、44μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、50μm、51μm、52μm、53μm、54μm、55μm、56μm、57μm、58μm、59μm、60μm；孔径为

例如孔径为

优选地，步骤1)中，所述单分散微球的型号为UniQ-50XS，苏州纳微科技股份有限公司生产的，粒径为55μm，孔径为

本发明中，纯化过程中所使用的层析介质UniQ-50XS，是键合季胺基的基质为聚丙烯酸酯的单分散微球。尿苷三磷酸分子式中含有三个磷酸根，优选地，在选定的洗脱条件下，使用苏州纳微科技股份有限公司生产的UniQ-50XS用于UTP纯化取到了非常好的效果。同时，聚丙烯酸酯的骨架结构可耐受全pH范围，并可在后期对层析柱进行高pH下的彻底清洗，便于工业上的反复利用，填料寿命长，降低了成本。

更优选地，步骤1)中，所述单分散微球的粒径为55μm，孔径为

步骤1)中，所述尿苷三磷酸粗品的HPLC纯度为64～66％，例如粗品的HPLC纯度为64％、64.1％、64.2％、64.3％、64.4％、64.5％、64.6％、64.7％、64.8％、64.9％、65％、65.1％、65.2％、65.23％、65.3％、65.417％、65.5％、65.6％、65.7％、65.8％、65.9％、66％。

步骤1)中，所述层析柱的装柱体积为4～20mL，例如装柱体积为4.15mL、4.65mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL、15.5mL、15.7mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL；上样载量为10-30g/L，例如上样载量为10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L。

步骤2)中，所述洗脱液含0.5～2mol的盐溶液，例如盐溶液的摩尔数为0.5mol、0.6mol、0.7mol、0.8mol、0.9mol、1mol、1.1mol、1.2mol、1.3mol、1.4mol、1.5mol、1.6mol、1.7mol、1.8mol、1.9mol、2mol，且不含有机溶剂，安全、无污染且成本很低。

优选地，所述盐溶液为氯化钠、氯化铵和乙酸钠中的一种。

步骤2)中，所述洗脱液的流速为200～300cm/h，例如洗脱液的流速为200cm/h、210cm/h、220cm/h、230cm/h、240cm/h、250cm/h、260cm/h、270cm/h、280cm/h、290cm/h、300cm/h。

步骤2)中，所述洗脱液的洗脱量为60～80CV，例如所述洗脱液的洗脱量为60CV、61CV、62CV、63CV、64CV、65CV、66CV、67CV、68CV、69CV、70CV、71CV、72CV、73CV、74CV、75CV、76CV、77CV、78CV、79CV、80CV。

作为本发明的优选方案，尿苷三磷酸的分离纯化方法，包括如下步骤：

1)上样：将纯度为64～66％的尿苷三磷酸粗品过滤后上样到层析柱中，其中，所述层析柱的装柱体积为4～20mL，上样载量为10～30g/L，所述层析柱填料是基质为聚丙烯酸酯的单分散微球UniQ-50XS；

2)洗脱：对吸附在层析柱中的UTP用洗脱液进行洗脱，其中，所述洗脱液含0.5～2mol的盐溶液，且不含有机溶剂，所述洗脱液的流速为200～300cm/h，所述洗脱液的洗脱量为60～80CV；

3)收集汇总：对洗脱后的尿苷三磷酸溶液进行分段收集，对符合目的峰值要求的组份液进行汇总。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的尿苷三磷酸的分离纯化方法，仅需一步层析纯化即可满足尿苷三磷酸高纯度的要求，纯化收率高而且稳定，纯度达99％以上，收率为86.54～90.24％。

(2)本发明的尿苷三磷酸的分离纯化方法，简单方便，纯化周期短，且整个纯化过程中仅用盐溶液作为流动相，无需使用任何有机溶剂，安全、无污染且成本很低，所用固定相可重复利用，可用于规模化生产，大大降低了环保压力和生产成本。

附图说明

图1为本发明尿苷三磷酸的分离纯化方法的实施例1使用的UniQ-50XS聚丙烯酸酯微球的扫描电镜图；

图2为本发明的实施例1提纯前尿苷三磷酸粗品的高效液相色谱图；

图3为本发明的实施例1纯化后尿苷三磷酸的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图1-3，并通过具体实施例对发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

本发明的一种尿苷三磷酸的分离纯化方法，包括如下步骤：

1)上样：将尿苷三磷酸粗品过滤后上样到层析柱中，所述层析柱填料是基质为聚丙烯酸酯的单分散微球；

2)洗脱：对吸附在层析柱中的UTP用洗脱液进行洗脱；

3)收集汇总：对洗脱后的尿苷三磷酸溶液进行分段收集，对符合目的峰值要求的组份液进行汇总。

实施例1

取尿苷三磷酸粗品47.5mL(65.417％纯度，样品以流动相A稀释5倍)，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用7.7×100mm的预装柱，UniQ-50XS强阴离子交换微球(苏州纳微科技股份有限公司生产)作为层析柱填料，装柱体积为4.65mL，上样载量20g/L。

上样前对层析柱进行平衡，而后上样，然后采用梯度洗脱方式进行洗脱。

分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中尿苷三磷酸的纯度99.05％，收率90.20％。

图1是UniQ-50XS强阴离子交换树脂微球的扫描电镜图，由图1可以看出，微球呈现高度的粒径均一性。

图2是提纯前的尿苷三磷酸粗品的高效液相色谱图，由图2可以看出，尿苷三磷酸粗品中杂质含量高，不符合尿苷三磷酸高纯度的要求。

图3是提纯后的尿苷三磷酸高效液相色谱图，由图3可以看出，经纯化后尿苷三磷酸中的杂质含量降低，符合尿苷三磷酸高纯度的要求。

实施例2

取尿苷三磷酸粗品320mL(65.23％纯度，样品以流动相A稀释5倍)，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用Tricorn10-200色谱柱，UniQ-50XS强阴离子交换微球(苏州纳微科技股份有限公司生产)作为层析柱填料，装柱体积为15.7mL，上样载量20g/L。

上样前对层析柱进行平衡，而后上样，然后采用梯度洗脱方式进行洗脱。

分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中尿苷三磷酸的纯度99.089％，收率90.24％。

实施例3

取尿苷三磷酸粗品45mL(63.947％纯度，样品以流动相A稀释5倍)，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用7.7×100mm的预装柱，UniQ-50XS强阴离子交换微球(苏州纳微科技股份有限公司生产)作为层析柱填料，装柱体积为4.65mL，上样载量18g/L。

上样前对层析柱进行平衡，而后上样，然后采用梯度洗脱方式进行洗脱。

分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析，洗脱液中尿苷三磷酸的纯度为99.408％，收率86.54％。

实施例4

本实施例使用了另一种强阴离子交换微球UniQ-30S(苏州纳微科技股份有限公司生产)作为层析柱填料，其他纯化条件不变，与实施例1相同。

取尿苷三磷酸粗品47.5mL(65.417％纯度，样品以流动相A稀释5倍)，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。采用7.7×100mm的预装柱，UniQ-30S强阴离子交换微球(粒径约36μm，孔径约

)作为层析柱填料，装柱体积为4.65mL，上样载量20g/L。

上样前对层析柱进行平衡，而后上样，然后采用梯度洗脱方式进行洗脱。

分段收集目的峰值的溶液，对符合要求的组份液进行汇总，经高效液相色谱分析。纯化后样品UTP的纯度为98.9％，收率85.2％。

综上，本发明的尿苷三磷酸的分离纯化方法，仅需一步层析纯化即可满足尿苷三磷酸高纯度的要求，纯化收率高而且稳定，纯度达99％以上，收率为86.54～90.24％。

另外，本发明的尿苷三磷酸的分离纯化方法，简单方便，纯化周期短，且整个纯化过程中仅用盐溶液作为流动相，无需使用任何有机溶剂，安全、无污染且成本很低，所用固定相可重复利用，可用于规模化生产，大大降低了环保压力和生产成本。

本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (3)

1.一种纯度达99％以上、收率为86.54～90.24％的尿苷三磷酸的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包括如下步骤：

1)上样：将纯度为64～66％的尿苷三磷酸粗品过滤后上样到层析柱中，所述层析柱填料是基质为聚丙烯酸酯的单分散微球，所述单分散微球的型号为UniQ-50XS，所述层析柱的装柱体积为4～20mL，上样载量为10～30g/L；

2)洗脱：对吸附在层析柱中的UTP用洗脱液进行洗脱，所述洗脱液含0.5～2mol的盐溶液，且不含有机溶剂，所述盐溶液为氯化钠、氯化铵和乙酸钠中的一种，所述洗脱液的流速为200～300cm/h，所述洗脱液的洗脱量为60～80CV；

3)收集汇总：对洗脱后的尿苷三磷酸溶液进行分段收集，对符合目的峰值要求的组份液进行汇总。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述单分散微球为粒径呈单分散的、具有孔道结构的微球。

3.根据权利要求1或2所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述单分散微球的粒径为40～60μm，孔径为

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