CN109476643A - 作为jak抑制剂的吡唑基氨基苯并咪唑衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供下式(')的化合物：

Description

作为JAK抑制剂的吡唑基氨基苯并咪唑衍生物
本发明涉及抑制Janus激酶1 (JAK1)的苯并咪唑化合物及其药学上可接受的盐、包含所述化合物的药物组合物、使用所述化合物治疗某些类型的自身免疫性疾病和癌症的方法，以及用于制备所述化合物的方法。
Janus激酶家族(JAK1、JAK2、JAK3和TYK2)是细胞内蛋白酪氨酸激酶，其通过Janus激酶信号传导和转录激活因子(JAK-STAT)途径在免疫功能、炎症和造血功能中发挥重要作用。响应细胞外多肽如I型和II型细胞因子，Janus激酶调节各种效应物的酪氨酸磷酸化，并引发下游信号转导途径的活化，从而引起不同生理反应。具体地，JAK1同种型在I型和II型干扰素信号转导中起重要作用，并引出来自白细胞介素-2 (IL-2)、白细胞介素-4 (IL-4)、糖蛋白130 (gp130) 和II类受体家族的信号。因此，JAK1的小分子抑制可以干预肿瘤学、炎症和自身免疫性疾病中涉及的信号转导途径。Ghoreschi K等人, Immunological Review2009, 228, 273-287和Zak M.等人, Med Chem, 2013, 56, 4764-4785。
尽管JAK抑制剂最近取得了成功，但仍需要发现和开发选择性靶向单一JAK同种型的抑制剂。这可以减轻脱靶效应的风险。
Janus激酶抑制剂化合物在文献中已知。例如，US 2015/0203455公开了某些苯并咪唑化合物，其为JAK抑制剂并被标榜为尤其可用于治疗自身免疫性疾病、炎性疾病和增殖性疾病。
仍然需要提供用于治疗自身免疫性疾病，特别用于免疫性疾病，例如关节炎、类风湿性关节炎和糖尿病性肾病的替代JAK1抑制剂。此外，仍然需要提供选择性JAK1抑制剂。本发明提供某些JAK1抑制剂，其可以解决这些需求中的一者或多者。
本发明提供式1的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R选自：H、-C1-3烷基、-CH2CH(OH)CH3、或-C2-3烷基-O-CH3、和；R1选自：H、-CH3和-OCH3；R2为-CHF2或-CF3；且R3为H或-CH3；条件是，当R2为-CF3且R3为H时，R或R1可以为-CH3，但不都是-CH3。所示的键表示四氢吡喃环或吡啶环与分子其余部分的连接点。
本发明提供式2的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为：
其中R选自：H、-C1-3烷基、-CH2CH(OH)CH3、或-C2-3烷基-O-CH3、和；R1选自：H、-CH3和-OCH3；R2为-CHF2或-CF3；且R3为H或-CH3；条件是，当R2为-CF3且R3为CH3时，R或R1可以为-CH3，但不都是-CH3。
在一种形式中，本发明提供根据式1或2的化合物或其药学上可接受的盐，其中R选自：-CH3、-CH2CH3和。在某些实施方案中，R为-CH3或-CH2CH3。在其它实施方案中，R为。
在另一种形式中，本发明提供根据式1或2的化合物，其中 R为，其中所示的键表示与分子其余部分的连接点。在另一种形式中，本发明提供根据式1或2的化合物，其中R为。
在另一种形式中，本发明提供根据式1或2的化合物，其中R1选自：H、-CH3和-OCH3。在某些实施方案中，R1为H或-CH3。在其它实施方案中，R1为-OCH3。
在另一种形式中，本发明提供根据式1或2的化合物，其中R2为-CF3。在该形式的某些实施方案中，R为-CH3或-CH2CH3且R1为-CH3或-OCH3。在该形式的其它实施方案中，R为且R1为H。
在另一种形式中，本发明提供根据式1或2的化合物，其中R3为-CH3。在某些实施方案中，R为H，R1为H，且R2为CH3。
在一个实施方案中，本发明提供式3的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为：
。
在另一个实施方案中，本发明提供式4的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为：
。
在又一个实施方案中，本发明提供式5的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为：
。
在另一个实施方案中，本发明提供式5A的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为：
。
在另一个实施方案中，本发明提供式5B的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为：
。
在又一个实施方案中，本发明提供式6的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为：
。在一个实施方案中，药物组合物包含式6的化合物，其为中性化合物、游离碱或两性离子。在一个实施方案中，本发明提供式6的化合物，其为柠檬酸盐。在又一个实施方案中，本发明提供式6的化合物，其为结晶形式的游离碱，其特征在于获自CuKα源(λ=1.54056 Å)的X射线粉末衍射图包括在以下各处的峰：15.5、18.1、18.3、20.5和22.9+/- 0.2°2θ，或13.2、15.5、18.1、18.3、18.5、20.5、22.9、23.6和23.7 +/- 0.2°2θ，或13.2、15.5、18.1、18.3、18.5、19.0、20.5、22.9、23.6、23.6、23.7、24.7和26.5 +/- 0.2°2θ。
在又一个实施方案中，本发明提供式6的化合物，其为结晶形式的(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸酯水合物(1:1:1)，其特征在于获自CuKα源(λ=1.54056 Å)的X射线粉末衍射图包括在以下各处的峰：18.6、19.1、21.0和22.4+/- 0.2°2θ，或7.4、11.0、18.6、19.1、21.0、21.9、22.4和26.2 +/- 0.2°2θ，或7.4、11.0、12.7、16.8、18.6、19.1、21.0、21.9、22.4和26.2 +/- 0.2°2θ。
在另一种形式中，本发明提供包含基本上纯的结晶形式的(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸酯水合物(1:1:1)的组合物。优选地，该组合物包含大于80%(重量/重量)的结晶形式的(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸酯水合物(1:1:1)。更优选大于90%(重量/重量)的结晶形式的(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸酯水合物(1:1:1)。还更优选大于95%(重量/重量)的结晶形式的(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸酯水合物(1:1:1)。
在另一种形式中，本发明提供药物组合物，其包含根据式1至6任一式的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在一个实施方案中，药物组合物包含式1至6的化合物，所述化合物为中性化合物或两性离子。在另一个实施方案中，药物组合物包含式1至6的化合物，所述化合物为药学上可接受的盐。在又一个实施方案中，药物组合物包含式1至6的化合物，所述化合物为柠檬酸盐。
在另一种形式中，本发明提供治疗需要关节炎、更优选类风湿性关节炎治疗的患者的方法。该方法包括向该患者给药有效量的包含根据式1至6任一式的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
在另一种形式中，本发明提供治疗糖尿病性肾病患者的方法。该方法包括向该患者给药有效量的根据式1至6任一式的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一种形式中，本发明提供治疗糖尿病性肾病患者的方法。该方法包括向该患者给药有效量的包含根据式1至6任一式的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
在另一种形式中，本发明提供治疗炎症性肠病患者的方法。该方法包括向该患者给药有效量的包含根据式1至6任一式的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
在另一种形式中，本发明提供在有需要的患者中治疗由JAK1抑制介导的自身免疫性病症的方法。该治疗包括向该患者给药有效量的式1至6的化合物或其药学上可接受的盐。
由JAK1抑制介导并可以根据本发明治疗的病症的实例包括：糖尿病性肾病；狼疮，更优选系统性红斑狼疮；Sjögren综合症；和炎症性肠病，更优选克罗恩病和溃疡性结肠炎。
在另一种形式中，本发明提供治疗需要关节炎治疗的患者的方法。该方法包括向有需要的患者给药有效量的根据式1至6任一式的化合物或其药学上可接受的盐。更优选的治疗关节炎的方法包括治疗类风湿性关节炎患者。
在另一种形式中，本发明提供治疗患者的方法，其中所述患者需要治疗选自以下的病症：糖尿病性肾病；狼疮，更优选系统性红斑狼疮；Sjögren综合症；和炎症性肠病，更优选克罗恩病和溃疡性结肠炎。该方法包括向该患者给药有效量的根据式1至6任一式的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一种形式中，本发明提供治疗需要癌症治疗的患者的方法。该方法包括向有此需要的患者给药有效量的根据式1至6任一式的化合物。
在另一种形式中，本发明提供根据式1至6任一式的化合物，其用于治疗。
在一个实施方案中，可以使用根据式1至6任一式的化合物的治疗选自：关节炎，更优选类风湿性关节炎；糖尿病性肾病；狼疮，更优选系统性红斑狼疮；Sjögren综合症；和炎症性肠病，更优选克罗恩病和溃疡性结肠炎。
在另一种形式中，本发明提供根据式1至6任一式的化合物在制备药物中的用途。
在一个实施方案中，该药物可用于治疗关节炎。在另一个实施方案中，该药物可用于治疗类风湿性关节炎。在又一个实施方案中，该药物可用于治疗选自以下的病症：糖尿病性肾病；狼疮，更优选系统性红斑狼疮；Sjögren综合症；和炎症性肠病，更优选克罗恩病和溃疡性结肠炎。在另一个实施方案中，该药物可用于治疗糖尿病性肾病。在又一个实施方案中，该药物可用于治疗狼疮。在又一个实施方案中，该药物可用于治疗Sjögren综合症。在又一个实施方案中，该药物可用于治疗炎症性肠病。
本文中所用术语“药学上可接受的盐”是指被认为对于临床和/或兽医用途可接受的本发明化合物的盐。药学上可接受的盐的实例和制备它们的常用方法可见于P. Stahl等人, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 第二修订版, Wiley-VCH, 2011和S.M. Berge等人, "Pharmaceutical Salts," Journal ofPharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, 1977年1月。
本发明的药物组合物可以使用药学上可接受的添加剂通过本领域已知的程序制备。本文中对于药物组合物所用的术语“药学上可接受的添加剂”是指与制剂的其它添加剂相容且对患者无毒害的一种或多种载体、稀释剂和赋形剂。药物组合物及其制备方法是已知的，实例可见于Loyd, V.等人编辑, Remington: The Science and Practice ofPharmacy 22nd Ed., Mack Publishing Co., 2012。药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的非限制性实例包括以下：盐水、水、淀粉、糖、甘露醇和二氧化硅衍生物；粘合剂如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；高岭土和膨润土；聚乙二醇(polyethyl glycols)。
优选的药物组合物可以配制成用于口服给药的片剂、胶囊、溶液或用于注射的溶液。所述片剂、胶囊或溶液可以包含有效治疗需要治疗的患者的量的本发明化合物。
本文中所用的术语“有效量”是指有效治疗疾病如关节炎、自身免疫性疾病或癌症的剂量的量。作为本领域技术人员的主治医师或兽医可以通过使用常规技术和通过观察在类似情况下获得的结果来容易地确定有效量。可以考虑许多因素来确定有效量或剂量；所述因素包括但不限于将给药该化合物还是其盐；如果使用的话，其它药剂的联合给药；患者的物种；其大小、年龄和一般健康状况；疾病的涉入程度或严重程度；个体患者的反应；给药方式；所给药制剂的生物利用度特征；所选的给药方案；使用其它伴随药物；和其它相关情况。
本文中所用术语“患者”是指哺乳动物、家禽或鱼。优选的哺乳动物包括人类、同伴哺乳动物如狗或猫、或驯养动物或家畜如牛、猪、马、绵羊和山羊。
术语“基本上纯的”是指基于重量/重量，大于80%纯的、更优选大于90%纯的、和再更优选大于95%纯的组合物。
本发明的化合物可单独使用或与一种或多种附加治疗剂组合使用。例如，本发明的化合物可以与用于治疗炎症和/或自身免疫性疾病的药剂组合。实例包括NSAIDs或COX-2抑制剂，如布洛芬、阿司匹林、对乙酰氨基酚、塞来昔布、萘普生和酮洛芬；阿片类药物，如羟考酮和芬太尼；甲氨蝶呤；和皮质类固醇，如氢化可的松、泼尼松龙和泼尼松。
该化合物还可以与一种或多种有效治疗癌症的附加治疗剂组合。实例包括顺铂、卡铂、依托泊苷、吉西他滨、紫杉醇、长春瑞滨、拓扑替康、伊立替康、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和甲氨蝶呤。
示例性化合物和附加治疗剂（一种或多种）可以通过相同的递送途径和装置如单一药丸、胶囊或片剂一起给药；或在单独的递送装置中同时或相继分开给药。
化学部分
本发明的化合物或其盐可以通过多种程序制备，其中一些在下面的制备例和实施例中说明。下面的程序中各个步骤的产物可以通过常规方法回收，包括提取、蒸发、沉淀、层析、过滤、研磨和结晶。试剂和起始材料是本领域普通技术人员容易获得的。在下述的制备例中，可以保护胺取代基以促进本文中所述化合物的合成。
本文中所用的以下术语具有所示含义：“AcOH”是指冰醋酸；“EC50”是指与预先定义的阳性对照化合物相比，产生50%目标活性响应的药剂浓度(绝对EC50)；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“ES/MS”是指电喷雾质谱法；“DCM”是指二氯甲烷；“DMF”是指N,N-二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲亚砜；“GC-MS”是指气相色谱-质谱法；“GFP”是指绿色荧光蛋白；“HEPES”是指4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；“hr”或“hrs”是指小时；“IC50”是指产生对于该药剂可能的最大抑制响应的50%的药剂浓度(相对IC50)，或与安慰剂对照相比产生50%目标活性抑制的药剂浓度(绝对IC50)；“LC-MS”是指液相色谱-质谱法；“MeOH”是指甲醇；“min”是指分钟；“MS”是指质谱法；“MTBE”是指甲基叔丁基醚；“OAc”是指乙酸酯或乙酸根阴离子；“QD”是指一天一次；“RT或rt”是指室温；“STAT1”是指信号传导和转录激活因子1；“THF”是指四氢呋喃；和“TR-FRET”是指时间分辨荧光能量转移。
各种胺保护官能团在本领域中是已知的并包括：氨基甲酸酯，如氨基甲酸C1-5烷基酯、氨基甲酸C3-6环烷基酯，优选氨基甲酸叔丁酯、(BOC)或氨基甲酸苄酯(CBZ)；酰胺，如C1-3烷基酰胺、C1-3卤代烷基酰胺、甲酰胺或乙酰胺、氯乙酰胺、三氟乙酰胺；和苄胺。胺保护官能团的其他实例、制备受保护的胺取代基的方法和脱保护胺取代基的方法可见于“Greene'sProtective Groups in Organic Synthesis”, 第五版, Wuts, P.G.M.编辑, John Wileyand Sons, 2014。本领域技术人员会认识到，可以使用容易转化成胺基团的其它官能团。这样的官能团、这些基团的制备和转化可见于Larock. R.C,“Comprehensive OrganicTransformations: A Guide to Functional Group Preparations”, Wiley VCH, 1999和Smith, M.B.,“March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms andStructure”, Wiley-Interscience, 第七版, 2013。
制备例1
(2R)-2-(三氟甲基)环氧乙烷
将乙酸(0.89 mL, 0.052 eq)添加到(1S,2S)-(+)-1,2-环己烷二氨基-N,N'-双(3,5-二叔丁基亚水杨基)钴(II) (0.90 g, 0.0050 eq)在甲苯(16.65 mL)中的溶液中。在室温下搅拌30分钟。在真空下除去溶剂。添加甲苯(20 mL)并在真空下浓缩。冷却至0℃并添加2-(三氟甲基)环氧乙烷 (37.00 g, 330 mmol; 80.0 % ee, (2R)为主要对映体)。搅拌5分钟并逐滴添加水(0.80 mL, 0.15 eq)。缓慢温热至室温并搅拌整夜。在室温下真空蒸馏，并收集在冷却烧瓶中的浅黄色油状物形式的标题化合物(28.10 g, 76 %; 99.8 % ee)。1H NMR(CDCl3) δ 2.92-2.94 (m, 1H), 2.98-3.01 (m, 1H), 3.41-3.46 (m, 1H)。
将标题化合物(0.13 g, 1.16 mmol)和MeOH (1.3 mL)混合。冷却至0℃并添加三乙胺(0.17 mL, 1.10 eq)和苯硫酚(0.12 mL, 1.05 eq)。搅拌该混合物30分钟。经由GC-MS监控反应，形成1,1,1-三氟-3-苯基硫基-丙-2-醇；m/z = 222。经由手性LC-MS分析产物显示，产物的异构体纯度为99.8 % ee，(2S)-1,1,1-三氟-3-苯基硫基-丙-2-醇为主要对映体。
制备例2
1-溴-3,5-二氟-2-硝基苯
在0℃下将硝酸(发烟, 20 mL) 逐滴添加到1-溴-3,5-二氟苯(35.00 mL, 304 mmol)在硫酸(50 mL)中的溶液中。缓慢温热至室温并搅拌整夜。将反应混合物倒入冰水混合物(600 mL)中。缓慢温热至室温。添加EtOAc (200 mL)和己烷(100 mL)。搅拌直到所有固体溶剂。分离各层。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩滤液以得到黄色油状物形式的标题化合物(57.37 g, 79 %)。GC-MS m/z = (79Br/81Br) 237,239 (M+H)。
制备例3
3-溴-5-氟-N-甲基-2-硝基苯胺
将在四氢呋喃中的2 M一甲胺(92 mL, 2.00 eq)添加到1-溴-3,5-二氟-2-硝基苯(21.90 g, 92 mmol)在1,4-二氧杂环己烷(92 mL)中的溶液中。在室温下搅拌45分钟。添加水，然后用 EtOAc萃取。收集有机萃取物，并用饱和氯化钠水溶液洗涤。经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩滤液以得到残余物。使该残余物进行正相色谱法，用20-40% DCM/己烷梯度洗脱，得到橙色固体形式的标题化合物(16.95 g, 74 %)。MS (ES) m/z = (79Br/81Br) 249/251 (M+H)。
制备例4
{顺式-4-[3-溴-5-(甲基氨基)-4-硝基苯氧基]环己基}氨基甲酸叔丁酯
将3-溴-5-氟-N-甲基-2-硝基苯胺(75.04 g, 301 mmol)、(顺式-4-羟基环己基)氨基甲酸叔丁酯(89.52 g, 1.38 eq)、四(正丁基)硫酸氢铵(15.58 g, 0.15 eq)在DCM (975mL)和5 M氢氧化钠水溶液(241 mL)中混合。在37℃在氮气下迅速搅拌5天。冷却至室温。用DCM (200 mL)和水(400 mL)稀释。分离各层。用DCM (3 x 100 mL)萃取水层。合并的有机萃取物用饱和氯化钠水溶液洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩滤液以得到残余物。使该残余物进行正相色谱法，用0-40% DCM/己烷梯度洗脱，得到橙色固体形式的标题化合物(68.57 g, 51%)。MS (ES) m/z = (79Br/81Br) 442/444 (M-H)。
制备例5
{顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基甲酸叔丁酯
在Parr®反应器中将{顺式-4-[3-溴-5-(甲基氨基)-4-硝基苯氧基]环己基}氨基甲酸叔丁酯 (76.92 g, 173 mmol)和铂(5 %在硫化碳上, 3.85 g)在四氢呋喃(923 mL)中混合。在室温在H2 (414 kPa)下搅拌3天。通过硅藻土过滤。用THF洗涤硅藻土。将原甲酸三甲酯(165 mL, 8.70 eq)添加到合并的THF滤液中。在63℃下搅拌22小时。在真空下浓缩大部分反应混合物。用水(400 mL)和EtOAc (400 mL)稀释。用碳酸钠水溶液碱化以将pH调节至9。分离各层。用EtOAc (2 x 200 mL)萃取水层。将合并的有机萃取物经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩滤液。残余物用甲基叔丁基醚(400 mL)稀释并超声处理30分钟。过滤，用甲基叔丁基醚洗涤，并在真空下干燥以得到浅棕色固体形式的标题化合物(52.02 g,71%)。MS (ES) m/z = (79Br/81Br) 424/426 (M+H)。
制备例6
顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己胺
在0℃下将三氟乙酸(666 mL)缓慢添加到{顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基甲酸叔丁酯(222 g, 497 mmol)于DCM (1110 mL)中的溶液中。将混合物缓慢温热至室温并搅拌整夜。在真空下浓缩该混合物。添加水(250 mL)并用50%氢氧化钠水溶液碱化以将pH调节至10。添加水(250 mL)。用20% MeOH/DCM (1500 mL，然后500 mL，然后250 mL)萃取。合并的有机萃取物用2 M氢氧化钠水溶液洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤，并浓缩滤液以得到棕色固体形式的标题化合物(155 g, 91%)。MS (ES) m/z = (79Br/81Br)324/326 (M+H)。
制备例7
(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇
将(2R)-2-(三氟甲基)环氧乙烷(73.29 g, 1.50 eq)添加到顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己胺(150.4 g, 436 mmol)于MeOH (1053 mL)中的溶液中。在室温下搅拌整夜。在真空下浓缩反应混合物以得到残余物。使该残余物进行正相色谱法，用0-10% EtOH/DCM梯度洗脱，得到灰白色固体形式的标题化合物(98.10 g, 52%)。MS (ES)m/z = (79Br/81Br) 436/438 (M+H)。
制备例8
1-(3-甲氧基丙基)-5-甲基-3-硝基-1H-吡唑
将乙腈(56 mL)添加到5-甲基-3-硝基-1H-吡唑(3.0 g, 22 mmol)、碳酸钾(6.2 g,2.0 eq)和1-溴-3-甲氧基丙烷(3.8 g, 1.1 eq)的混合物中。在65℃下搅拌整夜。冷却至室温。添加EtOAc (~50 mL)并过滤。在真空下浓缩滤液。使残余物进行正相色谱法，用35%EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(3.3 g, 70%)。MS (ES) m/z = 200 (M+H)。
制备例9
1-(3-甲氧基丙基)-5-甲基-1H-吡唑-3-胺
将钯/炭(5% w/w, 0.38 g)添加到500 mL Parr®反应器中。用N2吹扫反应器并添加EtOH (100 mL)。添加1-(3-甲氧基丙基)-5-甲基-3-硝基-1H-吡唑(3.3 g, 17 mmol)于EtOH (100 mL)中的溶液。在室温在H2 (60 psi)下搅拌2小时。通过硅藻土过滤。滤液在真空下浓缩以得到橙色油状物形式的标题化合物(2.7 g, 96%)。MS (ES) m/z = 170 (M+H)。
制备例10
1-(2-甲氧基乙基)-5-甲基-3-硝基-1H-吡唑
将乙腈(35 mL)添加到5-甲基-3-硝基-1H-吡唑(0.95 g, 7.1 mmol)、碳酸钾(2.0 g,2.0 eq)和1-溴-2-甲氧基乙烷(2.0 mL, 3.0 eq)的混合物中。在75℃下搅拌3小时。冷却至室温。添加乙醚(~35 mL)并过滤。用EtOAc (2 x 25 mL)冲洗固体。在真空下浓缩滤液以得到残余物。使该残余物进行正相色谱法，用0-100% EtOAc/己烷梯度洗脱，得到黄色油状物形式的标题化合物(1.1 g, 64%)。MS (ES) m/z = 186 (M+H)。
制备例11
1-(2-甲氧基乙基)-5-甲基-1H-吡唑-3-胺
将钯/炭(10% w/w, 0.38 g)添加到烧瓶中。用N2吹扫并添加EtOH (10 mL)。添加1-(2-甲氧基乙基)-5-甲基-3-硝基-1H-吡唑(0.86 g, 4.6 mmol)于EtOH (40 mL)中的溶液。在室温在H2 (气球)下搅拌整夜。通过硅藻土过滤。滤液在真空下浓缩以得到棕色油状物形式的标题化合物(0.68 g, 84%)。MS (ES) m/z = 156 (M+H)。
制备例12
1-(5-甲基-3-硝基-1H-吡唑-1-基)丙-2-醇
将乙腈(75 mL)添加到5-甲基-3-硝基-1H-吡唑(2.0 g, 15 mmol)、碳酸钾(4.1 g,2.0 eq)和1-氯-2-丙醇(3.8 mL, 3.0 eq)的混合物中。在85℃下搅拌整夜。冷却至室温。过滤并用EtOAc冲洗固体。在真空下浓缩滤液以得到残余物。使残余物进行正相色谱法，用50%EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(2.0 g, 65%)。MS (ES) m/z = 186 (M+H)。
制备例13
1-(3-氨基-5-甲基-1H-吡唑-1-基)丙-2-醇
将钯/炭(10% w/w, 0.35 g)添加到烧瓶中。用N2吹扫并添加EtOH (50 mL)。添加1-(5-甲基-3-硝基-1H-吡唑-1-基)丙-2-醇(2.0 g, 11 mmol)于EtOH (150 mL)中的溶液。在室温在H2 (气球)下搅拌整夜。通过硅藻土过滤。滤液在真空下浓缩以得到粉红色油状物形式的标题化合物(1.2 g, 69%)。MS (ES) m/z = 156 (M+H)。
制备例14
(2S)-1-(5-甲基-3-硝基-1H-吡唑-1-基)丙-2-醇
将乙腈(45 mL)添加到5-甲基-3-硝基-1H-吡唑(1.2 g, 9.0 mmol)、碳酸钾(2.5 g,2.0 eq)和(S)-1-氯-2-丙醇(0.98 g, 1.2 eq)的混合物中。在85℃下搅拌4天。冷却至室温。过滤以收集固体并用EtOAc冲洗该固体，然后弃去固体。将滤液收集并在真空下浓缩以得到残余物。使残余物进行正相色谱法，用50% EtOAc/己烷洗脱，得到白色固体形式的标题化合物(1.1 g, 67%)。MS (ES) m/z = 186 (M+H)。
制备例15
(2S)-1-(3-氨基-5-甲基-1H-吡唑-1-基)丙-2-醇
将钯/炭(10% w/w, 0.22 g)添加到烧瓶中。添加(2S)-1-(5-甲基-3-硝基-1H-吡唑-1-基)丙-2-醇(1.1 g, 6.0 mmol)于EtOH (50 mL)中的溶液。在室温在H2 (气球)下搅拌整夜。通过硅藻土过滤。用MeOH洗涤固体。滤液在真空下浓缩以得到标题化合物(0.89 g,95%)。MS (ES) m/z = 156 (M+H)。
制备例16
(2R)-1-(5-甲基-3-硝基-1H-吡唑-1-基)丙-2-醇
将乙腈(41 mL)添加到5-甲基-3-硝基-1H-吡唑(1.1 g, 8.2 mmol)、碳酸钾(2.3 g,2.0 eq)和(R)-1-氯-2-丙醇(0.92 mL, 1.3 eq)的混合物中。在85℃下搅拌整夜。冷却至室温。过滤并用EtOAc冲洗固体。在真空下浓缩滤液以得到残余物。使残余物进行正相色谱法，用50% EtOAc/己烷洗脱，得到白色固体形式的标题化合物(0.74 g, 48%)。MS (ES) m/z =186 (M+H)。
制备例17
(2R)-1-(3-氨基-5-甲基-1H-吡唑-1-基)丙-2-醇
将钯/炭(10% w/w, 0.15 g)添加到烧瓶中。添加(2R)-1-(5-甲基-3-硝基-1H-吡唑-1-基)丙-2-醇(0.74 g, 4.0 mmol)于EtOH (33 mL)中的溶液。在室温在H2 (气球)下搅拌整夜。通过硅藻土过滤。用MeOH洗涤固体。滤液在真空下浓缩以得到黄色固体形式的标题化合物(0.58 g, 95%)。MS (ES) m/z = 156 (M+H)。
制备例18
8-甲基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-甲酸乙酯
将二异丙胺(55 mL, 1.36 eq)和2-甲基四氢呋喃(500 mL)混合。在N2下冷却至-20℃。经10分钟逐滴添加2.5 M正丁基锂/己烷(150 mL, 1.30 eq)，然后在-20℃下将溶液再搅拌15分钟。经20分钟将溶液经由套管转移至在-40℃下的1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-甲酸乙酯(50 mL, 287 mmol)于2-甲基四氢呋喃(500 mL)中的溶液中。在-40℃下将溶液搅拌10分钟。经10分钟逐滴添加碘甲烷(30 mL, 1.68 eq)于2-甲基四氢呋喃(60 mL)中的溶液。在-40℃下搅拌1小时。使其缓慢温热至室温并搅拌整夜。用饱和氯化铵水溶液(150 mL)淬灭。分离各层。用甲基叔丁基醚(50 mL)萃取水层。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩以得到黄色油状物形式的标题化合物(63.3 g, 97%)。1H NMR (CDCl3) δ 1.16(s, 3H), 1.20-1.25 (m, 3H), 1.42-1.66 (m, 6H), 2.07-2.14 (m, 2H), 3.91 (s,4H), 4.08-4.15 (m, 2H)。
制备例19
8-甲基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-甲酸
将8-甲基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-甲酸乙酯(20 g, 88 mmol)、MeOH (100 mL)和3M氢氧化钠/水(140 mL)混合。将反应混合物在回流下加热整夜。在真空下浓缩并用水(150mL)和甲基叔丁基醚(50 mL)稀释。分离各层并弃去有机层。用3% w/w盐酸水溶液将水层酸化以将pH调节至2。用甲基叔丁基醚(3 x 100 mL)萃取。合并的有机物经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩以得到黄色油性固体形式的标题化合物(12.6 g, 72%)。1H NMR(CDCl3) δ 1.25 (s, 3H), 1.47-1.60 (m, 2H), 1.65-1.70 (m, 4H), 2.08-2.17 (m,2H), 3.93 (s, 4H)。
制备例20
(8-甲基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-基)氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯
将8-甲基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-甲酸 (12 g, 60 mmol)和乙腈(200 mL)混合。添加三乙胺(25.5 mL, 3.11 eq)和叠氮磷酸二苯酯(15 mL, 1.18 eq)。在室温在N2下搅拌2小时。添加烯丙醇(25 mL, 6.25 eq)。将反应混合物在回流下搅拌整夜。在真空下浓缩并用水(150 mL)和甲基叔丁基醚(150 mL)稀释。分离各层。用甲基叔丁基醚(2 x 100 mL)萃取水层。合并的有机物经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩以得到棕色油状物形式的标题化合物(10.8 g, 71%)。1H NMR (CDCl3) δ 1.34 (s, 3H), 1.57-1.69 (m, 6H),1.98-2.11 (m, 2H), 3.92-3.93 (m, 4H), 4.48-4.66 (m, 3H), 5.16-5.32 (m, 2H),5.82-5.99 (m, 1H)。
制备例21
(1-甲基-4-氧代环己基)氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯
将(8-甲基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-基)氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(10.5 g, 41mmol)、丙酮(30 mL)和水(3 mL)混合。添加35% 盐酸(2.7 mL)。在室温下搅拌整夜。在真空下浓缩反应混合物以除去丙酮。用甲基叔丁基醚(100 mL)稀释。用6 M碳酸钾水溶液碱化以将pH调节至8。分离各层。用甲基叔丁基醚(2 x 20 mL)萃取水层。合并的有机物经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩以得到残余物。使该残余物进行正相色谱法，用20-100%甲基叔丁基醚/己烷的梯度洗脱，得到无色油状物形式的标题化合物(6.0 g, 69%)。1H NMR(CDCl3) δ 1.44 (s, 3H), 1.76-1.88 (m, 2H), 2.24-2.51 (m, 6H), 4.54 (d, 2H),4.78 (s, 1H), 5.20-5.35 (m, 2H), 5.85-6.00 (m, 1H)。
制备例22
(顺式-4-羟基-1-甲基环己基)氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯
将0.1 M磷酸二氢钾缓冲液(pH 7, 500 mL)、MgSO4 (0.12 g)、NADP (0.27 g)和酮还原酶-P1-B10 (0.32 g)添加到(1-甲基-4-氧代环己基)氨基甲酸丙-2-烯-1基酯(32.8 g,155 mmol)于异丙醇(110 mL)中的溶液中。在35℃下搅拌24小时。用EtOAc萃取。有机物经无水MgSO4干燥，过滤，并在真空下浓缩滤液以得到黄色油状物形式的标题化合物(32.41 g,98%)。1H NMR (CDCl3) δ 1.18-1.50 (m, 7H), 1.57-1.88 (m, 3H), 1.98-2.14 (m,2H), 3.55-3.65 (m, 1H), 4.46-4.66 (m, 3H), 5.17-5.32 (m, 2H), 5.83-5.96 (m,1H)。已知3.55-3.65 ppm处的质子多重谱线是顺式构型。
制备例23
{顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]-1-甲基环己基}氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯
将5 M氢氧化钠水溶液(270 mL)和四(正丁基)硫酸氢铵(7.50 g, 0.18 eq)添加到3-溴-5-氟-N-甲基-2-硝基苯胺(30.00 g, 120 mmol)和(顺式-4-羟基-1-甲基环己基)氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(33.00 g, 1.28 eq)于DCM (300 mL)中的溶液中。在室温下快速搅拌混合物24小时。添加四丁基硫酸氢铵(7.50 g, 0.18 eq)。在室温下快速搅拌整夜。用水(20mL)稀释。分离各层。用DCM (2 x 150 mL)萃取水层。合并的有机萃取物用5% w/w氯化钠水溶液(200 mL)和水(200 mL)洗涤；然后在真空下浓缩有机萃取物。将浓缩的有机萃取物和乙酸(650 mL)混合。添加原甲酸三甲酯(45 mL)。在90℃在氮气下搅拌2.5小时。用EtOAc(500 mL)稀释。通过硅藻土垫过滤。用EtOAc洗涤该垫。在真空下浓缩合并的滤液。用2 M磷酸氢二钾水溶液(60 mL)和2-甲基四氢呋喃(60 mL)稀释。搅拌20分钟，然后通过硅藻土过滤。分离各层。用2-甲基四氢呋喃 (2 x 20 mL)萃取水层。将有机萃取物合并，用水洗涤，并在真空下浓缩。用1-甲基-2-吡咯烷酮(100 mL)稀释并搅拌以获得均匀混合物。经30分钟将该混合物逐滴添加到水(1200 mL)中。搅拌30分钟，过滤以收集固体，并用水洗涤该固体。将该固体溶解在2-甲基四氢呋喃(250 mL)中并在真空下浓缩。溶液用异丙醇(3 x 150 mL)稀释并在真空下浓缩。该溶液用2-甲基四氢呋喃(10 mL)稀释，并在真空下浓缩以得到油性棕色残余物形式的标题化合物(31.5 g, 74%)。MS (ES) m/z = (79Br/81Br) 422/424 (M+H)。
制备例24
顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]-1-甲基环己胺
将{顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]-1-甲基环己基}氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(30 g, 71 mmol)、双(二亚苄基丙酮)钯(0.50 g, 0.017 eq)、1,4-双(二苯基膦基)丁烷(0.50 g, 0.022 eq)和硫代水杨酸(15 g, 1.90 eq)在2-甲基四氢呋喃(700 mL)中混合。将反应混合物在50℃下加热1小时。用水(300 mL)和甲基叔丁基醚(300 mL)稀释。用35%盐酸酸化以将pH调节至2。分离各层，并弃去有机层。用EtOAc (20 mL)稀释水层并搅拌10分钟。分离各层，并弃去有机物。用DCM (150 mL)稀释水层并搅拌10分钟。分离各层，并弃去有机物。用氢氧化钠碱化水层。过滤；收集固体；然后使所得固体进行正相色谱法，用5%2 M氨化MeOH/DCM洗脱，以得到标题化合物(12.0 g, 50%)。MS (ES) m/z = (79Br/81Br)338/340 (M+H)。
制备例25
(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]-1-甲基环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇
将顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]-1-甲基环己胺(11.6 g, 34mmol)、(2R)-2-(三氟甲基)环氧乙烷(4.00 g, 1.05 eq)、EtOH (45 mL)和水(45 mL)在玻璃压力反应器中混合。将反应混合物密封并在90℃下加热1小时。使其冷却至室温。添加(2R)-2-(三氟甲基)环氧乙烷(0.44 g, 0.12 eq)。将反应混合物密封并在90℃下加热1小时。在真空下浓缩。用水(100 mL)、甲基叔丁基醚(20 mL)和EtOAc (20 mL)稀释。用35%盐酸水溶液酸化以将pH调节至2，并搅拌直到获得完全溶液。分离各层并弃去有机层。用甲基叔丁基醚(40 mL)稀释水层。分离各层并弃去有机层。用50% w/w氢氧化钠水溶液将水层碱化以将pH调节至10。水层用EtOAc (2 x 50 mL)萃取。将有机萃取物合并并在真空下浓缩。由EtOAc (50 mL)结晶出固体。过滤以收集固体，然后用EtOAc洗涤所得固体以得到白色固体形式的标题化合物(6.3 g, 41%)。MS (ES) m/z = (79Br/81Br) 450/452 (M+H)。
浓缩来自结晶母液的滤液以得到残余物。使该残余物进行正相色谱法，用5% 2 M氨化MeOH/EtOAc洗脱，得到灰白色固体形式的另外的标题化合物(3.3 g, 21%)。MS (ES)m/z = (79Br/81Br) 450/452 (M+H)。
制备例26
(2R)-2-(二氟甲基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷
将(3R)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-3-甲醛(15.98 g, 89.19 mmol)溶解在DCM (80 mL)中。置于N2下并将溶液冷却至0℃。小心地逐滴添加二乙胺基三氟化硫(15 mL, 1.2 eq)。使其缓慢温热至室温并搅拌整夜。将混合物缓慢倒入碎冰、饱和碳酸氢钠水溶液和DCM的搅拌混合物中。添加磷酸氢二钾(5 g)并分批添加碳酸钾，保持pH ~7-8，直到不再观察到鼓泡。搅拌20分钟。分离各层。用DCM (3 x )萃取水层。用1M亚硫酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤合并的有机萃取物。有机物经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩滤液以得到琥珀色油状物形式的标题化合物(17.37 g, 93%)。GC-MS m/z = 192。
制备例27
4-甲基苯磺酸(2R)-3,3-二氟-2-羟基丙酯
将(2R)-2-(二氟甲基)-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷(9.08 g, 47.2 mmol)溶解在MeOH(250 mL)中。添加对甲苯磺酸一水合物(0.70 g, 0.1 eq)。在室温下搅拌1周。添加碳酸氢钠(0.60 g)。搅拌1小时。添加硅胶和三甲胺(3 mL)。搅拌10分钟。在真空下浓缩并通过正相色谱法纯化，用15-100% EtOAc/己烷梯度洗脱，以得到黄色油状物形式的(2R)-3,3-二氟丙烷-1,2-二醇(2.95 g)。
将(2R)-3,3-二氟丙烷-1,2-二醇(2.0 g, 15.2 mmol)溶解在DCM (40 mL)中。置于氮气下并将溶液冷却至0℃。添加2,6-二甲基吡啶(8.0 mL, 4.5 eq)。分批添加对甲苯磺酰氯(3.0 g, 1.0 eq)。使其缓慢温热至室温并搅拌2天。冷却至-78℃并逐滴添加三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(1.5 mL, 0.5 eq)。经40分钟使其温热至0℃。逐滴添加三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(1.5 mL, 0.5 eq)。搅拌30分钟并用MeOH (5 mL)淬灭。用DCM稀释并添加磷酸钠(4.9 g)于水(75 mL)中的溶液。用2M 硫酸氢钾水溶液将pH调节至~3。分离各层。用乙醚萃取水层。有机萃取物经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩滤液。添加乙二醇(1mL)和硅胶(~20 g)。在真空下浓缩以得到残余物。使该残余物进行正相色谱法，用20-100%B/A梯度洗脱(A: 己烷，B: 6:3:1 己烷:DCM:THF)，以得到标题化合物(1.37 g, 16%)。GC-MS m/z = 266。
制备例28
6-[(顺式-4-氨基环己基)氧基]-N-(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-4-胺
将顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己胺(25.70 g, 79.27 mmol)、1,5-二甲基-1H-吡唑-3-胺(9.08 g, 1.0 eq)、碳酸钾(28.48 g, 2.6 eq)、2-(二环己基膦基)3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯(8.60 g, 0.20 eq)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0) (3.63 g, 0.050 eq)和乙酸(0.14 mL)在叔丁醇(250 mL)中混合。在回流下加热整夜。在真空下浓缩反应混合物。添加DCM和水；分离各层。有机物经无水硫酸镁干燥，过滤，并在真空下浓缩。由EtOAc和己烷研磨，以得到褐色固体。使该褐色固体进行正相色谱法，用己烷、然后5% MeOH/DCM、然后20% 2M氨化MeOH/DCM洗脱，以得到褐色固体形式的标题化合物(21.71 g, 77%)。MS (ES) m/z = 355 (M+H)。
制备例29
2-(3-硝基-1H-吡唑-1-基)吡啶
在两个单独小瓶的每一个中，将3-硝基-1H-吡唑(3.0 g, 27 mmol)、2-氟吡啶(2.9mL, 1.3 eq)和三乙胺(4.6 mL, 1.2 eq)在1-甲基-2-吡咯烷酮(20 mL)中混合。密封并在180℃下搅拌整夜。冷却至室温。将反应混合物合并并用水稀释。过滤以收集固体，用水洗涤该固体，并在真空下干燥以得到标题化合物(5.9 g, 58%)。MS (ES) m/z = 191 (M+H)。
制备例30
1-吡啶-2-基-1H-吡唑-3-胺
将钯/炭(10% w/w, 1.9 g)添加到烧瓶中。用N2吹扫并添加EtOH (200 mL)。添加2-(3-硝基-1H-吡唑-1-基)吡啶(2.5 g, 13 mmol)。在室温在H2 (气球)下搅拌整夜。添加少量的硅藻土并搅拌5分钟。通过硅藻土垫过滤，并用EtOH洗涤该垫。滤液在真空下浓缩以得到棕色固体形式的标题化合物(1.8 g, 85%)。MS (ES) m/z = 161 (M+H)。
制备例31
1-(甲基磺酰基)-3-硝基-1H-吡唑
将3-硝基-1H-吡唑(3.0 g, 27 mmol)、甲磺酰氯(2.5 mL, 1.2 eq)和三乙胺(4.4 mL,1.2 eq)在DCM (20 mL)中混合。在室温下搅拌2小时。用DCM和饱和碳酸氢钠水溶液稀释。分离各层。用水和盐水洗涤有机层。有机层经无水MgSO4干燥，过滤，并在真空下浓缩滤液以得到棕色固体形式的标题化合物(3.7 g, 73%)。1H NMR (DMSO-d6) δ 3.74 (s, 3H), 7.30(d, J = 2.9 Hz, 1H), 8.55 (d, J = 2.9 Hz, 1H)。
制备例32
3-硝基-1-四氢-2H-吡喃-3-基-1H-吡唑
将四氢吡喃-3-醇(1.3 g, 13 mmol)、1-(甲基磺酰基)-3-硝基-1H-吡唑(2.4 g, 1.0eq)和碳酸铯(4.8 g, 1.2 eq)在乙腈(40 mL)中混合。在90℃下搅拌整夜。在真空下浓缩混合物。用EtOAc稀释并通过硅藻土垫过滤。在真空下浓缩滤液以得到残余物。使该残余物进行C-18反相色谱法，用0%至100%的(0.1%甲酸/乙腈)/(0.1%甲酸/水)的梯度洗脱，以得到标题化合物(0.35 g, 14%)。MS (ES) m/z = 198 (M+H)。
制备例33
1-(四氢-2H-吡喃-3-基)-1H-吡唑-3-胺
将钯/炭(10% w/w, 0.10 g)添加到烧瓶中。用N2吹扫并添加EtOH (20 mL)。添加3-硝基-1-四氢-2H-吡喃-3-基-1H-吡唑(0.30 g, 1.5 mmol)。在室温在H2 (气球)下搅拌2小时。通过硅藻土过滤并用EtOH洗涤。滤液在真空下浓缩以得到灰色固体形式的标题化合物(0.24 g, 94%)。MS (ES) m/z = 168 (M+H)。
实施例 1
(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(4-{[1-(3-甲氧基丙基)-5-甲基-1H-吡唑-3-基]氨基}-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇
将(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇(4.0 g, 9.2 mmol)、1-(3-甲氧基丙基)-5-甲基-1H-吡唑-3-胺(2.2 g, 1.4eq)、碳酸钾(3.2 g, 2.5 eq)、2-(二叔丁基膦基)-2',4',6'-三异丙基-3,6-二甲氧基-1,1'-联苯(0.92 g, 0.20 eq)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0) (0.87 g, 0.10 eq)和乙酸(0.01mL)在叔丁醇(46 mL)中混合。在90℃下加热整夜。通过硅藻土垫过滤，并用EtOAc洗涤该垫。在真空下浓缩滤液以得到残余物。使该残余物进行正相色谱法，用5% MeOH/DCM洗脱，以得到粗产物。通过反相色谱法进一步纯化该粗产物，用15-60% B/A梯度洗脱(A: 10 mM碳酸氢铵/MeOH，B: 乙腈)。浓缩含有产物的级分以除去大部分乙腈。添加EtOAc并分离各层。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，经硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩滤液。通过正相色谱法进一步纯化产物，用5% MeOH/DCM洗脱，以得到白色固体形式的标题化合物(2.4 g, 49%)。MS(ES) m/z = 525 (M+H)。
实施例 2
(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(4-{[1-(2-甲氧基乙基)-5-甲基-1H-吡唑-3-基]氨基}-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇
将(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇(1.4 g, 3.2 mmol)、1-(2-甲氧基乙基)-5-甲基-1H-吡唑-3-胺(0.69 g, 1.4eq)、碳酸钾(1.1 g, 2.6 eq)、2-(二环己基膦基)3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯(0.35 g, 0.20 eq)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0) (0.15 g, 0.050 eq)和乙酸(0.01 mL)在叔丁醇(32 mL)中混合。在回流下加热整夜。在真空下浓缩反应混合物。添加DCM和水；分离各层。通过ISOLUTE® HM-N材料过滤有机层，用DCM和EtOAc洗涤。在真空下浓缩滤液以得到残余物。使该残余物进行正相色谱法，用30-100% B/A梯度洗脱(A: DCM，B:15% 2M氨化MeOH/DCM)，以得到灰白色固体形式的标题化合物(0.91 g, 56%)。MS (ES) m/z= 511 (M+H)。
实施例 3
(2R)-1,1,1-三氟-3-[(顺式-4-{[4-({1-(2-羟丙基)-5-甲基-1H-吡唑-3-基}氨基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基]氧基}环己基)氨基]丙-2-醇
将(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇(0.35 g, 0.80 mmol)、1-(3-氨基-5-甲基-1H-吡唑-1-基)丙-2-醇(0.14 g,1.1 eq)、碳酸钾(0.28 g, 2.5 eq)、2-(二叔丁基膦基)-2',4',6'-三异丙基-3,6-二甲氧基-1,1'-联苯(0.12 g, 0.30 eq)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0) (0.055 g, 0.075 eq)和乙酸(0.01 mL)在叔丁醇(5.3 mL)中混合。在100℃下加热整夜。在真空下浓缩反应混合物以得到残余物。使该残余物进行C-18反相色谱法，用0%-80%的乙腈/(10mM碳酸氢铵/甲醇)的梯度洗脱。在真空下浓缩含有产物(为异构体的混合物)的级分以得到白色固体形式的标题化合物(0.29 g, 71%)。MS (ES) m/z = 511 (M+H)。
使用以下手性色谱条件分离混合物中的异构体，以得到：
第一洗脱对映体1(0.12 g, 99% ee)。MS (ES) m/z = 511 (M+H), 75%/25% CO2/异丙醇, 5 mL/min, 4.6 x 150 mm, Chiralpak AD-H。
第二洗脱对映体2(0.11 g, 97% ee)。MS (ES) m/z = 511 (M+H), 75%/25% CO2/异丙醇, 5 mL/min, 4.6 x 150 mm, Chiralpak AD-H。
实施例 4
(2R)-1,1,1-三氟-3-[(顺式-4-{[4-({1-[(2S)-2-羟丙基]-5-甲基-1H-吡唑-3-基}氨基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基]氧基}环己基)氨基]丙-2-醇
将(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇(0.40 g, 0.92 mmol)、(2S)-1-(3-氨基-5-甲基-1H-吡唑-1-基)丙-2-醇(0.17 g, 1.2 eq)、碳酸钾(0.33 g, 2.6 eq)、2-(二环己基膦基)3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯(0.099 g, 0.20 eq)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0) (0.042 g,0.050 eq)和乙酸(0.01 mL)在叔丁醇(10 mL)中混合。用压接盖密封。在微波反应器中在140℃下将混合物加热60分钟。在真空下浓缩反应混合物。添加DCM和水；分离各层。通过ISOLUTE® HM-N材料过滤有机层，用DCM和EtOAc洗涤该材料。在真空下浓缩滤液以得到残余物。用EtOAc/己烷研磨该残余物，以得到标题化合物(0.44 g, 95%)。MS (ES) m/z = 511(M+H)。
实施例 5
(2R)-1,1,1-三氟-3-[(顺式-4-{[4-({1-[(2R)-2-羟丙基]-5-甲基-1H-吡唑-3-基}氨基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基]氧基}环己基)氨基]丙-2-醇
将(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇(0.15 g, 0.34 mmol)、(2R)-1-(3-氨基-5-甲基-1H-吡唑-1-基)丙-2-醇(0.064 g, 1.2 eq)、碳酸钾(0.12 g, 2.6 eq)、2-(二环己基膦基)3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯(0.037 g, 0.20 eq)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0) (0.016 g,0.050 eq)和乙酸(0.01 mL)在叔丁醇(10 mL)中混合。用压接盖密封。在微波反应器中在140℃下将混合物加热60分钟。在真空下浓缩混合物以得到残余物。将DCM和水添加到该残余物中，并分离各层。通过ISOLUTE® HM-N材料过滤有机层，用DCM和EtOAc洗涤该材料。在真空下浓缩滤液。用EtOAc/己烷研磨以得到褐色固体形式的标题化合物(0.11 g, 62%)。MS(ES) m/z = 511 (M+H)。
实施例 6
(2R)-1,1,1-三氟-3-{[顺式-4-({4-[(5-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}丙-2-醇
将2-甲基丁-2-醇(120 mL)添加到(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇(10 g, 22.9 mmol)、5-甲氧基-1-甲基-吡唑-3-胺(3.6 g, 28.8 mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯-(0) (1.8 g, 2 mmol)、二叔丁基(2',4',6'-三异丙基-3,6-二甲氧基-[1,1'-联苯]-2-基)膦(1.3 g, 2.4 mmol)和碳酸钾(9 g,65 mmol)的混合物中。通过将N2气鼓泡通过混合物来对该混合物进行脱气，然后添加乙酸(118 uL, 2 mmol)。在N2下在100℃将混合物加热并搅拌20小时。冷却至室温；蒸发溶剂；然后添加EtOAc (100 mL)、水(50 mL)和炭(1 g)。搅拌该混合物15分钟，并通过硅藻土过滤该混合物。收集滤液并分离有机层。添加水(100 mL)和浓盐酸以将pH调节至2。添加炭(1.5g)，搅拌混合物30分钟并通过硅藻土过滤该混合物。将滤液转移至分液漏斗，并分离出水层。在水层上添加浓氢氧化铵溶液以将pH调节至10，得到浅奶油色固体。使该固体进行硅胶色谱法，用二氯甲烷和MeOH (95:5)的混合物洗脱。收集所需级分，并蒸发溶剂，以得到浅奶油色物质形式的标题化合物(6.5 g, 13 mmol)，收率64%。
从环戊基甲基醚(45 mL)中结晶出标题化合物，以得到(2R)-1,1,1-三氟-3-[[4-[7-[(5-甲氧基-1-甲基-吡唑-3-基)氨基]-3-甲基-苯并咪唑-5-基]氧基环己基]氨基]丙-2-醇(3.2 g, 6.5 mmol)。在22℃下搅拌混合物18小时。蒸发溶剂并将白色固体干燥至恒重，以得到白色固体形式的标题化合物(3.2 g, 6.4 mmol)，收率99%。MS (m/z): 483.2 (M+H)。1H NMR (300.16 MHz, DMSO): 8.13 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.46 (d, J= 1.9Hz, 1H), 6.46 (d, J= 1.9 Hz, 1H), 5.49 (s, 1H), 4.45 (s, 1H), 3.83 (s, 3H),3.73 (s, 3H), 3.47 (s, 3H), 2.75-2.67 (m, 2H), 1.99-1.91 (m, 2H), 1.67-1.54(m, 7H)。
实施例 7
(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(乙基-5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1,1-三氟丙-2-醇
将(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇(1.36 g, 3.12 mmol)、1-乙基-5-甲基-1H-吡唑-3-胺(0.78 g, 2.0 eq)、碳酸钾(1.12 g, 2.6 eq)、2-(二环己基膦基)3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯(0.34 g, 0.20 eq)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0) (0.14 g, 0.050 eq)和乙酸(0.01 mL)在叔丁醇(30 mL)中混合。在回流下加热整夜。在真空下浓缩反应混合物。添加DCM和水；分离各层。通过ISOLUTE® HM-N材料过滤有机层，用DCM洗涤。在真空下浓缩滤液以得到残余物。在EtOAc和己烷中研磨该残余物，以得到标题化合物(1.40 g, 94%)。MS (ES) m/z = 481(M+H)。
实施例 8
(2R)-1,1,1-三氟-3-[(顺式-1-甲基-4-{[1-甲基-4-(1H-吡唑-3-基氨基)-1H-苯并咪唑-6-基]氧基}环己基)氨基]丙-2-醇
将(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]-1-甲基环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇(0.91 g, 2.02 mmol)、3-氨基吡唑(0.29 g, 1.70 eq)、碳酸钾(0.73 g, 2.6 eq)、2-(二环己基膦基)3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯(0.22 g, 0.20 eq)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0) (0.093 g, 0.050 eq)和乙酸(0.01 mL)在叔丁醇(20 mL)中混合。将混合物回流整夜。在真空下浓缩该混合物。添加DCM和水；分离各层。通过ISOLUTE® HM-N材料过滤有机层，用DCM洗涤。在真空下浓缩滤液以得到残余物。使该残余物进行正相色谱法，用50-100% B/A梯度洗脱(A: 甲基叔丁基醚，B: 15% 7M氨化MeOH/DCM)，以得到标题化合物(0.67 g, 74%)。MS (ES) m/z = 453 (M+H)。
实施例 9
(2R)-3-{[顺式-4-({4-[(1.5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基}氧基)环己基]氨基}-1,1-二氟丙-2-醇
将4-甲基苯磺酸(2R)-3,3-二氟-2-羟丙酯(0.38 g, 1.31 mmol)和6-[(顺式-4-氨基环己基)氧基]-N-(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-4-胺(0.61 g, 1.30eq)在乙腈(3 mL)和2-丙醇(3 mL)中混合。添加N,N-二异丙基乙胺(0.50 mL, 2.0 eq)和碘化钠(0.015 g, 0.1 eq)。在65℃下加热整夜。添加4-甲基苯磺酸(2R)-3,3-二氟-2-羟丙酯(0.065 g, 0.22 mmol)并在65℃下加热整夜。通过硅藻土过滤。用EtOAc洗涤固体。在真空下浓缩滤液。通过反相色谱法纯化，用0-90%乙腈/水梯度洗脱。在真空下浓缩含有产物的级分，以得到灰白色固体形式的标题化合物(0.40 g, 67%)。MS (ES) m/z = 449 (M+H)。
实施例 10
(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇
将(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇(1.8 g, 4.1 mmol)、1-吡啶-2-基-1H-吡唑-3-胺(0.86 g, 1.3 eq)、碳酸钾(1.7 g, 2.9 eq)、2-(二叔丁基膦基)-2',4',6'-三异丙基-3,6-二甲氧基-1,1'-联苯(0.83 g, 0.41 eq)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0) (0.38 g, 0.10 eq)和乙酸(0.03 mL)在叔丁醇(22 mL)中混合。在90℃下将混合物加热3小时。将该混合物冷却至室温。通过硅藻土垫过滤，并用EtOAc洗涤该垫。在真空下浓缩滤液以得到残余物。使该残余物进行正相色谱法，用0-10% MeOH/DCM梯度洗脱，以得到标题化合物(1.34 g, 63%)。MS (ES) m/z = 516(M+H)。
可以通过将基本上如上所述制备的固体物质溶解在2-丁酮(100质量%)中，然后将所得混合物加热至65℃来获得结晶游离碱物质。将混合物冷却至20℃，并添加庚烷(100质量%)以引起沉淀。收集所得固体并用庚烷洗涤，空气干燥15分钟，然后在烘箱中在40℃下干燥整夜，以得到无水结晶游离碱形式的标题化合物，收率62%。
实施例10的X射线粉末衍射
在配备有CuKa源(λ = 1.54060 Å)和Vantec检测器的Bruker D4 Endeavor X射线粉末衍射仪上在35 kV和50 mA操作下获得结晶固体的XRD图。在4至40°2θ扫描样品，步长0.0087°2θ，扫描速率0.5秒/步，发散狭缝0.6mm，固定防散射狭缝5.28mm和检测器狭缝9.5mm。将干燥粉末填装在石英样品架上，并使用载玻片获得平滑的表面。在结晶学领域中众所周知的是，对于任何给定晶形，衍射峰的相对强度可能由于诸如晶体形态和习性等因素导致的择优取向而变化。当存在择优取向的效应时，峰强度改变，但多晶形物的特征峰位置不变。参见例如The U. S. Pharmacopeia 38 - National Formulary 35 ChapterCharacterization of crystalline and partially crystalline solids by X-raypowder diffraction (XRPD) Official May 1, 2015。此外，在结晶学领域中也众所周知的是，对于任何给定晶形，角峰位置可能稍微改变。例如，由于分析样品时的温度或湿度的变化、样品移位或内标的存在与否，峰位置可能移动。在本发明的情况下，±0.2 2θ的峰位置可变性将考虑这些潜在变化而不妨碍明确鉴定所指示的晶形。可以基于特征峰(以°2θ为单位)（通常为较显著的峰）的任何独特的组合确认晶形。在室温和相对湿度下收集的晶形衍射图基于在8.85和26.77°2-θ的NIST 675标准峰进行调整。
因此，实施例10的游离碱化合物的制备样品通过使用CuKa辐射获得的具有如下表1中所述衍射峰(2-θ值)的XRD图表征。具体地，该图含有在20.5处的峰以及一个或多个选自15.5、18.1、18.3、18.5、22.9和23.6处的峰，衍射角的容差为0.2度。
表1
实施例10的X射线粉末衍射峰
实施例11A和11B
(2R)-1,1,1-三氟-3-[(顺式-4-{[1-甲基-4-({1-[(3R)-四氢-2H-吡喃-3-基]-1H-吡唑-3-基}氨基)-1H-苯并咪唑-6-基]氧基}环己基)氨基]丙-2-醇
(2R)-1,1,1-三氟-3-[(顺式-4-{[1-甲基-4-({1-[(3S)-四氢-2H-吡喃-3-基]-1H-吡唑-3-基}氨基)-1H-苯并咪唑-6-基]氧基}环己基)氨基]丙-2-醇
首先将化合物制备成外消旋混合物。将(2R)-3-({顺式-4-[(4-溴-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)-1,1,1-三氟丙-2-醇(0.62 g, 1.2 mmol)、1-(四氢-2H-吡喃-3-基)-1H-吡唑-3-胺(0.20 g, 1.2 mmol)、碳酸钾(0.42 g, 2.5 eq)、2-(二叔丁基膦基)-2',4',6'-三异丙基-3,6-二甲氧基-1,1'-联苯(0.18 g, 0.30 eq)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0) (0.085 g, 0.075 eq)和乙酸(0.02 mL)在叔丁醇(6 mL)中混合。在100℃下加热7小时。将反应混合物冷却至室温。在真空下浓缩反应混合物。用EtOAc稀释。通过硅藻土垫过滤，并用EtOAc洗涤该垫。将饱和碳酸氢钠水溶液添加到滤液中。分离各层。用水和盐水洗涤有机层。有机层经无水MgSO4干燥，过滤，并在真空下浓缩滤液以得到残余物。使该残余物进行正相色谱法，用0-30% MeOH/DCM梯度洗脱，以得到标题化合物(0.31 g, 49%)。MS(ES) m/z = 523 (M+H)。
通过首先制备5-(三氟甲基)噁唑烷-2-酮衍生物来分离异构体：
(5R)-3-(顺式-4-{[1-甲基-4-({1-[(3R)-四氢-2H-吡喃-3-基]-1H-吡唑-3-基}氨基)-1H-苯并咪唑-6-基]氧基}环己基)-5-(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-2-酮，
(5R)-3-(顺式-4-{[1-甲基-4-({1-[(3S)-四氢-2H-吡喃-3-基]-1H-吡唑-3-基}氨基)-1H-苯并咪唑-6-基]氧基}环己基)-5-(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-2-酮
将(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(四氢-2H-吡喃-3-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇(0.25 g, 0.42 mmol)、1,1'-羰基二咪唑(0.14 g, 2.0 eq)和4-二甲基氨基吡啶(0.011 g, 0.21 eq)在DCM (2 mL)中混合。在室温下搅拌3天。在真空下浓缩以得到残余物。使该残余物进行正相色谱法，用0-20% MeOH/DCM梯度洗脱，以得到(5R)-3-(顺式-4-{[1-甲基-4-({1-[四氢-2H-吡喃-3-基]-1H-吡唑-3-基}氨基)-1H-苯并咪唑-6-基]氧基}环己基)-5-(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-2-酮的外消旋混合物。通过手性色谱法分离异构体，使用60%/40% CO2/异丙醇, 5 mL/min, 4.6x 150 mm, Lux Amylose-2。
异构体1 (0.10 g, 99% ee)。保留时间2.98 min。MS (ES) m/z = 549 (M+H)。
异构体2 (0.10 g, 99% ee)。保留时间4.83 min。MS (ES) m/z = 549 (M+H)。
异构体1
(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(四氢-2H-吡喃-3-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇
将(5R)-3-(顺式-4-{[1-甲基-4-({1-[四氢-2H-吡喃-3-基]-1H-吡唑-3-基}氨基)-1H-苯并咪唑-6-基]氧基}环己基)-5-(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-2-酮(异构体1) (0.080 g,0.15 mmol)和三甲基硅醇钾(0.041 g, 2.0 eq)在THF (2 mL)中混合。在65℃下搅拌3天。添加三甲基硅醇钾(0.018 g, 1.0 eq)。在65℃下搅拌整夜。使其冷却至室温。用几滴水稀释并在真空下浓缩。通过C-18反相色谱法纯化，使用0%-100%乙腈/(10mM碳酸氢铵/甲醇)梯度，以得到标题化合物(0.055 g, 72%)。MS (ES) m/z = 523 (M+H)。
异构体2
(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(四氢-2H-吡喃-3-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇
将(5R)-3-(顺式-4-{[1-甲基-4-({1-[四氢-2H-吡喃-3-基]-1H-吡唑-3-基}氨基)-1H-苯并咪唑-6-基]氧基}环己基)-5-(三氟甲基)-1,3-噁唑烷-2-酮(异构体2) (0.080 g,0.15 mmol)和三甲基硅醇钾(0.040 g, 2.0 eq)在THF (2 mL)中混合。在65℃下搅拌3天。添加三甲基硅醇钾(0.018 g, 1.0 eq)。在65℃下搅拌整夜。使其冷却至室温。用几滴水稀释并在真空下浓缩。通过C-18反相色谱法纯化，使用0%-100%乙腈/(10mM碳酸氢铵/甲醇)梯度，以得到标题化合物(0.058 g, 76%)。MS (ES) m/z = 523 (M+H)。
实施例 12
(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸酯水合物(1:1:1)
将1.23 g的(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇添加到10 mL的88%丙酮中，同时在1000 rpm/70℃下搅拌以得到白色浆料。逐滴添加510 mg的柠檬酸。白色浆料变成澄清的淡黄色溶液。停止加热和搅拌。在接下来的一小时内，慢慢形成黄色固体。通过真空过滤分离出浅黄色固体。在空气流下将样品在过滤器上干燥20分钟以得到标题化合物。(1.62g, 93.6%)。
实施例12的X射线粉末衍射:
在配备有CuKa源(λ = 1.54060 Å)和Vantec检测器的Bruker D4 Endeavor X射线粉末衍射仪上在35 kV和50 mA操作下获得结晶固体的XRD图。在4至40°2θ扫描样品，步长0.0087°2θ，扫描速率0.5秒/步，发散狭缝0.6mm，固定防散射狭缝5.28mm和检测器狭缝9.5mm。将干燥粉末填装在石英样品架上，并使用载玻片获得平滑的表面。在结晶学领域中众所周知的是，对于任何给定晶形，衍射峰的相对强度可能由于诸如晶体形态和习性等因素导致的择优取向而变化。当存在择优取向的效应时，峰强度改变，但多晶形物的特征峰位置不变。参见例如The U. S. Pharmacopeia 38 - National Formulary 35 ChapterCharacterization of crystalline and partially crystalline solids by X-raypowder diffraction (XRPD) Official May 1, 2015。此外，在结晶学领域中也众所周知的是，对于任何给定晶形，角峰位置可能稍微改变。例如，由于分析样品时的温度或湿度的变化、样品移位或内标的存在与否，峰位置可能移动。在本发明的情况下，±0.2 2θ的峰位置可变性将考虑这些潜在变化而不妨碍明确鉴定所指示的晶形。可以基于特征峰(以°2θ为单位)（通常为较显著的峰）的任何独特的组合确认晶形。在室温和相对湿度下收集的晶形衍射图基于在8.85和26.77°2-θ的NIST 675标准峰进行调整。
使用CuKa辐射获得的(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸酯水合物(1:1:1)的XRD图提供如下表2中所述的衍射峰(2-θ值)，特别地，具有在17.9处的峰以及一个或多个选自26.1、26.6和22.7处的峰；衍射角的容差为0.2度。
表2
结晶(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸酯水合物(1:1:1)的X射线粉末衍射峰
生物部分
JAK1、JAK2和JAK3体外酶测定
JAK LanthaScreen™激酶测定(Invitrogen)用于确定受试化合物抑制JAK1、JAK2和JAK3激酶活性的能力。其是使用长寿命铽标记抗体作为供体物类和GFP-STAT1作为受体物类的TR-FRET 测定形式。使用TR-FRET 比率监测JAK 激酶活性，其中GFP-STAT1磷酸化的增加导致TR-FRET 比率的增加。在浅黑色384孔Proxiplate®中使用12.5 μl反应体积进行激酶反应。添加试剂以获得以下最终反应条件：50 ml HEPES pH，1.76 mM Triton X-100，ATP(20.0 µM用于JAK1和JAK3或5 µM用于JAK2)酶测定，10.0 mM MgCl2，1 mM EGTA和0.01%Brij-35，0.05 mM GFP-STAT1，14 nM JAK1酶用于JAK1 、1.0 nM用于JAK2或2.5 nM用于JAK3酶测定，和4％DMSO和受试化合物的系列稀释液(从20,000 nM 1:3稀释至1 nM)。添加ATP/GFP-STAT1之后，以1000转/分钟(RPM)离心测定板1分钟。使板在室温孵育60分钟，然后添加12.5 µl终止缓冲液，所述终止缓冲液含有20 mM EDTA、2 nM铽-抗-磷酸化信号传导和转录激活因子[磷酸化酪氨酸701氨基酸]抗体(Tb-抗-pSTAT1[pTyr701])、0.67 mM三(羟甲基)氨基乙烷盐酸盐(Trizma®) pH 7.5，0.02％NaN3和0.01％壬基苯基聚乙二醇(Nonidet® P40)。在室温孵育90分钟，用340 nm波长激发滤光片及520 nm和495 nm波长的发射滤光片在EnVision®读板器中读数。由在520 nm测量的GFP-STAT1的发射波长/Tb-抗-pSTAT1[pTyr701]在495 nm的发射推导出比率。使用由反应数据相对于板上对照(活性酶 vs. 用托法替尼在2.0 mM下抑制的酶)计算的百分比抑制数据推导出每个化合物的IC50值。使用ACTIVITYBASE® 4.0将百分比抑制和十点化合物浓度数据拟合成四参数逻辑方程。
按照基本上如上所述的方案，测试本文中的实施例化合物。实施例化合物对JAK1表现出小于8 nM 的IC50，并且在体外相比于JAK2或JAK3为JAK1的选择性抑制剂。实施例1和6至10的化合物表现出表3中所列的活性。
表3
该数据证明，实施例化合物是JAK1酶的抑制剂，并且在体外相比于JAK2和JAK3对JAK1具有选择性。
AlphaScreen SureFire Protocol p-STAT3-(p-Tyr705)-IL6-TF-1-JAK1细胞基 测定
下面描述的基于JAK1细胞的测定用于确定受试化合物的JAK1细胞效力。
细胞制备：在37℃下使TF-1细胞在具有0.5% 26400 (FBS)和1X Pen/Strep的DMEM培养基中饥饿。在具有透明底部的BD 96孔黑色板中以每孔100K细胞铺板。将该板在室温下保持30-60分钟，随后在37℃和5% CO2下孵育整夜。使用Vi-Cell计数器计数细胞，使用100细胞/mL的细胞悬液，并在Beckman Dickinson Biocoat板(目录# 354640)中以100 μL/孔铺板。
受试化合物制备和处理：制备在DMSO中以1:3连续稀释的化合物，并进一步稀释到培养基中。受试化合物在20,000至1 nM的10点浓度范围内。将稀释的化合物添加到相应的细胞板中。在37℃下孵育该板20分钟。将终浓度为30 ng/mL的IL6溶液添加到相应的细胞板中，并继续在37℃下孵育30分钟。移除培养基并将50 μL 1x裂解缓冲液添加到各个孔中。
pSTAT3检测：依次进行以下步骤：制备受体混合物(活化缓冲液/反应缓冲液/受体珠)；将4 μL裂解液从96孔板转移至384孔Proxiplate；将5 μL受体混合物添加到384proxiplate板中并用铝封来密封该板；在板振荡器上摇动1-2分钟；在轻轻摇动下在室温下孵育该板2小时；制备供体混合物(在稀释缓冲液中的供体珠)；将2 μL供体混合物添加到测定板中；用铝封来密封该板；在板振荡器上摇动1-2分钟；在轻轻摇动下在室温下孵育2小时；用Envision读板；protocol AlphaScreen Surefire 384。
按照基本上如上所述的方案，对实施例1、2和6的化合物进行测试，表现出以下如下表4中所示的活性。
表4
表4中的数据证明，实施例1、2和6的化合物在基于细胞的测定中抑制JAK1酶，证实实施例的化合物也抑制细胞中的JAK1酶。
人全血测定：测定淋巴细胞和单核细胞中的pSTAT3 (JAK1)和pSTAT5 (JAK2)
开发并验证了人全血(HWB)测定以确定受试化合物的JAK1和JAK2选择性。
将化合物在DMSO 100%中10点稀释(1:3)并在PBS + 0.1% BSA中递减(stepdown)。在每个板中使用作为参考化合物的托法替尼以及最大信号(刺激孔)和最小信号(无刺激孔)以归一化数据。由4种不同的健康供体得到HWB合并物(pool)。使用Tecan Evo 96w将血液铺板在96孔板中并在室温下用受试化合物孵育1小时。在此孵育时间之后，用IL6(206-IL, R&D System)和GM-CSF (PHC2015, Life Technologies)再刺激HWB15分钟。使用Tecan Evo 96w(5xmix)添加细胞活力染料(65-0865, eBiosicience) (1:1000)。
在该测定中的终浓度如下：100 µM化合物，50 µM托法替尼，0.1µg/mL IL6，0.038µg/mL GM-CSF和1% DMSO。通过使用Tecan Evo 96w 添加900 μL的裂解缓冲液(10x高速混合)，使用裂解/固定缓冲液(558049, Becton Dickinson)裂解和固定HWB。在37℃下在浴中将HWB孵育10分钟。将HWB以500G离心8分钟并弃去上清液。使用Tecan Exo 96w添加冷MeOH以透化细胞。在30分钟内在冰上孵育血细胞。此后，使用染色缓冲液(554656, BectonDickinson)洗涤细胞2次，以3000rpm旋转2分钟，弃去上清液，并添加以下抗体：抗-人CD4PE，1:100 (12-0048, eBioscience)，抗-人CD33 eFluor® 450，1:50 (48-0337,eBioscience)，Phospho-STAT5 (Tyr694) (C71E5)兔mAb，1:100 (Alexa Fluor® 488Conjugate)(3939, Cell Signaling)和Phospho-STAT3 (Tyr705) (D3A7) XP™ 兔mAb 1:200 (Alexa Fluor® 647 Conjugate)(4324, Cell Signaling)。在室温下在黑暗中孵育抗体1小时，然后洗涤细胞2次并在Cytometer Macsquant (Miltenyi Biotec)读数。对CD4+(淋巴细胞)和CD4Low CD33Hi (单核细胞)上的数据进行门控，以分别测量表达pSTAT3和pSTAT5的细胞的荧光强度。使用FlowJo v 10分析数据，然后将荧光中值相对于最大信号和最小信号归一化以确定IC50。使用Graph Pad Prism 5™表示剂量反应曲线。
按照基本上如上所述的方案，对本文中的实施例化合物进行测试。实施例化合物相对于JAK 2对JAK1表现出更大的选择性。实施例6至10的化合物的活性列于表5中。
表5
表5中的数据证明，实施例的化合物在人全血测定中相对于JAK2对JAK1更有效。
大鼠PK/PD测定
雄性Wistar大鼠，265-285克(Charles River)用于口服灌胃给药。以1.82 mL/kg (0.5mL/275克)给药于动物(口服灌胃)。在含有0.25% Tween 80和0.05%消泡剂的1% HEC载体中配制化合物以及1.1摩尔当量的甲磺酸以形成原位盐。每周配制化合物一次，并在4℃下储存。在不同时间点，经由尾静脉出血在Multivette 600µl EDTA血液收集管(目录#151671100PK100, Sarstedt Inc)中获得大鼠全血，并用于离体JAK1和JAK2测定。将来自每只大鼠的等分100 ul血液置于96孔圆底板中。通过重组IL-6 (100ng/ml)和重组小鼠GM-CSF (目录# 415-ML，lot# R&D)在室温下刺激全血12分钟。在细胞因子刺激后，将全血添加到微型管架中的裂解/固定液(目录# 558049，lot# BD)中；充分混合5X。在室温下孵育10分钟。以600g旋转微型管架4分钟。用12通道歧管抽吸。将微型管架的内容物转移至96孔圆底板中。以3000 rpm降速旋转细胞1分钟并弃去上清液。将孔中的细胞与100 ul冰冷的MeOH混合，并在冰上孵育30分钟。将150 ul PBS +2% FCS添加到各个孔中，并以3000 rpm降速旋转2分钟。用250 ul PBS + 2% FCS洗涤细胞2次。对于细胞表面和细胞内染色，将所有抗体混合并添加到各个孔中，并在黑暗中在室温下孵育1小时。用于染色的抗体如下：pSTAT3，Alexa Fluor 647 (目录# 4324s，lot, Cell Signaling)；pSTAT5，Alexa Fluor 488 (目录# 3939s，lot# Cell Signaling)；抗-大鼠CD4，V450 (目录# 561579，lot#, BD)；抗-大鼠CD11b，Percp eFluor710 (目录# 12-0110-82，lot#, eBioscience)。在用Abs染色细胞之后，用PBS + 2% FCS洗涤该板2次，最后重新悬浮在相同的150 ul溶液中。通过ViabilityDye 780 (目录# 65-0865-14，lot#, eBioscience)评估细胞活力。使用FORTESSA进行血细胞计数测定。
按照基本上如上所述的方案，对实施例4和6至10的化合物进行测试，数据列于表6中。
表6
大鼠全血离体JAK1和JAK2活性(与作为100%抑制的载体处理相比，在30 mpk下的%抑制)
该数据证实了实施例化合物的活性，实施例化合物在大鼠体内相对于JAK2对JAK1更有效。
大鼠胶原诱发的关节炎(CIA)模型
该方案使用来自Charles River的Lewis大鼠(体重150-175克)。在第0天，用异氟烷麻醉大鼠。在第1天，在尾根部上方，在下腰区域上的两个部位处用胶原乳液进行皮内免疫。每个注射部位的剂量体积为最少0.4 mL。在第8天，用异氟烷麻醉大鼠，并在尾根部上方，在下腰区域上的两个部位处用胶原乳液进行皮内免疫。基于大鼠后爪的炎症(发红和/或肿胀)，在第12天将大鼠登记为治疗组。使用区组随机化分配工具，基于踝关节测量值和体重，随机化动物的治疗阶段。在第1、8和11天记录踝关节肿胀，然后在登记之后每周三次记录踝关节肿胀，直至并包括尸检日。从第12天(随机化之后)开始直至第25天，每天一次口服给药化合物。在基本上如上所述的方案中评估实施例6和7的化合物。结果列于下表7中。
表7
大鼠爪肿胀抑制(与作为100%抑制的幼年大鼠相比的%抑制)
表7中的数据证明实施例6和7的化合物表现出大鼠爪肿胀的剂量反应性抑制，并且证实实施例化合物可以有效治疗关节炎。
大鼠佐剂诱发的关节炎(AIA)模型
化合物对多发性关节炎炎症和踝关节骨侵蚀的作用可以在大鼠佐剂诱发的关节炎(AIA)模型中进行评估。使用平均体重为185g的雄性Lewis大鼠进行研究。通过使用100µL的佐剂悬浮的免疫乳化油在尾根部处的皮内注射来诱发关节炎。基于第10天的平均爪厚度和体重，将动物随机化为研究组，每组8只大鼠。在纯净水中以1% HEC / 0.25% P80 / 0.05%AF制备化合物，并且从免疫后第11天开始每天口服灌胃给药，持续14天。对于两个踝关节，使用卡尺测量来定量爪厚度。使用单因素ANOVA评估组间差异，然后使用Dunnett's事后检验针对载体对照进行多重比较。在基本上如上所述的方案中评估实施例10的化合物。结果列于下表8中。
表8
大鼠AIA模型中爪肿胀和骨密度(BMD)损失的抑制(与作为100%抑制的幼年大鼠相比的%抑制)
表8中的数据证明实施例10的化合物表现出大鼠爪肿胀的剂量反应性抑制，并且证实实施例化合物可以有效治疗关节炎。

Claims (23)

1.下式的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R选自：H、-C1-3烷基、-CH2CH(OH)CH3、或-C2-3烷基-O-CH3、和；
R1选自：H、-CH3、-OCH3；
R2为-CHF2或-CF3；
R3为H或-CH3；
条件是，当R2为-CF3且R3为H时，R或R1可以为-CH3，但不都是-CH3。
2.下式的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1选自：H、-C1-3烷基、-CH2CH(OH)CH3、或-C2-3烷基-O-CH3、和；
R1选自：H、-CH3、-OCH3；
R2为-CHF2或-CF3；和
R3为H或-CH3；
条件是，当R2为-CF3且R3为-CH3时，R或R1可以为-CH3，但不都是-CH3。
3.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R选自：-CH3、-CH2CH3和。
4.根据权利要求1至3任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R 为-CH3或-CH2CH3。
5.根据权利要求1至3任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R 为。
6.根据权利要求1至5任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1选自：H、-CH3和-OCH3。
7.根据权利要求1至6任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2为-CF3。
8.根据权利要求1至7任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3为-CH3。
9.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为
。
10.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为
。
11.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为
。
12.根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为
。
13.化合物，其为(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸酯水合物。
14.化合物，其为结晶形式的(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇，其特征在于获自CuKα源(λ=1.54056 Å)的X射线粉末衍射图包括在以下各处的峰：
a) 15.5、18.1、18.3、20.5和22.9 +/- 0.2°2θ，或
b) 13.2、15.5、18.1、18.3、18.5、20.5、22.9、23.6和23.7 +/- 0.2°2θ，或
c) 13.2、15.5、18.1、18.3、18.5、19.0、20.5、22.9、23.6、23.6、23.7、24.7和26.5 +/-0.2°2θ。
15.化合物，其为结晶形式的(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸酯水合物，其特征在于获自CuKα源(λ=1.54056 Å)的X射线粉末衍射图包括在以下各处的峰：
a) 18.6、19.1、21.0和22.4 +/- 0.2°2θ，或
b) 7.4、11.0、18.6、19.1、21.0、21.9、22.4和26.2 +/- 0.2°2θ，或
c) 7.4、11.0、12.7、16.8、18.6、19.1、21.0、21.9、22.4和26.2 +/- 0.2°2θ。
16.药物组合物，其包含根据权利要求1至15任一项所述的化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
17.药物组合物，其包含大于80% w/w的化合物，所述化合物为结晶形式的(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸酯水合物。
18.药物组合物，其包含大于90 % w/w的化合物，所述化合物为结晶形式的(2R)-1,1,1-三氟-3-({顺式-4-[(1-甲基-4-{[1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-3-基]氨基}-1H-苯并咪唑-6-基)氧基]环己基}氨基)丙-2-醇2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸酯水合物。
19.治疗需要关节炎治疗的患者的方法，其中所述方法包括向所述患者给药有效量的根据权利要求15至18任一项所述的药物组合物。
20.治疗需要关节炎治疗的患者的方法，其中所述方法包括向所述患者给药有效量的根据权利要求1至15任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
21.根据权利要求1至15任一项所述的化合物，其用于治疗。
22.根据权利要求1至15任一项所述的化合物，其用于治疗关节炎。
23.根据权利要求1至15任一项所述的化合物在制备治疗关节炎的药物中的用途。
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