CN109496156A - 一种减少蛋的污染的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及沙门氏菌(Salmonella)突变菌株及其作为预防沙门氏菌感染、特别是蛋中的沙门氏菌感染的疫苗的用途。

Description

一种减少蛋的污染的方法

发明领域

本发明涉及沙门氏菌(Salmonella)突变菌株及其作为预防沙门氏菌感染、特别是蛋中的沙门氏菌感染的疫苗的用途。

发明背景

沙门氏菌病是由属于沙门氏菌属的细菌引起的世界范围内发生的疾病。肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)(肠道亚种)是革兰氏阴性细菌病原体，其包含超过2500种不同的血清变型，其中只有有限的数量与家禽(poultry)有关。就人类公共卫生意义而言，肠道沙门氏菌肠炎血清变型(Salmonella enterica serovar Enteritidis或S.Enteritidis；SE)和鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)通常被认为是鸡(chicken)中最重要的血清变型。除了幼鸡(young chick)以外，感染上述血清变型的鸡似乎主要是无症状的并且持续长时间脱落(shed)细菌，在极少数情况下具有全身性疾病。然而，这些血清变型通常与人类感染相关，其主要导致自限性胃肠疾病，并且暴露于家禽或家禽产品是人类感染的主要风险因素之一。Majowicz等人(2010年)于2009年估计，全球每年有9,380万例由沙门氏菌物种引起的肠胃炎病例，其中155,000例死亡。超过8,000万例被认为是食源性的，并且这些感染中相当一部分是由血清型肠炎和蛋的食用引起的。肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌的感染能够变得严重，需要抗生素治疗甚至住院治疗。因此，家禽业和医疗保健系统仍然承受着沉重的负担。此外，随着多药耐药性沙门氏菌菌株的出现，对人类患者的抗生素治疗变得越来越困难。因此，肯定需要采取有效措施来控制家禽群中非宿主适应性的沙门氏菌物种的流行。

蛋是导致传播至人类的病原体的主要媒介物。由于鸡(hen)的环境中存在沙门氏菌或蛋通过泄殖腔，沙门氏菌能够存在于壳表面。此外，细菌还能够在生殖道定殖后污染内部的蛋，这是由于壳穿透或产蛋鸡的生殖道的定殖并因此掺入形成的蛋中。在后一种情况下，蛋是使用卫生措施(如洗蛋)无法消除的“内部有沙门氏菌的盒子”。然而，几个证据链支持这样的观点，即在生殖器官中蛋的形成期间比蛋壳穿透更有可能发生蛋的SE污染。与蛋相关的流行性疾病在二十世纪九十年代中期到二十一世纪初达到最大值。在欧盟，立法一直是造成产蛋鸡养殖场、蛋和蛋制品中沙门氏菌发病率严重下降和从而由于蛋食用导致的人类感染严重下降的原因。这些立法迫使成员国采取行动以监测和控制病原体，并制定了降低发病率的目标。在过去二十年中，欧盟实施了沙门氏菌控制计划，包括：a)抗生素不能用于控制沙门氏菌b)在商业产蛋鸡中具有高于10％的肠炎沙门氏菌发病率的成员国是强制性接种疫苗的和c)活疫苗只能在饲养期间使用。第1237/2007号条例(Anonymous，2007)规定了对来自感染肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌的鸡群的食用蛋的交易限制。后者指出，必须禁止来自肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌阳性鸡群的蛋进入市场，除非它们以确保所有沙门氏菌被破坏的方式得到了治疗。

尽管人类病例有所减少，但沙门氏菌病仍然是继卷曲杆菌病之后第二大最常报道的人畜共患疾病。虽然蛋已经不再是导致沙门氏菌病的主要食物媒介物，但似乎当考虑根据可用于食用的食物的吨位衡量的与不同来源相关的风险时，在食用食用蛋时沙门氏菌感染的风险仍然是最高的(EFSA，2013)。

作为综合沙门氏菌控制计划的一部分，鸡的疫苗接种以及其他控制措施是降低沙门氏菌发病率的重要策略。鸡的疫苗接种利用宿主的免疫系统来降低感染后与家禽群相关的沙门氏菌物种的水平，而不是控制疾病。已经测试的沙门氏菌疫苗分为三类：减毒活疫苗、失活疫苗和亚单位疫苗(Desin T等人，2013)。尽管一些商业上可获得的疫苗是失活的细菌形式，但是仅少数登记的肠炎沙门氏菌活疫苗可商购用于家禽。这些活疫苗是基于代谢漂移突变的原理或通过化学诱变获得的营养缺陷型双标记突变体开发的，这意味着恢复毒力的风险更高(Van Immerseel F等人，2013)。此外，开发了商业上可获得的疫苗，其聚焦于减少宿主组织例如脾、肝和盲肠的脱落和定殖，而已知生殖道中的沙门氏菌定殖通常是高且持久的。在一些研究中，在没有肠道定殖的情况下，从感染禽类(birds)的生殖组织中分离出SE(Lister，1988)。已经证明，通过鸡的生殖组织的重复体内传代(passage)增加了SE菌株诱导内部的蛋的污染的能力，而通过肝脏和脾脏的连续传代不会影响菌株引起蛋的污染的能力(Gast等人，2003)。这表明SE与生殖组织的相互作用可能诱导或选择对蛋的污染重要的微生物特性的表达。SE能够在自然和实验感染的鸡的生殖组织中持续存在，即使动物对感染产生先天和适应性免疫反应，这表明细菌能够存在于细胞内并逃脱宿主防御机制(Gantois等人，2009)。因此，蛋内沙门氏菌的沉积最大可能是被感染的产蛋鸡中生殖组织定殖的结果(Keller等人，1995；Methner等人，1995；Gast&Holt，2000a)。WO2006129090显示用鼠伤寒沙门氏菌tolC突变菌株接种一日龄雏鸡导致鼠伤寒沙门氏菌攻击菌株的减少的脱落以及肝脏和脾脏组织的减少的定殖。然而，WO2006129090完全没有提及生殖道的定殖和蛋的污染。通过对产蛋鸡接种疫苗来保护抵抗蛋的污染的研究是有限的(Gantois I等人，2006)。活疫苗在家禽中的功效已经在实验和实地研究中进行了测试，但只有少数研究显示免疫接种对蛋的污染的部分保护作用(Miyamoto T等人，1999；Woodward MJ等人，2002；Nassar TJ等人，1994；Hassan JO等人，1997；Gantois I等人，2006)。

因此，尽管已经显示一些沙门氏菌疫苗在降低蛋的污染率方面具有部分效果，但是不能保证接种疫苗的鸡的蛋不含沙门氏菌。此外，疫苗生产者仅声称减少了粪便中细菌的脱落，而不是保护抵抗攻击感染或防止蛋的污染。

本发明提供一种沙门氏菌疫苗，其特异性地抵抗蛋的污染，并且不仅仅集中于减少脱落。本疫苗菌株的另一优点是其易于施用并且没有毒力逆转的风险，这与一些具有不确定突变的商业疫苗菌株相反。

发明概述

本发明的一个目的是提供一种沙门氏菌突变菌株，其在tolC基因内或在外排泵系统的一个或多个抗小结分裂(resistance-nodulation-division，RND)基因内具有至少一个遗传修饰。特别地，沙门氏菌突变菌株包含acrAB、acrEF和mdtABC基因中的一种或全部的遗传修饰或tolC基因的遗传修饰。优选地，遗传修饰是人工引入的遗传修饰，特别是导致基因失活，并且更特别是所述修饰是至少一部分所述基因的缺失，更特别是完整基因的缺失。

为了获得沙门氏菌突变菌株，如本文所定义的tolC和RND基因修饰能够应用于野生型沙门氏菌血清变型。本文定义和使用的沙门氏菌突变菌株包括肠道沙门氏菌和任何血清变型的肠道亚种，并且通常选自肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis或S.Enteritidis)，鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)，哈达尔沙门氏菌(S.Hadar)，魏尔肖沙门氏菌(S.Virchow)，婴儿沙门氏菌(S.infantis)，肯塔基沙门氏菌(S.Kentucky)，布雷登尼沙门氏菌(S.Bredeney)，阿哥拉沙门氏菌(S.Agona)，乙型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphiB)和鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)。在更具体的实施方案中，所述菌株是鼠伤寒沙门氏菌血清变型(Salmonella ser.Typhimurium)，肠炎沙门氏菌血清变型(Salmonellaser.Enteriditis)，婴儿沙门氏菌血清变型(Salmonella ser.Infantis)，或鸡沙门氏菌血清变型(Salmonella ser.Gallinarum)。

本发明的另一个目的是提供如本文所述的沙门氏菌突变菌株在制备疫苗中和/或用于预防或减少蛋中的沙门氏菌感染的用途。

在另一个实施方案中，本发明提供组合物，特别是疫苗，其包含本发明的沙门氏菌菌株和药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂，和任选佐剂。

另一个实施方案提供用作药物的本发明的沙门氏菌突变菌株或组合物。更具体地，本发明提供了这样的沙门氏菌突变菌株，例如，作为疫苗的一部分，其用于预防或抑制受试者中的沙门氏菌感染/定殖或由这样的感染引起的疾病和/或人中的沙门氏菌病，特别是用于预防或(显著)减少蛋中的沙门氏菌感染。另一个实施方案提供了本发明的突变菌株或组合物在治疗或预防沙门氏菌感染中的用途，特别是用于免疫家禽(特别是产蛋鸡)以抵抗沙门氏菌感染(由沙门氏菌感染引起的疾病或症状)。

本发明的另一个目的是提供一种治疗、预防、抑制和/或降低蛋中(内部)沙门氏菌感染风险的方法，以及一种免疫受试者以抵抗沙门氏菌病的方法，其包括给受试者施用本发明的沙门氏菌突变菌株或组合物。

本发明还包括通过用本文提供的沙门氏菌突变体免疫产蛋鸡来产生无沙门氏菌的蛋的方法。

附图的简要说明

图1：感染后3周用肠炎沙门氏菌S1400/94攻击的未接种疫苗的动物和在第1天、第6周和第16周用肠炎沙门氏菌147ΔtolC或肠炎沙门氏菌147ΔacrABacrEFmdtABC菌株接种的动物的脾脏(A)、盲肠(B)、输卵管(C)和卵巢(D)中在富集后沙门氏菌阳性样品的百分比。接种疫苗组和未接种疫苗的对照组之间阳性器官样品的百分比的统计学显著性差异(p<0.05)用星号标记。

图2：检测在第1天、第4周和第16周用肠炎沙门氏菌147ΔtolC或肠炎沙门氏菌147ΔacrABacrEFmdtABC接种的18周龄产蛋鸡的血清中的抗沙门氏菌LPS抗体的ELISA的OD值。截断OD值为0.55，并计算为从无沙门氏菌的鸡(对照组)的血清中获得的平均值加上五倍的标准偏差。

图3：在给一日龄肉鸡施用肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌tolC或acrABacrEFmdtABC(Δ7)缺失突变菌株后，对于这些菌株呈阳性的泄殖腔拭子的百分比。在生命的第一天给肉鸡接种肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌tolC缺失突变菌株或肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌acrABacrEFmdtABC缺失突变菌株。然后每周采集泄殖腔拭子以监测这些菌株的脱落。

图4：在给一日龄肉鸡施用后肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌tolC或acrABacrEFmdtABC(Δ7)缺失突变菌株的脾脏定殖。在生命的第一天给肉鸡接种肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌tolC缺失突变菌株或肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌acrABacrEFmdtABC缺失突变菌株。呈现的值是log₁₀CFU/g样品。在第7、21和36天取样。误差条代表平均值的标准偏差(SEM)。

图5：富集后对肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌tolC或acrABacrEFmdtABC(Δ7)缺失突变菌株呈阳性的脾和盲肠样品的百分比。在生命的第一天给肉鸡接种肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌tolC缺失突变菌株或肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌acrABacrEFmdtABC缺失突变菌株。

图6：TolC、acrA、acrB、acrD、acrF、acrE、mdsB、mdsA、mdtA、mdtB和mdtC编码序列。

图7：在生命的第35天口服接种10⁶CFU的鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)9R(SG9R)菌株或10⁶CFU的鸡沙门氏菌tolC(SG tolC)缺失突变菌株后的Lohman Brown产蛋鸡体重。用任一菌株处理的组由20只动物组成，图中所示的误差条代表平均值的标准偏差。

图8：用鸡沙门氏菌9R(SG9R)菌株或鸡沙门氏菌ΔtolC(SGtolC)菌株口服接种的Lohmann Brown产蛋鸡的脾脏和肝脏的尸检后的坏死病灶评分。在生命的第35天处理动物，收集肝脏和脾脏并在生命的第63天检查。如Matsuda等人(2011)所述测定坏死病灶评分。根据以下肉眼可见的结果确定脾脏的坏死病灶评分：评分0：无病灶，评分1：少于5个病灶，评分2：少于20个病灶，评分3：大于20个病灶。根据肉眼可见的结果确定肝脏中坏死病灶的评分：评分0：无病灶，评分1：少于3个病灶，评分2：少于10个病灶，评分3：大于10个病灶。水平条代表平均值和平均值的标准偏差。两组之间未观察到统计学上的显著差异。

图9：用10⁶CFU的鸡沙门氏菌9R(SG9R)菌株或10⁶CFU的鸡沙门氏菌tolC(SGtolC)缺失突变菌株口服接种后Lohman Brown产蛋鸡的脾脏和肝脏重量。在生命的第35天处理动物，收集肝脏和脾脏并在生命的第63天称重。水平条代表平均值和平均值的标准偏差。两组之间未观察到统计学上的显著差异。

图10：在实验性感染用CI培养物处理的肉鸡后第7日龄时，肠炎沙门氏菌(A&B)或鼠伤寒沙门氏菌(C&D)野生型菌株的盲肠(A&C)和脾脏(B&D)定殖。CI培养物在生命的第一天施用，并且由通过口服管饲法同时施用的10⁸CFU的肠炎沙门氏菌ΔacrAbacrEFmdtABC菌株和10⁸CFU的鼠伤寒沙门氏菌ΔacrAbacrEFmdtABC菌株组成。通过口服管饲法给鸡施用10⁵CFU的相应攻击菌株来在生命的第2天对鸡进行实验性感染。显示的值代表log10的CFU/g样品。水平线代表平均值，误差条代表平均值的标准偏差(SEM)。所有组中的样本数等于10。

发明描述

本发明涉及预防沙门氏菌感染、特别是生殖器官(例如输卵管、卵巢)中的沙门氏菌感染、以及甚至更特别是蛋中的沙门氏菌感染的方法。以前的研究表明，肠道定殖和生殖组织定殖之间的相关性尚不清楚，因为已经证明沙门氏菌是从感染禽类的生殖组织中分离出来的，而在肠道器官中是不存在的。因此，专注于减少粪便中细菌的脱落的现有的沙门氏菌疫苗不会不可避免地导致对生殖器官感染特别是(内部)蛋的污染的保护。

本发明基于以下发现：包含在tolC基因中或在外排泵系统的一个或多个抗小结分裂(RND)基因中具有遗传修饰的沙门氏菌的疫苗能够促进能够有效的免疫应答，其能够预防或减少随后的细菌感染和/或生殖器官的定殖，从而预防或减少向形成的蛋的垂直传播和形成的蛋的沙门氏菌污染。此外，已经证明所述沙门氏菌不能感染或定殖将其施用于的受试者的生殖道和蛋，或者至少显示出这样做的能力大大降低，因此细菌从提供了合适的局部免疫刺激的宿主中被清除。因此，所公开的方法和组合物不仅减少了禽类中的病原体感染，而且还显著降低了由产蛋禽类/鸡产生的蛋中病原体污染的发生率。

外排泵几乎存在于所有细菌物种中，编码这类蛋白质的基因能够位于染色体或质粒上。根据它们的组成、跨膜区的数量、能源和底物，细菌外排泵分类为五个家族：抗小结分裂(RND)家族、主要促进子超家族(MFS)、ATP(三磷酸腺苷)结合盒(ABC)超家族、小多药耐药性(SMR)家族(大得多的药物/代谢物转运蛋白(DMT)超家族的成员)以及多药和毒性化合物挤出(MATE)家族。除了仅在革兰氏阴性细菌中发现的RND超家族外，其他四个家族的外排系统(MFS、ABC、SMR和MATE)广泛分布于革兰氏阳性和阴性细菌中。Nishino K.等人(2006)的一项研究已经显示肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变型具有九种功能性药物外排泵(AcrAB、AcrD、AcrEF、MdtABC、MdsAB、EmrAB、MdfA、MdtK和MacAB)(参见Horiyama等人(2010)的图1)。这些在肠道沙门氏菌中的外排泵基于序列相似性分类为四个家族：主要促进因子(MF)家族(EmrAB和MdfA)；RND家族(AcrAB、AcrD、AcrEF、MdtABC和MdsAB)；多药和毒性化合物挤出(MATE)家族(MdtK)；和ATP结合盒(ABC)家族(MacAB)。TolC是参与铁载体输出的主要外膜通道，并且是多药耐药泵(MDR)的一部分。

本发明提供了沙门氏菌的突变菌株，其可用作诱导针对沙门氏菌的免疫保护的活疫苗或减毒疫苗，并且其特征在于它们预防或减少受试者中宿主组织(尤其是生殖器官，尤其是蛋和/或肉)的沙门氏菌感染和/或定殖。因此，人中沙门氏菌病的风险降低或消失。本发明的突变菌株的特征在于它们在tolC基因内或在一个或多个抗小结分裂(RND)基因(即acrAB、acrD、acrEF、mdtABC和mdsAB，尤其是acrAB、acrEF和mdtABC基因)内含有至少一个遗传修饰。因此，本发明提供了一种沙门氏菌菌株，其中引入了tolC基因内或acrAB、acrEF和mdtABC基因中的一种或多种内的至少一种遗传修饰。特别地，tolC突变体不包含一个或多个RND基因内的任何进一步的人工遗传修饰(例如缺失)。在进一步的实施方案中，acrAB、acrEF和mdtABC突变体包含未修饰的/完整的tolC基因和/或其他RND基因。

“遗传修饰”可以是所述基因中一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或取代。这种遗传修饰导致细菌的固有外排泵或基因功能的(总)降低。可以通过本领域技术人员已知的方法容易地测定细菌外排泵功能。例如，可以通过确定外排泵抑制剂对感兴趣的细菌菌株对包含抗生素的底物的易感性的影响来研究细菌外排泵功能的水平。在存在或不存在外排泵抑制剂的情况下，可通过抗生素对测试菌株的最小抑制浓度(MIC)测试来分析这种易感性。优选地，适合于根据本发明使用的细菌可以例如具有比可比较的野生型细菌至少50％更少的外排泵功能，优选至少75％更少的外排泵功能，更优选至少90％更少的外排泵功能，甚至更优选100％更少的外排泵功能。

具有失活基因的突变体或缺失突变体(完整基因或其(实质)部分的缺失)是优选的。可以使用任何已知技术将遗传修饰或突变引入微生物中。优选地，突变是缺失突变，其中基因的破坏是由核酸的切除引起的。或者，可以通过插入核酸或通过点突变引入突变。将突变引入特定区域的方法对于技术人员来说是明显的，并且优选使用Wanner和Datsenko(2000)描述的一步失活方法产生。能够应用其他方法来实现定点诱变(例如，使用自杀质粒)，然而一步失活方法通常被认为是实现敲除缺失突变体的最佳和最快的方式。

优选地，本发明的突变体含有tolC基因的(至少部分)缺失或外排泵系统的一个或多个RND基因(包括acrA、acrB、acrD、acrF、acrE、mdsB、mdsA、mdtA、mdtB或mdtC基因)的(至少部分)缺失。如本文所用，tolC、acrA、acrB、acrD、acrF、acrE、mdsB、mdsA、mdtA、mdtB和mdtC基因意在包括与在肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清变型菌株LT2(Salmonellaenterica subsp.enterica serovar Typhimurium str.LT2)(NCBI：NC_003197.1GI：16763390)中发现的相应的tolC、acrA、acrB、acrD、acrF、acrE、mdsB、mdsA、mdtA、mdtB和mdtC基因基本上相同(即至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和优选100％相同)的任何同源物或人工序列。在所述参考序列中，tolC基因的特征在于基因ID(Gene ID)：1254709并编码TolC外膜通道蛋白。acrA基因的特征在于基因ID：1251996，并编码AcrA吖啶外排泵。acrB基因的特征在于基因ID：1251995，并编码AcrB RND家族吖啶外排泵。acrD基因的特征在于基因ID：1254003，并编码AcrD RND家族氨基糖苷/多药外排泵。acrF基因的特征在于基因ID：1254914并编码AcrF多药外排蛋白。acrE基因的特征在于基因ID：1254913并编码AcrE多药外排蛋白。mdtA基因的特征在于基因ID：1253647并编码MdtA多药抗性蛋白。mdtB基因的特征在于基因ID：1253648并编码MdtB多药抗性蛋白。mdtC基因的特征在于基因ID：1253649，并编码MdtC多药抗性蛋白。mdsA基因的特征在于基因ID：1251871并编码MdsA阳离子外排系统蛋白。mdsB基因的特征在于基因ID：1251870并编码MdsB阳离子外排系统蛋白。图6中给出了tolC、acrA、acrB、acrD、acrF、acrE、mdsB、mdsA、mdtA、mdtB和mdtC基因基因的核酸序列(SEQ ID NO：1-11)。

使用商业上可获得的算法能够计算核酸和多肽序列的百分比同一性，所述算法将参考序列与查询序列进行比较。以下程序(由美国国家生物技术信息中心提供)可用于确定同源性/同一性：BLAST、gapped BLAST、BLASTN和PSI BLAST，其可使用默认参数。

在一个实施方案中，本发明包括与在肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清变型菌株LT2(NCBI：NC_003197.1GI：16763390)中发现的相应野生型序列相比，含有tolC基因缺失的沙门氏菌突变菌株。在另一个实施方案中，本发明包括与在肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清变型菌株LT2(NCBI：NC_003197.1GI：16763390)中发现的相应野生型序列相比，包含所有acrAB、acrEF和mdtABC基因的缺失的沙门氏菌突变菌株。

虽然任何血清变型的肠道沙门氏菌可用于产生突变菌株，但在优选的实施方案中，将修饰插入家禽中最常见的沙门氏菌血清变型中，包括属于血清群B的血清变型，例如阿哥拉沙门氏菌(S.Agona)，布雷登尼沙门氏菌(S.Bredeney)，乙型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi B)，鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)和鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)的单相菌株；血清群D的血清变型，例如肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)和鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)；和血清群C的血清变型，例如哈达尔沙门氏菌(S.Hadar)，魏尔肖沙门氏菌(S.Virchow)，婴儿沙门氏菌(S.infantis)和肯塔基沙门氏菌(S.Kentucky)。本发明还考虑了一种或多种突变菌株在一种组合物或疫苗中的组合(例如单-、二-、三或四联疫苗)。

在具体实施方案中，将所述修饰插入选自包含以下的组的沙门氏菌的种中：肠道沙门氏菌肠道亚种肠炎血清变型，肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清变型或肠道沙门氏菌肠道亚种婴儿血清变型。肠道沙门氏菌肠道亚种肠炎血清变型是血清群D1的血清变型。肠炎沙门氏菌是美国和欧洲最常见的血清变型。肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒血清变型是血清群B的血清变型。鼠伤寒沙门氏菌是一种广泛分布的血清变型，代表了在美国和欧洲从人类中分离出的第二常见的血清变型。肠道沙门氏菌肠道亚种婴儿血清变型是血清群C1的血清变型。婴儿沙门氏菌常见于鸡和肉鸡群中。

本文所用的“受试者”包括人或动物，特别是禽类，更特别是家禽，甚至更特别是鸡，尤其是产蛋鸡(laying hens(layers))、育种鸡和/或肉鸡。

“产蛋鸡”(“laying hen”或“egg-laying hen”)是主要用于产蛋的雌性鸡的常用术语，包括为产蛋而饲养的幼鸡。一些鸡被饲养用于提供肉(称为“肉”鸡)，而其他鸡主要被饲养用于提供蛋(用于人类食用)。饲养产蛋鸡是与饲养用于提供肉的鸡不同的过程。肉鸡通常需要不到六周的时间来达到屠宰大小，而大多数产蛋鸡在被新鸡群更换之前会被饲养一至三个产蛋周期(至多200周)。产蛋鸡通常在20周龄左右开始产蛋。产蛋鸡饲料被配制用于生产食用蛋(用于人类消费的蛋)的鸡。肉鸡饲料被配制用于生产孵化蛋的那些鸡(“育种鸡”)。饮食基本相同，但育种鸡饮食通常含有略微更多的蛋白质，并加强了额外的维生素，以促进胚胎的正常发育。

在具体实施方案中，本发明的沙门氏菌突变菌株用作减毒活疫苗。众所周知，减毒活微生物是高效疫苗；这种疫苗引发的免疫应答通常比非复制型免疫原产生的免疫应答的幅度更大，持续时间更长。对此的一种解释可能是减毒活菌株在宿主中建立有限的感染并模拟自然感染的早期阶段。此外，与经杀死的制剂不同，活疫苗通常更强效地诱导粘膜免疫应答和细胞介导的应答，这可能与它们分别在上皮细胞和抗原呈递细胞(例如巨噬细胞)中复制的能力有关。然而，对使用减毒活疫苗的安全性仍存在担忧。还可能存在减毒菌株恢复毒力的风险，因此有可能在接种疫苗的动物中引起疾病和流产。然而，证明了本发明的突变菌株是安全的(没有临床症状并且不能持续定殖宿主)并且不会恢复毒力。

本发明的一个目的是提供本发明的沙门氏菌突变菌株用于制备药物的用途，所述药物用于预防和/或治疗动物、特别是家禽、特别是鸡、甚至更特别是产蛋鸡中的沙门氏菌感染。在优选的实施方案中，本发明提供用作药物的如本文所定义的沙门氏菌突变菌株。特别地，本发明包括用于防止蛋的污染的如本文所述的沙门氏菌突变菌株(其用途)。由经免疫的鸡产生的鸡蛋基本上不含沙门氏菌。值得注意的是，本发明的突变菌株已显示出显著减少生殖器官的定殖。输卵管能够细分为五个功能区域。从卵巢开始，有漏斗状部、头状部、峡部、子宫和阴道。漏斗状部捕获排卵卵泡，头状部产生蛋清，峡部沉积蛋壳膜，子宫形成蛋壳，而阴道参与产蛋。定殖于输卵管的沙门氏菌可掺入到蛋清、蛋壳膜或蛋壳本身中，这取决于定殖部位(分别是头状部、峡部和子宫)。虽然从蛋黄和蛋清中均已分离出SE，但是根据几项研究，蛋清最常被污染，指向输卵管组织作为定殖部位。然而，一些研究发现蛋黄受到主要污染，这表明卵巢是主要的定殖部位(Gantois等人，2009)。因此，本发明的一个目的是提供用于预防或减少输卵管组织和/或卵巢的定殖/感染的沙门氏菌突变菌株。

在另一个实施方案中，沙门氏菌突变菌株用于制备(药物)组合物，特别是疫苗，其可以通过肠胃外、粘膜或口服途径施用至受试者。活疫苗能够使用本领域已知的方法生产，并且通常包括(药学上)可接受的赋形剂、载体或稀释剂，和任选佐剂。

本发明提供一种抗沙门氏菌蛋的感染的药物组合物或疫苗，其包含：

-一种或多种根据本发明的突变菌株；和

-药学上可接受的载体或稀释剂。

所用的特定药学上可接受的载体或稀释剂对本发明而言不是关键的，并且是本领域常规的。稀释剂的实例包括：用于缓冲胃中的胃酸的缓冲剂，例如含有蔗糖的柠檬酸盐缓冲液(pH7.0)，单独的碳酸氢盐缓冲液(pH7.0)，或含有抗坏血酸、乳糖和任选阿斯巴甜的碳酸氢盐缓冲液(pH7.0)。载体的实例包括：蛋白质，例如在脱脂乳中发现的蛋白质；糖，例如蔗糖；或聚乙烯吡咯烷酮。

所用的具体佐剂对本发明而言不是关键的，并且是本领域常规的。佐剂的实例包括但不限于，张力活性化合物(例如Quil A)，矿物盐(例如氢氧化铝)，微生物衍生的佐剂(例如胞壁酰二肽)，水包油和油包水乳剂(如弗氏不完全佐剂)，颗粒抗原递送系统(如脂质体，聚合物气氛，纳米珠，ISCOM和ISCOMATRIX)，多糖(如微粒菊粉)，基于核酸的佐剂(如CpG基序)，细胞因子(如白细胞介素和干扰素)，Toll样受体激活剂和eurocine L3en N3佐剂。

如本领域技术人员已知的，剂量或量根据施用途径而变化。本领域技术人员可以发现，肠胃外施用的疫苗的有效(免疫)剂量可以小于通过饮用水施用的类似疫苗等。本领域技术人员能够确定和优化制剂中需要存在的微生物的数量。然而，通常，受试者可在单一剂量单位中施用大约10⁴-10¹⁰的菌落形成单位(CFU)，优选10⁵-10⁹CFU，并且更优选在单一剂量单位中施用10⁷-10⁹CFU。

如本文先前早已提到的，本发明的突变菌株和疫苗组合物可通过已知技术制备。

特定的肠道沙门氏菌微生物的选择能够由技术人员进行而无需过多的实验。优选的微生物选自肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis或S.Enteritidis)，鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)，哈达尔沙门氏菌(S.Hadar)，魏尔肖沙门氏菌(S.Virchow)，婴儿沙门氏菌(S.infantis)，肯塔基沙门氏菌(S.Kentucky)，布雷登尼沙门氏菌(S.Bredeney)，阿哥拉沙门氏菌(S.Agona)，乙型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi B)和鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)。在一个实施方案中，微生物是鼠伤寒沙门氏菌；更特别是鼠伤寒沙门氏菌菌株112910a(Van Parys等人，2012；De Cort等人，2014)。在另一个实施方案中，微生物是肠炎沙门氏菌；更特别的是肠炎沙门氏菌菌株147(Methner等人，1995；Bohez等人，2008；DeCort等人，2013)。在更进一步的实施方案中，微生物是婴儿沙门氏菌或鸡沙门氏菌。在本发明的具体实施方案中，突变菌株是鼠伤寒沙门氏菌菌株112910a或肠炎沙门氏菌菌株147的tolC缺失突变体或acrABacrEFmdtABC缺失突变体。

如本文所述的沙门氏菌突变菌株特别可用作疫苗，特别是为了(用于为了实现以下目的的方法)预防或(显著)减少宿主组织的沙门氏菌感染和/或定殖和/或由此所述突变菌株能够预防或减少(内部)蛋的污染。另一个实施方案提供了本发明的组合物或疫苗，其用于免疫鸡，特别是产蛋鸡和肉鸡，以抵抗沙门氏菌感染。本发明的另一个目的是提供一种治疗、减少或预防沙门氏菌感染的方法，该方法包括将本文提供的沙门氏菌突变菌株或本发明的组合物或疫苗施用于有需要的受试者。

此外，本发明涉及通过使用沙门氏菌突变菌株和本文提供的方法减少或预防人的沙门氏菌病(例如肠胃炎、呕吐、发热)。换言之，本发明涉及沙门氏菌突变菌株用于预防或减少蛋的污染的用途，例如，通过免疫或接种鸡以减少生殖组织的定殖。通过这种方法，蛋的污染受到限制或不存在，并因此人中沙门氏菌病的风险和/或食源性沙门氏菌感染的数量也受到限制或不存在。因此，本发明的方法特别适用于生产无沙门氏菌的蛋。

在具体实施方案中，鸡沙门氏菌突变菌株的特征在于其在tolC基因内或在一个或多个抗小结分裂(RND)基因(即acrAB、acrD、acrEF、mdtABC和mdsAB，尤其是acrAB、acrEF和mdtABC基因)内含有至少一个遗传修饰。所述鸡沙门氏菌突变菌株特别适用于保护产蛋鸡或肉鸡抵抗家禽伤寒(一种严重的败血症)，特别是抵抗临床疾病和鸡沙门氏菌的内脏器官定殖。临床症状包括厌食、腹泻、贫血、产蛋率下降，但主要问题是其在雏鸡和成年鸡中均能够诱发高死亡率。

已经认识到，有效(免疫)剂量的施用可以通过单次施用(即施用单剂量疫苗，所述剂量构成有效剂量)或通过多次施用(即施用两个或更多个剂量疫苗，所述两个或更多个剂量疫苗联合构成有效剂量)来实现。使用疫苗的多次施用(例如初次剂量，然后是一次、两次或更多次加强剂量)是众所周知的，特别是在活疫苗的情况下，因此是本发明的实施方案。

本发明的菌株或组合物的口服施用可以通过接种(例如通过口服管饲法)或通过在饮用水中施用来实现。在一个实施方案中，本发明涉及包含如本文所述的沙门氏菌突变体的(家禽)食物。作为其口服施用的替代方案，可以通过注射向受试者施用适当配制的菌株或组合物。特别地，根据本发明的菌株或组合物可以通过肌内注射、皮内注射、皮下注射或静脉内注射施用。用于制备可注射疫苗的制剂是本领域技术人员熟知的。

根据本发明的菌株或组合物也可以通过吸入施用，例如通过鼻内喷雾施用。通过鼻吸入提供疫苗是众所周知的，并且这种施用可能是优选的，因为它没有与注射疫苗接种相关的许多不良作用(例如注射疼痛和对消毒设备的要求)。可用于制备根据本发明的疫苗的合适的鼻喷雾制剂是本领域技术人员已知的。

还已经表明，可以通过使用全身喷雾剂将有效免疫剂量的疫苗施用至家禽。已经发现以这种方式的气溶胶免疫适合于产生全身免疫应答，而不仅仅是与呼吸道相关的应答。

本文提供的突变菌株能够是包含分配装置和(免疫学)有效量的疫苗菌株的疫苗接种试剂盒的一部分。分配装置优选适用于喷雾、气溶胶输送或滴眼液。

通过参考附图，将在以下实施例和实施方案中进一步详细描述本发明。具体实施方案和实施例不以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。此处给出的关于肠炎沙门氏菌血清变型的实施例的基本原理同样适用于感染家禽的其他肠道沙门氏菌血清变型，例如鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)，哈达尔沙门氏菌(S.Hadar)，魏尔肖沙门氏菌(S.Virchow)，婴儿沙门氏菌(S.infantis)，肯塔基沙门氏菌(S.Kentucky)，布雷登尼沙门氏菌(S.Bredeney)，阿哥拉沙门氏菌(S.Agona)，乙型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi B)和鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)。

实施例

实施例1：用肠炎沙门氏菌ΔtolC和ΔacrABacrEFmdtABC突变体口服接种产蛋鸡后预防肠炎沙门氏菌的蛋的污染

材料和方法

疫苗和攻击菌株

疫苗菌株ΔtolC和ΔacrABacrEFmdtABC是肠炎沙门氏菌147噬菌体4型的确定突变体。野生型菌株147最初从蛋清中分离并且对链霉素具有抗性。已知该菌株定殖肠和内脏到高水平(Methner，al-Shabibi等人，1995，Bohez，Dewulf等人，2008)。根据Datsenko和Wanner(Datsenko和Wanner，2000)先前描述的一步失活方法构建所有突变。

将攻击和疫苗菌株在37℃在Luria Bertani(LB)培养基(Sigma，ST.Louis，MO，USA)中温和搅拌孵育过夜。为了测定细菌滴度，将10倍稀释液涂布在用于攻击菌株的亮绿琼脂(BGA，Oxford，Basingstoke，Hampshire，UK)上。将疫苗菌株涂布在补充有1％乳糖、1％酚红和100μg/ml链霉素的LB上以测定滴度。将疫苗和攻击菌株在HBSS(Hanks平衡盐溶液，Invitrogen，Paisley，England)中稀释至10⁸cfu/ml。

实验禽类

将九十(90)日龄的Lohmann Brown产蛋鸡(De Biest，Kruishoutem，Belgium)随机分成3组，并分别饲养在不同的单元中。实施商业供应商提供的照明计划。无限制地提供商业饲料和饮用水。本研究中的动物实验遵循实验室动物护理和使用的机构指南，并得到比利时根特大学兽医学院伦理委员会的批准(EC2013/135)。在翼静脉中使用过量的戊巴比妥钠进行安乐死。

实验设置

在出生当天、6周龄和16周龄时通过含有10⁸cfu肠炎沙门氏菌147ΔtolC(第1组)或肠炎沙门氏菌147ΔacrABacrEFmdtABC(第2组)的0.5ml的作物滴注来口服免疫两个不同组(n＝30)。第三组禽(n＝30)保持未免疫，但沙门氏菌攻击阳性对照(第4组)。在18周龄时，采集血清样品用于在LPS-ELISA(Desmidt，Ducatelle等人，1996)中定量抗肠炎沙门氏菌和抗鼠伤寒沙门氏菌抗体。同时，在每组中采集泄殖腔拭子并在细菌学上分析疫苗菌株的存在。在21周龄时，所有鸡都处于产蛋状态，在3周内每天收集蛋用于细菌检测蛋内容物中的疫苗菌株。在24周龄时，将所有动物在翼静脉中静脉内接种含有5×10⁷cfu的肠炎沙门氏菌菌株S1400/94的0.5ml。该方案已用于产生高水平的内部蛋的污染(De Buck，VanImmerseel等人，2004，Gantois，Ducatelle等人，2006)。在3周期间收每天集蛋并分析攻击菌株的存在。在攻击接种后三周，通过翼静脉中过量给药的戊巴比妥对所有动物实施安乐死。无菌取出脾脏、输卵管、卵巢、子宫和盲肠的样品用于攻击和疫苗菌株细菌的细菌定量。

ELISA以定量抗LPS抗体

使用先前描述的间接ELISA方案(Desmidt等人，1996)分析在第18周采集的血清样品中抗沙门氏菌LPS抗体的水平。用100μl的在0.05M碳酸盐-碳酸氢盐(pH 9.6；包被缓冲液)中的LPS溶液(10μg/ml)包被四个96孔板(Sigma，St.Louis，MO，USA)，并在4℃孵育24小时。从肠炎沙门氏菌PT4菌株76Sa88和鼠伤寒沙门氏菌菌株742Sa91中纯化LPS。在每个步骤之间用补充有0.1％Tween-20(Sigma，St.Louis，MO，USA；洗涤缓冲液)的磷酸盐缓冲盐水(PBS，Sigma，St.Louis，MO，USA)冲洗平板四次。在第一步中，将补充有1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma，St.Louis，MO，USA；封闭缓冲液)的100μl PBS(Sigma，St.Louis，MO，USA)加入孔中在37℃孵育1小时。然后除去封闭缓冲液。第二，将来自不同组的动物的血清样品在封闭缓冲液(1:200)中稀释并加入到板(100μl)中。使用来自无沙门氏菌的鸡的血清作为阴性对照。来自实验性感染肠炎沙门氏菌PT4菌株76Sa88的鸡的血清用作阳性对照。使板在37℃振荡2小时。第三，将过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG(100μl，Sigma，St.Louis，MO，USA)在封闭缓冲液中稀释(1:2000)，并在37℃振荡的同时加入孔中孵育1小时30分钟。最后，向孔中加入50μl TMB底物(Fisher Scientific，Erembodegem，Belgium)。当开始出现蓝色时，用50μl硫酸(0.5M)阻止反应。通过ELISA酶标仪在450nm下测量吸光度。每个样品一式两份进行分析。截断OD值计算为从无沙门氏菌的鸡(未接种疫苗的禽)的血清中获得的平均值加上标准偏差的五倍(OD＝0.55)。

被攻击的禽类的细菌学检查

将在第18周采集的泄殖腔拭子在37℃在缓冲的蛋白胨水(BPW，Oxoid，Basingstoke，Hampshire，UK)中孵育过夜。然后将接种环(loopful)涂布在补充有1％乳糖、1％酚红和100μg/ml链霉素(Sigma，St.Lous，MO，USA)的LB平板上，用于检测肠炎沙门氏菌147ΔtolC和ΔacrABacrEFmdtABC疫苗菌株。

将盲肠、脾、卵巢、输卵管和子宫的样品在BPW(10％重量/体积悬浮液)中匀浆，并在HBSS(Invitrogen，Paisley，England)中制备10倍稀释液。将六滴20μl的每种稀释液铺板在BGA(用于定量攻击菌株)或补充有1％乳糖、1％酚红和适当抗生素的LB(用于疫苗定量)上。在37℃孵育过夜后，通过计数适当稀释的细菌菌落数来确定cfu/g组织的数。将在直接铺板后就攻击菌株测试为阴性的样品通过在37℃过夜孵育预富集在连四硫酸盐亮绿色肉汤(Oxoid，Basingstoke，UK)中。孵育后，将连四硫酸盐亮绿色肉汤的接种环铺板在BGA上。

产蛋量和蛋的细菌学检查

从第18周起每天收集蛋，持续6周，并测定产蛋量。每天，将每组六只鸡的蛋合并成一批，产生在1到6之间变化的每批蛋数量。收集后，随后使用卢戈溶液和95％乙醇对蛋壳表面进行去污染。在对蛋壳进行去污染后，将蛋在无菌条件下破碎，合并每批蛋的总内容物并均质化。加入40ml体积/蛋的BPW至合并的蛋内容物中，并在37℃孵育48小时。为了检测疫苗菌株，将BPW肉汤接种环铺板在补充有1％乳糖、1％酚红和100μg/ml链霉素的LB平板上。为了检测攻击菌株，将BPW肉汤接种环铺板在BGA上。另外，在37℃在连四硫酸盐亮绿色培养液中进一步富集过夜，并且在孵育后，将肉汤培养物接种环划线到BGA上。

统计分析

GraphPad Prism 5软件用于统计分析。对盲肠、脾、卵巢、输卵管和子宫的cfu沙门氏菌/克组织的数据进行对数转换，并通过单因素方差分析检验随后Dunnet事后检验进行分析，以确定各组之间的差异。富集后，样品分为阳性或阴性。Fisher精确检验用于确定显著差异。泄殖腔拭子和蛋批次被分类为阳性或阴性。同样，还进行了Fisher精确检验以确定显著差异。对于所有检验，p值低于0.05的差异被认为是统计学上显著的。

结果

血清中的抗沙门氏菌LPS抗体的检测

来自LPS-ELISA的数据显示在用肠炎沙门氏菌147ΔtolC和肠炎沙门氏菌147ΔacrABacrEFmdtABC菌株接种的动物组中分别是30只鸡中有26只鸡和30只鸡中有19只鸡含有抗沙门氏菌LPS抗体(图2)。

就疫苗菌株的存在分析泄殖腔拭子和蛋

在接种肠炎沙门氏菌147ΔtolC和肠炎沙门氏菌147ΔacrABacrEFmdtABC菌株的组中均未发现泄殖腔拭子呈阳性。未接种疫苗的对照组中没有拭子呈阳性。从蛋内容物样品中没有分离出疫苗菌株。

攻击后的临床症状和产蛋量

在整个实验中，任一组中的饲料和水摄入量均未减少。未接种疫苗的对照组感染后的产蛋率在感染后(pi)第一周下降至59％，在感染后第二周和第三周时上升至75％和86％。接种疫苗组的产蛋率也有所下降。没有检测到显著差异。用ΔtolC菌株接种的组中的产蛋百分比分别为感染后第一、第二和第三周的60％、100％和90％，ΔacrABacrEFmdtABC菌株分别为56％、70％、68％。在感染的第一周，有些蛋有薄壳和畸形。在实验结束时，由于同类相残，在接种肠炎沙门氏菌147ΔacrABacrEFmdtABC菌株的动物组中有11只鸡死亡。

从蛋内容物中分离攻击菌株

在整个3周的随访期间，与接种疫苗的动物相比，未接种疫苗的鸡产下的沙门氏菌阳性蛋明显更多。在直接铺板后，对照组中三个蛋批次为沙门氏菌阳性，而来自疫苗菌株的批次为阴性。对于用肠炎沙门氏菌147ΔtolC和肠炎沙门氏菌147ΔacrABacrEFmdtABC菌株接种的动物，未检测到单个阳性蛋批次。在感染后第3周没有发现阳性蛋批次。

表1：未接种疫苗的动物和在第1天、第6周和第16周用肠炎沙门氏菌147ΔtolC或肠炎沙门氏菌147ΔacrABacrEFmdtABC菌株接种的动物中在感染后两周期间对于攻击菌株肠炎沙门氏菌S1400/94呈阳性的蛋内容物批次的百分比。在BPW中孵育蛋内容物(48小时，37℃)后显示结果。括号内的结果显示在连四硫酸盐亮绿色肉汤中富集后呈阳性的批次百分比(37℃，过夜)。不同的上标表明各组之间的显著差异(p<0.05)。

在感染后3周从器官中分离攻击菌株

没有样品在直接铺板中呈阳性。在子宫中未观察到沙门氏菌定殖的显著差异(数据未显示)。图1显示了感染后3周用肠炎沙门氏菌S1400/94攻击的未接种疫苗的动物和在第1天、第6周和第16周用肠炎沙门氏菌147ΔtolC或肠炎沙门氏菌147ΔacrABacrEFmdtABC菌株接种的动物的脾脏、盲肠、输卵管和卵巢中在富集后沙门氏菌阳性样品的百分比。与对照组相比，肠炎沙门氏菌147ΔtolC和ΔacrABacrEFmdtABC菌株接种均显著降低了中脾、盲肠、输卵管和卵巢中沙门氏菌阳性样品的数量。此外，在ΔacrABacrEFmdtABC接种组中，输卵管中沙门氏菌阳性样品的数量显著低于接种ΔtolC的组。

实施例2：肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌tolC和acrABacrEFmdtABC缺失突变体可安全用作肉鸡的活疫苗菌株

材料与方法

鸡

一日龄的Ross肉鸡从当地的孵化场获得并隔离饲养。在容器的单独空间中在刨花上饲养实验组。无限制地提供商业饲料和饮用水。实验是在比利时根特大学兽医学院伦理委员会的许可下进行的。

疫苗菌株

肠炎沙门氏菌147Strep^R(SE147)是最初从蛋清中分离的充分表征的菌株，并且用于产生缺失突变体(Methner等人1995；Methner等人1995；Bohez等人2008)。最初从猪粪样品中分离的鼠伤寒沙门氏菌菌株112910a的自发萘啶酸抗性突变体(Van Parys等人，2012)用于产生其他缺失突变体。先前已经证明这种抗生素抗性对体内结果没有影响(Barrow等人，1987)。使用Datsenko和Wanner描述的一步失活方法(Datsenko和Wanner 2000；Bohez等人2006)进行tolC基因的缺失或acrAB、acrEF和mdtABC基因的缺失。这产生了肠炎沙门氏菌Strep^R tolC缺失突变体，肠炎沙门氏菌147Strep^R acrAbacrEFmdtABC缺失突变体，鼠伤寒沙门氏菌Nal^R tolC缺失突变体和鼠伤寒沙门氏菌Nal^R acrAbacrEFmdtABC缺失突变体。

实验设计

分析肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌ΔtolC或ΔacrAbacrEFmdtABC突变菌株在肉鸡中的定殖模式：安全性评估。将120只一日龄鸡分成2组，每组60只，各自饲养在2.4m²的容器中。一组通过口服管饲法给予含有2×10⁸CFU/ml肠炎沙门氏菌ΔtolC菌株和2×10⁸CFU/ml鼠伤寒沙门氏菌ΔtolC菌株的0.5ml混合物。另一组通过口服管饲法给予含有2×10⁸CFU/ml肠炎沙门氏菌ΔacrAbacrEFmdtABC菌株和2×10⁸CFU/ml鼠伤寒沙门氏菌ΔacrAbacrEFmdtABC菌株的0.5ml混合物。为了评估缺失突变菌株的定殖，在第7、21和36天测定了20只动物的缺失突变菌株在盲肠和脾脏中的数量。在实验期间通过对第2、9、16、23和30天采集的泄殖腔拭子进行细菌学分析来评估菌株的脱落。

细菌学分析

将泄殖腔拭子直接接种于含有20μg/ml萘啶酸(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)或100μg/ml链霉素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的Lysogeny Broth(LB)平板上。直接接种后呈阴性的样品在缓冲的蛋白胨水(BPW，Oxoid，Basingstoke，England)中预富集，并在37℃孵育过夜。将1ml该悬浮液通过加入9ml连四硫酸盐-亮绿色肉汤(Merck，Darmstadt，Germany)进一步富集。在37℃孵育过夜后，将该悬浮液铺板在补充有适当抗生素的LB平板上。将盲肠和脾脏样品在BPW中匀浆，并在HBSS中制备10倍稀释液。将六滴20μl的每种稀释液铺板在补充有20μg/ml萘啶酸或100μg/ml链霉素的LB平板上。在37℃孵育过夜后，通过计数平板上细菌菌落的数量来确定CFU/g组织的数。如上文所述富集阴性样品。

结果

给一日龄肉鸡施用肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌tolC缺失突变体和肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌acrABacrEFmdtABC缺失突变体没有在动物中诱导临床症状。在用肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌tolC缺失突变体处理的组中，2只动物死亡，而在用肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌acrABacrEFmdtABC缺失突变体处理的组中5只动物死亡。这与饲养肉鸡时的平均死亡率(5％)没有显著差异。(GraphPad Prism 5软件用于统计分析。Fisher精确检验(单侧)用于分析不同治疗组内的死亡率。)

如图3所示，接种疫苗后一天采集的几乎所有泄殖腔拭子均为阳性。然而，脱落迅速下降，在第16天，只有有限数量的动物脱落了tolC缺失菌株，并且从第23天开始没有动物脱落任何缺失突变菌株。

在第7、21或35天直接铺板后，在盲肠中未检测到任何菌株。然而，在第7天，tolC和acrABacrEFmdtABC缺失突变菌株在脾脏中定殖，并且acrABacrEFmdtABC缺失突变菌株在第21天仍定殖于脾脏(图4)。然而，到屠宰日龄(最早在第36天)时，在脾脏或盲肠中不再能够发现肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌tolC以及肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌acrABacrEFmdtABC缺失突变菌株。

盲肠和脾脏样品的富集证实了这些发现(图5)，因为在第7天可以在高百分比的动物的脾脏中发现tolC和acrABacrEFmdtABC缺失突变菌株，并且acrABacrEFmdtABC缺失突变菌株在第21天仍定殖于脾脏。然而，到第36天，没有任何菌株仍可在任何动物的脾脏中发现。此外，tolC和acrABacrEFmdtABC缺失突变菌株只能在少量盲肠中在富集后发现，并且在屠宰日龄时没有盲肠对任何缺失突变菌株呈阳性。

这些结果表明肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌tolC缺失突变体以及肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌acrABacrEFmdtABC缺失突变体都可安全用于肉鸡，并且它们在屠宰日龄时被清除。因此，这些菌株能够用作肉鸡的活疫苗菌株。

实施例3：评估鸡沙门氏菌tolC缺失突变菌株用作提供对家禽中沙门氏菌感染的保护的疫苗菌株的安全性

材料与方法

鸡

一日龄的Lohmann Brown产蛋鸡是从当地孵化场获得的，并隔离饲养。在2.4m²的容器的单独空间中在刨花上饲养实验组。无限制地提供商业饲料和饮用水。实验是在比利时根特大学兽医学院伦理委员会的许可下进行的。

疫苗菌株

鸡沙门氏菌菌株9(SG9)用于产生缺失突变体。该菌株最初在英国分离(VanImmerseel等人，2013)。使用Datsenko和Wanner描述的一步失活方法(Datsenko和Wanner，2000；Bohez等人，2006)进行tolC基因的缺失。这产生了鸡沙门氏菌tolC缺失突变体。此外，本研究还使用了鸡沙门氏菌9R(SG9R)。该菌株在实践中经常用于控制家禽中的鸡沙门氏菌感染(Van Immerseel等人，2013)，并且用作对照菌株以比较鸡沙门氏菌tolC缺失突变菌株。

实验设计

将40只一日龄产蛋鸡随机分成两组，每组20只鸡，并分别饲养在不同的空间内。将它们饲养5周，直到动物为35日龄。在生命的第35天，第一组中的所有动物口服接种含有10⁶CFU/ml鸡沙门氏菌tolC缺失突变体的1ml混合物。另一组口服接种含有10⁶CFU/ml SG9R菌株的1ml混合物。监测动物的体重四周，当动物为63日龄(9周)时，从肝脏和脾脏取样，通过细菌学分析评估鸡沙门氏菌tolC缺失突变菌株和SG9R菌株的定殖。还进行了肝脏和脾脏的尸检，如Matsuda等人所述对肝脏和脾脏中的增大和坏死病灶进行评分。(Matsuda等人，2011)。此外，还测定了肝脏和脾脏的重量。

细菌学分析

将肝脏和脾脏样品在缓冲的蛋白胨水(BPW，Oxoid，Basingstoke，England)中匀浆，并在Hank平衡盐溶液(HBSS，Invitrogen，Paisley，England)中制备10倍稀释液。将六滴20μl的每种稀释液铺板在补充有20μg/ml萘啶酸或100μg/ml链霉素的Lysogeny Broth(LB)平板上。在37℃孵育过夜后，通过计数平板上细菌菌落的数量来确定CFU/g组织的数。通过向在BPW中均化的1ml样品中加入9ml连四硫酸盐-亮绿色肉汤(Merck，Darmstadt，Germany)来富集阴性样品。在37℃孵育过夜后，将该悬浮液铺板在补充有适当抗生素的LB平板上。

统计分析

GraphPad Prism软件(版本5.0，GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA)用于获得的数据的统计分析。Mann-Whitney检验用于分析两组之间的体重差异以及增大评分和坏死病灶评分的差异。

结果

将鸡沙门氏菌tolC缺失突变体或鸡沙门氏菌9R菌株施用至5周龄产蛋鸡不会在动物中诱导临床症状。在实验期间没有动物死亡，表明与野生型鸡沙门氏菌菌株相比，两种菌株均是显著减毒的。

接种疫苗前(第35天)产蛋鸡的平均体重在各组之间没有显著差异(图7)。在用SG9R菌株或鸡沙门氏菌tolC缺失突变体口服接种后，在实验期间除了在第51天时两组之间存在统计学显著差异之外，两组之间没有观察到统计学显著差异。然而，这种差异很可能是由于动物在不同的空间饲养，因为这是唯一可以观察到差异的日子，并且用鸡沙门氏菌ΔtolC菌株处理的组中动物的平均体重在整个实验过程中甚至在治疗之前趋于更低。

当比较不同处理组之间脾脏的坏死病灶评分时，两组之间未观察到统计学上显著的差异(图8)。在两组中，只有一个肝脏有超过10个病灶。没有其他肝脏可以观察到坏死病灶。因此，两组之间肝脏坏死病灶评分没有统计学上的显著差异(图8)。

当比较用SG9R或鸡沙门氏菌ΔtolC菌株处理的产蛋鸡的肝脏和脾脏的平均重量时，未观察到统计学上显著的差异(图9)。此外，当比较肝脏和脾脏的增大评分时，没有观察到统计学上显著的差异。用SG9R菌株处理的组中的所有脾脏和肝脏得到等于零的评分，而在鸡沙门氏菌ΔtolC菌株处理组中一个脾脏得到等于1的评分，并且一个脾脏得到2的评分。用鸡沙门氏菌ΔtolC菌株处理的组中的一个肝脏评分等于2。然而，当比较两组时，这些差异在统计学上并不显著。

在样品的细菌学分析后，即使在富集后，在肝脏或脾脏中也未检测到SG9R和鸡沙门氏菌tolC缺失突变菌株，表明如果在生命的第35天施用菌株，它们在施用后4周内从接种疫苗的产蛋鸡中清除。

这些结果表明，鸡沙门氏菌tolC缺失突变体至少与常用的SG9R菌株一样安全，因为两种菌株之间的毒力没有统计学上的显著差异。因此，鸡沙门氏菌ΔtolC菌株能够用作产蛋鸡的活疫苗菌株。

实施例4：肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌ΔacrABacrEFmdtABC突变菌株组成的培养物提供的抵抗实验性肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌感染的保护：效力评估

材料与方法

鸡

一日龄Ross 308肉鸡从当地孵化场获得并隔离饲养。在容器的单独空间中在刨花上饲养实验组，同时无限制地提供商业饲料和饮用水。在接种沙门氏菌菌株后，每天检查鸡的临床症状。实验是在比利时根特大学兽医学院伦理委员会的许可下进行的。

沙门氏菌菌株

肠炎沙门氏菌147strepR(SE147)是最初从蛋清中分离的充分表征的菌株，并用于产生缺失突变体(Methner等人，1995a；b；Bohez等人，2008)。最初从猪粪样品中分离的鼠伤寒沙门氏菌菌株112910a的自发萘啶酸抗性突变体(Van Parys等人，2012)用于产生鼠伤寒沙门氏菌缺失突变体。先前已显示该抗生素抗性对体内结果没有影响(Barrow等人，1987)。使用Datsenko和Wanner描述的一步失活方法(Datsenko和Wanner，2000；Bohez等人，2006)进行tolC基因的缺失或acrAB、acrEF和mdtABC基因的缺失。这产生了肠炎沙门氏菌strepRtolC缺失突变体，肠炎沙门氏菌147strepR acrABacrEFmdtABC缺失突变体，鼠伤寒沙门氏菌nalR tolC缺失突变体和鼠伤寒沙门氏菌nalR acrABacrEFmdtABC缺失突变体。肠炎沙门氏菌菌株76Sa88nalR是一种充分表征的萘啶酸抗性菌株，其最初从家禽饲养场分离(VanImmerseel等人，2002)并且在本研究中用作攻击菌株。鼠伤寒沙门氏菌MB2136(一种最初从猪中分离的链霉素抗性野生型菌株(De Cort等人，2015))也用作本研究中的攻击菌株。

实验设计

将40只一日龄鸡分成4组，每组10只，各自饲养在1.2平方米的容器中。在实验的第1天，通过口服管饲法将含有2×10⁸CFU/ml肠炎沙门氏菌ΔacrAbacrEFmdtABC菌株和2×10⁸CFU/ml鼠伤寒沙门氏菌ΔacrAbacrEFmdtABC菌株的0.5ml混合物给予两组。在实验的第一天，通过口服管饲法给另外两组给予0.5ml Hank平衡盐溶液(HBSS，14175053，Invitrogen，Paisley，England)作为对照。在实验的第二天，通过口服管饲法给一个对照组和用CI混合物处理的一组给予含有2×10⁵CFU/ml肠炎沙门氏菌76Sa88nalR攻击菌株的0.5ml溶液，而另外两组通过口服管饲法给予含有2×10⁵CFU/ml鼠伤寒沙门氏菌MB2136streptR攻击菌株的0.5ml溶液进行攻击。为了评估攻击菌株的定殖，在实验的第7天测定它们在盲肠和脾脏中的数量。通过在第3天和第7天采集的泄殖腔拭子的细菌学分析来评估攻击菌株的脱落。

细菌学分析

将采集的泄殖腔拭子直接接种在补充有20μg/ml萘啶酸或100μg/ml链霉素的木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂(XLD；Oxoid，Basingstoke，England)平板上。由于肠炎沙门氏菌ΔacrAbacrEFmdtABC菌株和鼠伤寒沙门氏菌ΔacrAbacrEFmdtABC菌株不能在XLD琼脂上生长，因此XLD琼脂用于检测攻击菌株。将直接接种后呈阴性的样品在缓冲的蛋白胨水(BPW；Oxoid，Basingstoke，England)中预富集，并在37℃孵育过夜。将1ml该悬浮液通过加入9ml连四硫酸盐-亮绿色肉汤(Merck，Darmstadt，Germany)进一步富集。在37℃孵育过夜后，将该悬浮液铺板在补充有适当抗生素的XLD平板上。将盲肠和脾脏样品在BPW中匀浆，并在HBSS中制备10倍稀释液。将六滴20μl的每种稀释液铺板在补充有20μg/ml萘啶酸或100μg/ml链霉素的XLD平板上。在37℃孵育过夜后，通过计数平板上细菌菌落的数量来确定CFU/g组织的数。如上文所述富集阴性样品。

统计分析

GraphPad Prism软件(版本5.0，GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA)用于获得的数据的统计分析。卡方检验用于分析组间死亡率的差异。Fisher检验用于分析沙门氏菌阳性泄殖腔拭子数量以及沙门氏菌阳性的脾脏和盲肠样品数量的组间统计学差异。将盲肠和脾中的细菌计数转换成对数形式用于统计分析。将直接接种后呈阴性的盲肠和脾脏样品评定为log10＝0。使用Mann-Whitney检验分析组间差异。P值低于0.05的差异被认为是显著的。

结果

在实验期间没有动物死亡，并且同样，用CI培养物处理的组和对照组之间的死亡率没有统计学差异。

实验性感染后肠炎沙门氏菌攻击菌株的粪便脱落在对照组和CI培养物处理组中相同，在实验的第3天，在两组中均为10只鸡中有5只鸡脱落菌株。在实验的第7天，CI处理组中10只鸡中仅有6只鸡脱落攻击菌株，而对照组中10只鸡中有10只脱落肠炎沙门氏菌攻击菌株。鼠伤寒沙门氏菌攻击菌株的粪便脱落最初在CI处理组中较高，其中10只动物中有5只动物脱落该菌株，而在对照组中，10只中仅有一只鸡脱落该菌株。然而，在实验的第7天，在对照组中10只动物中有10只动物脱落鼠伤寒沙门氏菌攻击菌株，并且在CI处理组中10只鸡中有9只鸡脱落攻击菌株。

在直接铺板盲肠样品后，在用CI培养物处理的组中未检测到肠炎沙门氏菌攻击菌株(图10)。然而，在对照组中，可以在几个样品中检测到大量肠炎沙门氏菌攻击菌株。在任何一组脾脏样本中均未检测到肠炎沙门氏菌攻击菌株。与对照组相比，在用CI培养物处理的组中可以发现显著较低量的鼠伤寒沙门氏菌攻击菌株(图10)。然而，在脾脏中，处理组和未处理组之间在鼠伤寒沙门氏菌攻击菌株的定殖中没有显著差异。

在对盲肠样品进行富集后，可以在肠炎沙门氏菌攻击组中的所有样品中检测到肠炎沙门氏菌攻击菌株。类似地，可以在来自对照和CI处理组的所有盲肠样品中检测到鼠伤寒沙门氏菌攻击菌株(表2)。在富集脾脏样品后，与用CI培养物处理的组相比，对照组中的肠炎沙门氏菌攻击菌株阳性脾脏的量显著更高。在用鼠伤寒沙门氏菌攻击菌株实验性感染的组之间，攻击菌株阳性的脾脏样品数量没有显著差异(表2)。

表2：在用CI培养物处理的两日龄肉鸡的实验性感染后第7天对肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株呈阳性的盲肠和脾脏样品的数量。

a富集后阳性样品的数量

b样品总数

*对照组和CI处理组之间的显著差异(P值<0.05)

CI培养物在生命的第一天施用，并且由通过口服管饲法同时施用的10⁸CFU的肠炎沙门氏菌ΔacrAbacrEFmdtABC菌株和10⁸CFU的鼠伤寒沙门氏菌ΔacrAbacrEFmdtABC菌株组成。通过口服管饲法给鸡施用10⁵CFU的相应攻击菌株来在生命的第2天对鸡进行实验性感染。

结论

由ΔacrABacrEFmdtABC菌株组成的CI培养物能够在实验性感染后提供针对肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的保护。因此，这些菌株能够用于帮助减少肉鸡中沙门氏菌的发病率，并最终减少人中食源性沙门氏菌感染的数量。

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序列表

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<120> 一种减少蛋的污染的方法

<130> P2014/048 PCT

<150> EP 16171540.4

<151> 2016-05-26

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1470

<212> DNA

<213> 沙门氏菌（Salmonella）

<400> 1

atgaagaaat tgctccccat ccttatcggc ctgagcctgt cggggttcag cacactaagc 60

caggcagaga acctgatgca agtttatcag caagcacgcc tgagcaaccc ggaattgcgt 120

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<210> 2

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<400> 2

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<213> 沙门氏菌

<400> 4

atggcgaatt tttttatcga tcgccccatt tttgcctggg tgctggctat cctgttgtgt 60

ctgacagggg cgttagccat tttctcttta cctgttgaac aatatcccga tctggcgccg 120

cccaacgtac gtattaccgc gaattatccg ggagcgtcgg cgcaaacgct ggaaaatacc 180

gtaacccagg ttattgagca gaatatgacg ggcctcgata atctgatgta catgtcatca 240

caaagcagcg gaaccggaca ggcgaccatc accctgagct ttattgcggg aaccgatcct 300

gatgaggcgg ttcagcaggt gcaaaaccag ttacagtccg cgatgcgtaa actgccgcag 360

gcggtacagg atcaaggcgt cacggtacgc aaaacgggcg ataccaatat tttgaccatc 420

gctttcgtct ctaccgacgg ttctatggac aagcaggata tcgccgacta cgtcgccagt 480

aatattcagg acccgctcag ccgcgtcaac ggcgtcggcg atattgacgc ttatggttca 540

cagtactcta tgcgtatctg gctcgatccg gccaaattga atagttttca gatgaccacg 600

aaagacgtga ccgatgcaat tgagtcgcag aatgcgcaaa tcgccgtcgg gcagcttggc 660

ggtacgcctt cggtcgacaa acaggcgctg aacgccacca ttaatgcgca gtcattgctg 720

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aaactgggcg atgtcgccac cgtggagctg ggggcggaaa agtatgacta cctcagccgt 840

tttaacggca atccggcttc cggtcttggc gttaagctgg cctccggcgc gaacgaaatg 900

gcgaccgcga agctggtact ggatcgcctc aacgagctgg cgcagtactt ccctcacggc 960

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gcgatcgggc tcctagtcga cgatgccatc gtggtggtgg aaaacgtcga acgtatcatg 1260

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ggtaccaccg gggcgattta tcgtcagttt tctattacca ttgtctcggc aatggtgctg 1440

tcggtgctgg tcgccatgat cctgacgccg gcgctgtgcg caacgttatt aaaaccgctg 1500

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gagaaagaca acattatgtc ggtcttctcg acggtaggtt ccggccctgg cgggaatggg 1860

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ctcattgagc tggccgggaa aaacagttcc ttgacccgcg tgcgccacaa cggcctggac 2160

gacagcccgc aactgcaaat tgatattgac caacgaaaag cgcaggcgct gggcgtatcg 2220

attgacgata tcaacgacac cctgcaaaca gcctggggat cgagctacgt caacgacttt 2280

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ctggttgtgc cgctcggggt catcggcgcg ctactcgcta cctggatgcg cgggctggaa 2760

aacgatgttt acttccaggt ggggctgttg accgttatcg gcctctcggc gaaaaacgcg 2820

attctgattg tggaattcgc caacgaaatg aatcagaagg gacacgcgct gttagacgcc 2880

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ggaaccggcg tgatgggggg aatgatctca gcaaccgttc tggctatctt ctttgtaccc 3060

ctgtttttcg tgctgatacg tcgccgcttc ccgctgaagc cgcgcccgaa ataa 3114

<210> 5

<211> 3114

<212> DNA

<213> 沙门氏菌

<400> 5

atggcaaact tttttattag acgtcctatt ttcgcctggg ttctggccat tatcctgatg 60

atggctggcg cactggcaat aatgcaactt cccgttgcgc agtatccaac cattgcgccg 120

ccagcggttt ctatttctgc aacctatcct ggcgcggatg cgcagacggt acaggatacg 180

gttactcagg ttatcgaaca aaatatgaac ggtatcgata acctgatgta tatgtcctct 240

accagcgact ctgctggtag cgtgaccatc accctgacct tccagtccgg aaccgatccg 300

gatatcgcgc aggttcaggt gcaaaataaa ttgcagctcg ccacgccttt actgccgcaa 360

gaagtccagc agcaggggat tagcgttgaa aaatccagca gcagcttttt gatggtcgcc 420

gggttcgtct cagataatcc gaacactacc caggacgaca tctctgacta tgtcgcctct 480

aacattaagg attctatcag ccgtctgaat ggtgtgggcg acgttcagct atttggcgca 540

cagtacgcca tgcgtatctg gctggatgcg aatctgctaa ataaatacca gctcacgcca 600

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ggcacgccag cattaccggg ccagcagctt aacgcctcaa tcatcgccca aacgcgtctg 720

aaagatccgg aagagttcgg caaagttacg ttgcgcgtca ataccgacgg ctctgtcgtc 780

catctcaaag atgtcgcgcg tattgagctt ggcggtgaaa actataacgt tgtagcgcgc 840

attaacggta aaccggcctc cggtctcggt attaaactgg cgaccggcgc taacgcgctg 900

gataccgcaa ccgcaatcaa agtgaaactg gcggagctgc agcctttctt ccctcaggga 960

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gtaaaaacgc tgtttgaagc gattattctg gtgttcctgg taatgtatct gttcttacag 1080

aatatccggg caaccctgat tcctaccatc gctgttcctg tcgtgttgct aggcactttt 1140

gcggtactcg ccgcctttgg ctattccatc aataccctga cgatgtttgg tatggtactg 1200

gcgatagggc tgttggttga cgatgcgata gtggtcgtag aaaacgttga acgtgtaatg 1260

atggaggata acctttctcc ccgagaggcg acggaaaaat ccatgtcgca gattcaggga 1320

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cacagcgtta accactatac taacagcgta agcggcatcg tgcgtaatac gggtcgctat 1620

ctcattatct atctacttat tgtagtcgga atggcggttc tgtttttacg cctcccgacc 1680

tccttcctgc cggaagaaga tcagggagta ttcctgacca tgattcagct cccctctggc 1740

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gaagacacgc cacagttcaa gctggatgtc gatcaagaaa aagcgcaggc gctcggcgtt 2220

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tttatcgatc gcggacgagt gaaaaaagta tacgttcagg ctgacgctca gttccgtatg 2340

ctgccgggag atatcaacaa tctttatgtt cgcagcgcta atggcgagat ggtgcccttc 2400

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atgctggtcg taccgctcgg cgtggttggc gctctgcttg cagcgtcatt gcgcggtctg 2760

aacaatgacg tttacttcca ggttggcttg ttaaccacta ttggcctttc tgctaaaaac 2820

gccatcctga ttgtcgagtt cgccaaagat ctcatggaaa aagaaggacg tggattgatt 2880

gaagcgacgc tggaagcatc ccgtatgcgt ttacgtccta ttctaatgac ctcgctggcc 2940

tttattctcg gggtaatgcc gttagttatc agtcgtggcg caggtagtgg tgcacagaac 3000

gcagtaggca caggggttat ggggggaatg ttaaccgcaa ccttattagc tatcttcttc 3060

gtgccggtat tcttcgttgt tgtaaaacgc cgatttaatc gccatcatga ttaa 3114

<210> 6

<211> 1158

<212> DNA

<213> 沙门氏菌

<400> 6

atgacgaaac atgccaggtt ttcactcctg ccctcattca tcatattctc tgctgcgctg 60

ctggccggtt gtaatgacca gggagatacc caggctcatg ccggcgagcc gcaagtcacc 120

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gcatttcgca ttgcggaggt tcgcccccag gtgagcggga tcgtgcttaa aagaaacttc 240

accgaaggta gcgatgtaga ggccgggcag tcgctctatc agatcgatcc tgccacttat 300

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gaatatgatc aggcgattgc cgacgcccgc caggccgatg ccgccgttgt ggcggcaaaa 480

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<212> DNA

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gatgaagcta atgtcgccag cgcgcagtta cagctcgact ggagtcgtat cacggccccg 600

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gaaagcgata tcgcgaccgt agttcaggca cagaaagcgg ggaaagcgct ggtcgtagaa 780

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<210> 8

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<212> DNA

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atgcaggtat tacctccggg cagcacgggc ggcccttcgc gtctgtttat tctgcgcccc 60

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acccaggtag aggacatggt agaaacccgc gtggcgcaga agatctcaca ggtctccggc 540

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gtaggcggct tactggtcag ccaggtatta actctgttta ccacaccggt gatttatctc 3060

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tag 3123

<210> 9

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<213> 沙门氏菌

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gatttcccgg tgattatggt tagcgcctcg ctgccgggcg cctcgccgga aaccatggct 180

tcgtcggtgg cgacgccgtt ggaacgctct ttgggacgca ttgcaggcgt caatgaaatg 240

acctccagca gctcgctcgg cagtacacgc attattctcg aatttaattt cgatcgtgat 300

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atgggcggta ttcaggctga ccaaagcatc tctttccagg ccatgcgcgg caagctgcag 1740

gattttatga aaattattcg cgacgatccg gcggtgaata atgtcactgg ttttaccggc 1800

ggatcgaggg tgaatagcgg catgatgttt attacgctga agccgcgcgg cgaacgcaaa 1860

gagacggcgc agcaaatcat tgatcgactg cgggtcaaac tggcaaaaga acctggcgcc 1920

aggctgtttc tgatggcggt acaggatatt cgcgtcggcg ggcggcaggc taacgccagt 1980

taccaatata cgttgctgtc tgactctctg gcggcgctgc gcgaatggga gccgaaaata 2040

cgcaaagcgc tctcggccct gccgcaactg gcggacgtaa actccgacca gcaggataac 2100

ggcgcggaga tgaaccttat ctacgaccgc gacaccatgt cacggctggg tattgatgtt 2160

caggccgcaa acagtctgtt aaataatgct ttcggccagc ggcaaatttc caccatttat 2220

cagccgatga accagtataa agtggtgatg gaagtcgatc cgcgctatag ccaggatatc 2280

agcgcgctgg agaaaatgtt cgttatcaac cgtgacggaa aagcgattcc cctctcttat 2340

ttcgcccaat ggcggcccgc caatgcgccg ctgtcggtga accatcaggg actttccgcg 2400

gcgtccacga ttgcctttaa cctgccgacc ggcacatcgt tatcgcaggc gacagaggcc 2460

attaatcgca ccatgacgca gcttggcgtc ccctcgacgg tacgcggcag tttttccgga 2520

acggcgcaag tcttccagca gaccatgaat tcacagctta ttttgatagt ggcggcgatc 2580

gctaccgtct acattgtgct ggggatactg tacgaaagct acgtccatcc actgaccatt 2640

ctctctactc tgccatcggc gggcgttggg gcgcttctgg cgctggaact cttcaatgcc 2700

cctttcagcc taatcgccct gatagggatc atgctattaa ttggcattgt gaagaaaaac 2760

gccattatga tggtcgattt tgcgcttgaa gcgcaacgaa gcggcggcct gacgccggaa 2820

caagccattt tccaggcctg cttgttacgc ttccgtccaa taatgatgac cacgctggcg 2880

gcgctgttcg gcgcactgcc attggtgtta tctggcggag acggttcgga attacggcag 2940

ccgctgggga taaccattgt cggcggtttg gtcatgagcc agctcctgac gctctatacc 3000

acgccggtgg tgtacctctt tttcgatcgt ctgcggctac gtttttcgcg taaaaatagc 3060

aaaccggtag tagagatatg a 3081

<210> 10

<211> 1206

<212> DNA

<213> 沙门氏菌

<400> 10

atgttgatag ccggcgtcat cgccgccatc gggggcgtga tttacatggc cggcgaagca 60

ctatgggata aagacaacgc cgtcggcccc ccggccagcg cgccgcctcc accgtcggta 120

ccggttgcta aagcccttag ccgtacactc gcgcctacgg cggaattcac cggttttctg 180

gccgcgccgg aaaccgtgga gctgcgttcg cgcgtgggag gaacccttga cgccatcagc 240

gttccggaag gacgtctggt aagccgcgga caactgctgt tccagatcga tccgcgcccg 300

ttcgaggtcg ccctcgacac cgccgtcgcg caattacgtc aggctgaagt actggcccgc 360

caggcgcagg cggatttcga tcgcattcaa cgactggtcg ccagcggcgc cgtatcacgt 420

aaaaacgctg acgatgtcac cgccacgcgt aatgcgcgac aggcgcagat gcaatcggcc 480

aaagccgccg tcgccgcagc gcgccttgaa ctctcctgga cccgtattac cgcgcccatt 540

gccggacgcg ttgaccgcat actggtgacc cggggcaatc tggtcagcgg cggcgtagcg 600

ggtaacgcca cgcttctgac gactatcgtg tctcacaatc ccatgtatgt gtatttcgat 660

attgacgaag ccacctggct gaaggcgtta cggcataccc gctccgacaa aaatccaccg 720

gtagtcaaca tggggttaac caccgataac gggctgcctt atcagggcgt actcgacttt 780

atgggcaatc agatgaaccg cagcaccggc actatccggg cacgcgccgt gattcctgac 840

cccgacggaa tgctttctcc cggcctgttt gcccgaatca gtttgcccat cggcgagccg 900

cgggaaaccg tgctgattga cgatctggcg gtgagcgccg atcagggcaa aaactatgtg 960

ctgatcgtcg gcaaggagaa tcaggtggag tatcgtccgg ttgagttggg acaaatggtc 1020

gatggattcc gcgtcgttac acagggagta ctgccgggag aaaaaatcat cctcaagggg 1080

ctggtgcgtc ctggcatgac cgttgcgcca cgtctggtgc cgatgcggca gaatgtgacc 1140

gacaaacaga ccgcgacatt gactaaagcg gacggcgaca gtgcgccgaa ggcggtgcgc 1200

caatga 1206

<210> 11

<211> 3168

<212> DNA

<213> 沙门氏菌

<400> 11

atgaaattca cccacttttt cattgcacgc cccatcttcg ccatcgtcct gtcgctgtta 60

atgctgctgg ctggcgctat cgccttttta aaactgccgc tgagtgaata tccggccgtt 120

acgccgccca cggtacaggt tagcgccagc taccccggcg ctaacccgca agtgattgcc 180

gatacggtag ccgcgccgct ggaacaggtg atcaacggcg ttgacggcat gttgtatatg 240

aatacccaga tggccattga tggtcgcatg gttatctcta tcgccttcga acagggaacc 300

gatcctgata tggcgcaaat tcaggtgcaa aaccgggtat cccgcgcgct gcctcgcctg 360

cccgaagaag tccagcgaat tggcgttgta acggagaaaa cgtcccccga tatgttgatg 420

gtggttcatc ttgtctcgcc gcaaaaacgc tatgactcgc tttacctgtc taacttcgcc 480

atccggcagg ttcgcgacga actggcccgt ttacccggcg tcggcgatgt tctcgtctgg 540

ggcgcgggcg agtacgccat gcgcgtctgg ctggacccgg cgaaaatcgc caaccgcggt 600

cttaccgcca gtgatatcgt tacggcgttg cgggaacaaa acgtacaggt cgccgccggt 660

tccgtcgggc aacagccgga ggcctccgcc gcttttcaga tgacggtaaa cacgctgggc 720

cgcctgacca gcgaagaaca gttcggcgag attgtggtaa aaatcggcgc tgacggcgag 780

gtgacgcgtc tgcgtgatgt cgcccgcgtc acgctgggcg cagatgccta tacgctgcgc 840

agtttactga atggcgaagc ggcgccagcg ttacagatta ttcaaagtcc gggcgccaat 900

gcgattgacg tttctaacgc gattcgcggc aaaatggatg agttgcagca aaacttcccg 960

caggatatcg aataccggat tgcctatgat cctacggtct tcgtgcgcgc atcgctacaa 1020

tcggtggcga ttacgttgct ggaagccctc gtgctggtcg tccttgtcgt ggtgatgttc 1080

ctgcaaacct ggcgggcgtc cattattcct ctggtggcgg ttcccgtttc gctggtcggc 1140

acctttgcct tgatgcacct gtttggcttt tcgctgaata cgctttcgct gtttggtttg 1200

gtcctgtcga taggtatcgt tgtcgatgac gccatcgttg tggtcgaaaa cgtggaacgg 1260

catatctcgc agggcaaaag tcccggagag gcggcaaaga aggcgatgga tgaagtcact 1320

ggtcccattc tttctattac ctcggtgcta acggcggtct ttatcccttc cgcattcctg 1380

gcgggcctgc agggtgagtt ttatcgtcag ttcgcgttga ccatcgctat ttcgaccatc 1440

ctttcggcca ttaactcgct gacgctctcc cctgcgctgg ctgccatttt gctaagaccg 1500

caccacgata ctgcgaaggc tgactggcta acgcggttga tgggcacggt cactggcggt 1560

tttttccatc gctttaaccg tttcttcgac agcgcgtcga accgctatgt tagcgccgtc 1620

cgtcgggccg tgcgcggcag cgtcattgtg atggtgctct atgctggctt tgtggggctg 1680

acctggcttg gcttccatca ggtgccgaac gggtttgtgc ctgcgcagga taaatactat 1740

ctcgtcggca tcgcccagct cccaagcggc gcatcgttgg atcgcacaga ggcggtcgtg 1800

aaacagatgt ccgctatcgc gctggcggaa cccggcgttg aaagcgtcgt cgtcttcccc 1860

ggtctgtcgg ttaacggccc ggtaaatgtg ccaaattcgg cgctgatgtt cgccatgctg 1920

aaaccctttg acgagcgtga agatccttcg ctttccgcta acgctatcgc cggaaagcta 1980

atgcacaaat ttagccacat tcccgacgga tttattggca tcttcccgcc accgccggtt 2040

ccagggcttg gcgcgacggg cggctttaaa ttgcagattg aagatcgtgc ggaactggga 2100

tttgaagcga tgacaaaggt gcaaagcgag attatgtcta aggcgatgca gacgcccgaa 2160

ctggccaata tgctggccag tttccagaca aacgccccgc aattacaggt ggatatcgac 2220

cgggtaaagg cgaaatcaat gggggtatcg ctcaccgaca tctttgaaac gttgcaaatt 2280

aacctcggct cgctttacgt caacgatttc aaccgatttg gccgtgcctg gcgggtgatg 2340

gcgcaggccg atgcgccatt ccgtatgcag caagaggata tcggcctgct taaagtccgc 2400

aatgcgaagg gcgagatgat cccgcttagc gctttcgtca cgattatgcg ccagtcgggg 2460

ccggacagaa tcatccatta caacggcttc ccctcggtag atattagcgg tggaccggct 2520

ccgggcttct cctccggaca ggcgacggac gcgattgaaa agatcgtgcg tgaaacgtta 2580

ccggaaggga tggtcttcga atggaccgat ctggtttatc aggaaaaaca ggccggcaac 2640

tctgcgcttg ctatctttgc gctggcggtg ctgctggcct tcctgatcct ggcggcgcag 2700

tacaacagtt ggtcgctgcc cttcgccgtc ctgcttattg cgcctatgtc attactctca 2760

gccattgtcg gcgtgtgggt atctggcgga gataacaata tctttacgca gattggtttc 2820

gtggtgctgg tcggcctggc ggccaagaac gccattttga ttgtcgagtt tgcccgcgcc 2880

aaagaacacg acggcgcaga cccgctgacc gccgtactgg aagcgtcccg cctgcgtctg 2940

cgtcctatcc tgatgacctc attcgccttt atcgcaggtg tagtaccact ggtactcgcg 3000

acgggtgccg gcgcggaaat gcgacatgcg atgggcatcg ccgtgtttgc cggcatgttg 3060

ggcgtcacgc tcttcggcct gttattgacg cctgtatttt acgtggtggt tcgcaggatg 3120

gcattaaagc gtgagaaccg cgttgattcg catgatcagc aagcataa 3168

Claims (21)

1.一种沙门氏菌突变菌株，其包含tolC基因的遗传修饰或至少acrAB、acrEF和mdtABC基因的遗传修饰，所述突变菌株用于免疫产蛋鸡以抵抗沙门氏菌(Salmonella)感染，并且其中所述突变菌株能够预防或减少所述鸡中生殖器官的沙门氏菌定殖。

2.根据权利要求1使用的沙门氏菌突变菌株，其中所述经免疫的鸡产生基本上不含沙门氏菌的蛋。

3.根据权利要求1或2使用的沙门氏菌突变菌株，其中所述遗传修饰是tolC基因的至少部分缺失或acrAB、acrEF和mdtABC基因的至少部分缺失，或其中所述遗传修饰导致所述基因的失活。

4.根据权利要求1至3中任一项使用的沙门氏菌突变菌株，其中所述沙门氏菌突变菌株选自血清群B、C或D。

5.根据权利要求4使用的沙门氏菌突变菌株，其中所述菌株选自肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis或S.Enteritidis)，鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)，哈达尔沙门氏菌(S.Hadar)，魏尔肖沙门氏菌(S.Virchow)，婴儿沙门氏菌(S.infantis)，肯塔基沙门氏菌(S.Kentucky)，布雷登尼沙门氏菌(S.Bredeney)，阿哥拉沙门氏菌(S.Agona)，乙型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi B)和鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)。

6.根据权利要求1至5中任一项使用的沙门氏菌突变菌株，其中所述突变菌株是疫苗组合物的一部分，所述疫苗组合物还包含药学上可接受的载体和/或稀释剂，以及任选佐剂。

7.根据权利要求1至6中任一项使用的沙门氏菌突变菌株，其中所述突变菌株是适于通过注射、吸入或口服施用的制剂的一部分。

8.一种沙门氏菌突变菌株，其包含失活或缺失的acrAB、acrEF和mdtABC基因，并且其中acrD和mdsAB基因未经修饰。

9.根据权利要求8所述的沙门氏菌突变菌株，其中所述沙门氏菌突变菌株选自血清群B、C或D。

10.根据权利要求8或9所述的沙门氏菌突变菌株，其中所述菌株选自肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis或S.Enteritidis)，鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)，哈达尔沙门氏菌(S.Hadar)，魏尔肖沙门氏菌(S.Virchow)，婴儿沙门氏菌(S.infantis)，肯塔基沙门氏菌(S.Kentucky)，布雷登尼沙门氏菌(S.Bredeney)，阿哥拉沙门氏菌(S.Agona)，乙型副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi B)和鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)。

11.一种组合物，其包含权利要求8-10中任一项所定义的沙门氏菌突变菌株、载体和/或稀释剂，以及任选佐剂。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述组合物是疫苗。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述疫苗是减毒活疫苗。

14.根据权利要求8-13中任一项所述的沙门氏菌突变菌株或组合物，其用作药物。

15.根据权利要求8-13中任一项所述的沙门氏菌突变菌株或组合物，其用于通过向受试者施用所述突变菌株或组合物来保护所述受试者抵抗沙门氏菌感染和/或定殖。

16.根据权利要求15使用的沙门氏菌突变菌株或组合物，其中所述受试者是鸡，特别是肉鸡或产蛋鸡。

17.根据权利要求15或16使用的沙门氏菌突变菌株，其中所述突变菌株能够减少或预防产蛋鸡的生殖器官的沙门氏菌感染。

18.根据权利要求8-13中任一项所述的沙门氏菌突变菌株或组合物，其适于口服施用。

19.根据权利要求1至7和14至18中任一项使用的沙门氏菌突变菌株或组合物，其中所述菌株或组合物以初免-加强方案施用。

20.根据权利要求1、3和8中任一项所定义的沙门氏菌突变菌株用于减少或预防蛋的沙门氏菌污染的用途。

21.一种预防或减少蛋的沙门氏菌污染的方法，所述方法包括将包含tolC基因的遗传修饰或至少acrAB、acrEF和mdtABC基因的遗传修饰的沙门氏菌突变菌株施用至产蛋鸡。