CN109498620A - 一种治疗青光眼的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗青光眼的药物。本发明通过实验发现，CDC42抑制剂ML141能够显著抑制CDC42基因表达，促使小梁网细胞间隙增大。同时，5μM以下浓度，对细胞生长无毒副作用，同时显著降低CDC42的表达。本实验结果提示，ML141可能通过调节小梁网细胞骨架，进而达到调控房水引流，降低眼内压，进而治疗青光眼目的。本发明提供了CDC42基因的抑制剂在制备治疗青光眼药物中的应用。

Description

一种治疗青光眼的药物
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种治疗青光眼的药物。
背景技术
青光眼是全球不可逆性盲的首要原因，为社会和个人带来巨大经济和精神负担。眼压升高是青光眼的主要危险因素和致病原因，降低眼压的抗青光眼治疗，成为眼科研究的热点和难点。
生理状态下，房水通过小梁网、近小管组织和Schlemm’s管组成的小梁途径排出。小梁途径房水排出受阻或阻力增加是引起眼压升高的主要原因。由微管微丝以及中间结构组成的细胞骨架，在持小梁网流出途径的结构和功能上发挥重要作用。有研究表明，肌动蛋白细胞骨架完整性和小梁网收缩性能影响房水流出和眼压。
Rho GTP酶家族是小GTP酶结合蛋白RAS超家族的一种。RhoA，Rac1和CDC42等是RhoGTP酶家族主要成员，在调节肌动蛋白动力学和各种肌动蛋白相关细胞活动中起到重要作用。Rho GTP酶作用于其下游蛋白Rho激酶ROCK1和ROCK2后，会引起各种细胞内底物如肌球蛋白轻链(MLC)，肌球蛋白磷酸酶底物1(MYPT1)LIM激酶，CP1-17等的磷酸化。通过这些底物相互作用，Rho激酶调节肌动蛋白细胞骨架动力学，肌动蛋白收缩，细胞粘附，细胞形态等。
目前临床上治疗青光眼的Rho GTP酶抑制剂仅限于RhoA抑制剂Rhopressa的研究，而其不良反应如严重的结膜充血极大的限制了其在临床上的广泛使用。
ML141，其结构如式1所示，其是Rho家族GTPase cdc42的一种有效的，选择性可逆非竞争性抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供CDC42基因的抑制剂在制备治疗青光眼药物中的应用。
本发明通过实验发现，CDC42抑制剂ML141能够显著抑制CDC42基因表达，促使小梁网细胞间隙增大。同时，5μM以下浓度，对细胞生长无毒副作用，同时显著降低CDC42的表达。本实验结果提示，ML141可能通过调节小梁网细胞骨架，进而达到调控房水引流，降低眼内压，进而治疗青光眼目的。
因此，本发明提供了CDC42基因的抑制剂在制备治疗青光眼药物中的应用。
优选，所述的CDC42基因的抑制剂为ML141。
本发明的第二个目的是提供一种治疗青光眼的药物，其特征在于，含有CDC42基因的抑制剂作为活性成分。
优选，所述的CDC42基因的抑制剂为ML141。
本发明的第三个目的是提供ML141在制备调节小梁网细胞骨架，进而达到调控房水引流，降低眼内压的药物中的应用。
目前，临床上现已上市的Rho GTP酶抑制剂Rhopressa具有严重结膜出血的不良反应，限制了其在临床上的广泛应用。本发明研究发现，ML141能够显著抑制CDC42基因表达，促使小梁网细胞间隙增大。同时，5μM以下浓度，对细胞生长无毒副作用，同时显著降低CDC42的表达，对Rho GTP酶家族其他成员如RhoA，Rac1等无作用或作用很小，较其他家族成员抑制剂，ML141具有靶向性和特异性强，及不良反应少的特点。本实验结果提示，ML141可能通过调节小梁网细胞骨架，进而达到调控房水引流，降低眼内压，进而治疗青光眼目的。
本发明的ML141对Rho GTP酶家族其他成员无作用或者用微小，极大提高了药物的靶向性和特异性，降低其不良反应的发生概率。其通过靶向下调Cdc42蛋白，松弛小梁网结构，从而达到提高房水流出降低眼压的作用。和目前在用的抗青光眼药物原理不同，可单独使用降低眼压，也可和其他药物联合使用并达到更好的疗效。
附图说明：
图1是小梁网细胞在不同放大倍数下细胞状态。正常培养小梁网细胞形态无明显异常；
图2是加药前以及0.2μM，1μM，5μM ML141处理后细胞形态，其中红色箭头表示细胞间隙增大；
图3是CCK-8测量细胞活性结果。10μM ML141组细胞活性显著下降，其他组无显著性差异，其中，n＝3，***：P＜0.001。
图4是RT-qPCR测量CDC42mRNA表达量实验组mRNA表达量均显著下降。其中，n＝3，**：P＜0.01*：P＜0.05。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1.主要试剂
ML141(大连美仑生物技术有限公司)；DMEM-F12(Hyclone)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶(Thermo Fisher)；青链霉素(双抗)(Solarbio)；PBS缓冲液(北京鼎国昌盛生物公司)；CCK-8试剂盒(大连美仑生物技术有限公司)；反转录试剂盒(Takara)；RT-PCR试剂盒(Thermo Fisher)，引物合成(河南尚亚生物技术有限公司)。
2.实验步骤
2.1人眼小梁网细胞培养
将人眼小梁网细胞(赛百慷(上海)生物技术股份有限公司)体外培养于DMEM-F12培养基(10％胎牛血清，1％双抗)，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。在电子显微镜下观察培养小梁网细胞，并进行拍照。
2.2小梁网细胞的形态和细胞骨架间隙观察
取指数生长期细胞，使用血细胞计数板对细胞悬液计数；将细胞悬液接种到96孔培养板中，采用倍比稀释法，调节细胞的浓度，使得浓度达到1×104个/mL，每组5孔，每孔加入细胞悬液100μL，24h后，弃去孔内液体重新加入100μL DMEM-F12培养基(无血清)继续培养24h.弃去孔内液体，各组分别加入含0.2μM、1μM、5μM ML141的培养液100μL，设置无药对照组(培养液中有细胞)，在电子显微镜下观察培养小梁网细胞的形态和细胞骨架间隙，并进行拍照。
2.3ML141对人小梁网细胞生长的影响
取指数生长期细胞，使用血细胞计数板对细胞悬液计数；将细胞悬液接种到96孔培养板中，采用倍比稀释法，调节细胞的浓度，使得浓度达到1×104个/mL，每组5孔，每孔加入细胞悬液100μL，24h后，弃去孔内液体重新加入100μL DMEM-F12培养基(无血清)继续培养24h.弃去孔内液体，各组分别加入0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM ML141的培养液100μL，设置无药对照组(培养液中有细胞)以及1/1000DMSO对照组，并对应设置空白对照组(培养液中无细胞)，在二氧化碳培养箱中37℃、5％二氧化碳浓度下培养24h后取出培养板，加入CCK一8试剂10μL，再将培养板重新放回二氧化碳培养孵育4h后，利用酶联免疫检测仪在波长450mm处测量OD450值。相对细胞活性的计算公式为：相对细胞活性(％)＝(药物组OD值一空白对照OD值)/(无药对照组OD值一空白对照组OD值)]×100％。
2.4CDC42mRNA表达量检测
用细胞裂解液将0.2μM、1μM、5μM以及对照各组细胞裂解，用TRIzol、氯仿和异丙醇分别提取各组细胞总RNA,逆转录成cDNA。逆转录反应条件为:37℃,15min；85℃,5sec。逆转录反应体系20μL。
GAPDH上游引物为5'CCATCAATGACCCCTTCATTG3',下游引物为5'-GACGGTGCCATGGAATTT-3'。Cdc42上游引物为5'-CTTTCTTGCTTGTTGGGACT-3',下游引物为5'-ACACCTGCGGCTCTTCTT-3'。
预变性95℃，2min；之后每一步变性95℃，5S；退火延伸60℃，1min；共进行40个循环。使用Applied Biosystems 7300进行检测。
2.5统计学方法
统计学方法用Graphpad Prism 7统计软件采用ONE WAYANOVA(单因素方差分析)统计方法对数据进行分析，P＜0.05代表差异有统计学意义。
3.实验结果：
3.1小梁网细胞形态观察
在电子显微镜下观察培养小梁网细胞，正常培养小梁网细胞形态无明显变化。(如图1)。进行细胞活性检测时，分别观察在加药前以及加药0.2μM，1μM，5μM 24h后细胞状态。实验结果显示，加药后小梁网细胞间隙显著增加。(如图2)
3.2CCK-8测量细胞活性抑制
我们使用grafpadprismer 7软件对CCK-8检测细胞活性数据用单因素方差分析进行处理，其结果如图3所示。从图上我们可以看到，10μM ML141加药组和对照组对比小梁网细胞生长明显受到抑制，P<0.001。ML141小于等于5μM的各组小梁网细胞生长没有受到抑制，实验结果提示，5μM以下浓度ML141不影响细胞生长，对小梁网细胞无毒副作用，同时可通过增加小梁网细胞骨架间隙，促进房水引流，达到降低眼压，治疗青光眼的目的。
3.3RT-PCR检测CDC42表达量变化情况
使用grafpadprismer 7软件用单因素方差分析对RT-qPCR测量结果进行分析。结果如图4所示。从图中我们可以看出，3个加药组Cdc42mRNA表达量均较对照组显著下降，其中1μM ML141组和5μM ML141组mRNA表达量下降更显著。
4结论
ML141能够显著抑制CDC42基因表达，促使小梁网细胞间隙增大。同时，5μM以下浓度，对细胞生长无毒副作用，同时显著降低CDC42的表达。本实验结果提示，ML141可能通过调节小梁网细胞骨架，进而达到调控房水引流，降低眼内压，进而治疗青光眼目的。

Claims (6)

1.CDC42基因的抑制剂在制备治疗青光眼药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的CDC42基因的抑制剂为ML141。
3.一种治疗青光眼的药物，其特征在于，含有CDC42基因的抑制剂作为活性成分。
4.根据权利要求3所述的治疗青光眼的药物，其特征在于，所述的CDC42基因的抑制剂为ML141。
5.CDC42基因的抑制剂在制备调节小梁网细胞骨架，进而达到调控房水引流，降低眼内压的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的CDC42基因的抑制剂为ML141。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114939167A (zh) * 2022-05-17 2022-08-26 温州医科大学附属眼视光医院 Integrin/ROCK信号通路靶向调控剂在制备修复细胞骨架损伤修复药物的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005051392A1 (en) * 2003-11-20 2005-06-09 Children's Hospital Medical Center Gtpase inhibitors and methods of use
WO2009007457A2 (en) * 2007-07-12 2009-01-15 Exonhit Therapeutics Sa Compounds and methods for modulating rho gtpases
WO2007016539A3 (en) * 2005-07-29 2009-04-02 Childrens Hosp Medical Center Gtpase inhibitors and methods of use and crystal structure of rac-1 gtpase

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005051392A1 (en) * 2003-11-20 2005-06-09 Children's Hospital Medical Center Gtpase inhibitors and methods of use
WO2007016539A3 (en) * 2005-07-29 2009-04-02 Childrens Hosp Medical Center Gtpase inhibitors and methods of use and crystal structure of rac-1 gtpase
WO2009007457A2 (en) * 2007-07-12 2009-01-15 Exonhit Therapeutics Sa Compounds and methods for modulating rho gtpases

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEI-CHIN LEE等: "Primary Angle Closure Glaucoma (PACG) Susceptibility Gene PLEKHA7 Encodes a Novel Rac1/Cdc42 GAP That Modulates Cell Migration and Blood-Aqueous Barrier Function", 《HUM MOL GENET》 *
SEAN M MCNARY等: "Transforming Growth Factor beta-Induced Superficial Zone Protein Accumulation in the Surface Zone of Articular Cartilage Is Dependent on the Cytoskeleton", 《TISSUE ENG PART A》 *
XUAN QIU等: "Dexamethasone Increases Cdc42 Expression in Human TM-1 Cells", 《CURR EYE RES》 *
郑艳秋等: "CDC42抑制剂ML141对喉癌Hep-2细胞增殖的抑制作用", 《现代生物医学进展》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114939167A (zh) * 2022-05-17 2022-08-26 温州医科大学附属眼视光医院 Integrin/ROCK信号通路靶向调控剂在制备修复细胞骨架损伤修复药物的应用
CN114939167B (zh) * 2022-05-17 2024-06-04 温州医科大学附属眼视光医院 Integrin/ROCK信号通路靶向调控剂在制备修复细胞骨架损伤修复药物的应用

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