CN109464700A - 用于3d打印的浆料、3d结构体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于3D打印的浆料、3D结构体及其制备方法和应用，涉及三维生物打印技术领域。用于3D打印的浆料包括海藻酸盐、聚赖氨酸和水，其中海藻酸盐的质量是水质量的20‑40％，海藻酸盐的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:0.1‑2。本发明3D结构体的制备方法使用用于3D打印的浆料进行3D打印得到。本发明浆料成型性好，可直接打印出在生理环境下能较为稳定存在的结构体，同时改善了海藻酸盐的生物惰性，通过控制海藻酸钠和聚赖氨酸的比例能够调控支架的整体电荷，利于搭载不同类型的有效生物成分，促进细胞的粘附和增殖。经打印后的结构体经过进一步化学交联稳定性更好，能长时间保持其完整性。

Description

用于3D打印的浆料、3D结构体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及三维生物打印技术领域，具体而言，涉及一种用于3D打印的浆料、3D结构体及其制备方法和应用。
背景技术
三维(3D，3Dimensions)生物打印技术是在三维打印技术基础上衍生出的，在打印生物材料的同时负载细胞或者生长因子的打印技术，在制备人造器官与组织和药物筛选模型上具有很大的潜力。生物墨水(用于三维生物打印的材料)则决定了三维生物打印制品的物理化学性能，同时影响细胞的存活率以及生长因子的活性等。海藻酸盐(钠)具有剪切稀化性能(受到剪切力作用墨水粘度降低)，以及其优异的生物相容性和能够实现快速离子交联，被广泛应用于构建细胞胶囊和生物墨水。但是使用钙离子交联后的海藻酸盐支架的稳定性较差，在生理环境下钙离子容易与周围的单价离子如钠离子发生置换，从而导致支架的坍塌。虽然海藻酸盐具有优异的生物相容性，能够实现包载细胞的存活，但是海藻酸盐不具备生物活性，细胞在海藻酸盐支架上粘附与铺展较差，无法实现生长因子等可控释放，也不具备诱导干细胞分化的能力。
目前为了改进海藻酸盐支架的生物惰性问题，有研究者在海藻酸钠中的羧基上接枝精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸序列(RGD)，从而促进细胞在海藻酸钠支架上的粘附[J.Yu,Y.Gu,K.T.Du,S.Mihardja,R.E.Sievers,R.J.Lee,Biomaterials 2009,30,751]。但是该海藻酸钠支架依然使用钙离子进行交联，稳定性仍然不足。针对海藻酸钠支架稳定性的问题，研究者在海藻酸钠羧基上接枝甲基丙烯酸基团，使用光交联替代钙离子交联方式，从而提高了海藻酸钠支架的稳定性，但是这样的支架缺乏生物活性。[O.Jeon,K.H.Bouhadir,J.M.Mansour,E.Alsberg,Biomaterials 2009,30,2724.]。
因此，所期望的是提供一种新的生物墨水，其能够解决上述问题中的至少一个。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于3D打印的浆料，能够缓解上述问题中的至少一个。
本发明的目的之二在于提供一种上述用于3D打印的浆料的制备方法，简单易得。
本发明的目的之三在于提供一种3D结构体，采用上述用于3D打印的浆料或上述用于3D打印的浆料的制备方法制得的浆料制得，该3D结构体易成型、更稳定，同时改善了海藻酸盐的生物惰性。
本发明的目的之四在于提供一种上述3D结构体的制备方法，操作简单，不需要复杂的化学合成过程，此外，优选经过进一步化学交联后的3D结构体稳定性很好，能长时间保持其完整性。
本发明的目的之五在于提供一种上述3D结构体或上述3D结构体的制备方法制得的3D结构体在组织工程中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，提供了一种用于3D打印的浆料，所述浆料包括海藻酸盐、聚赖氨酸和水，其中海藻酸盐的质量是水质量的为20-40％，海藻酸盐的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:0.1-2。
优选地，在本发明技术方案的基础上，海藻酸盐的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:0.5-1，优选为1:1。
优选地，在本发明技术方案的基础上，聚赖氨酸的重均分子量为750-5000，优选为1000-4200；
和/或，聚赖氨酸的熔点为170-175℃，优选为172-175℃。
优选地，在本发明技术方案的基础上，所述浆料还包括有效生物成分，有效生物成分包括营养物质、细胞外基质、生长因子、细胞或药物活性成分中的一种或几种。
第二方面，提供了一种用于3D打印的浆料的制备方法，包括以下步骤：
将海藻酸盐、聚赖氨酸和水混合均匀，得到用于3D打印的浆料；
优选地，将海藻酸盐加入聚赖氨酸和水的溶液中，混合均匀得到浆料；
优选地，聚赖氨酸和水的溶液中还包括有效生物成分。
第三方面，提供了一种3D结构体，采用上述用于3D打印的浆料或上述用于3D打印的浆料的制备方法制得的浆料制得。
优选地，所述3D结构体包括组织修复支架、活组织或类器官体，优选为组织修复支架。
第四方面，提供了一种上述3D结构体的制备方法，包括以下步骤：
使用所述用于3D打印的浆料进行3D打印，得到3D结构体；
优选地，3D打印的打印压力为50-600kPa，打印速度为5-10mm/s。
优选地，在本发明技术方案的基础上，所述方法还包括将得到的3D结构体置于缩合剂溶液或缩合剂和稳定剂的混合溶液中，得到化学交联3D结构体的步骤；
优选地，缩合剂和稳定剂的摩尔比为1-2:1；
优选地，缩合剂包括水溶性和油溶性缩合剂，优选为水溶性缩合剂，进一步优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
优选地，稳定剂包括酰亚胺或苯并三唑类稳定剂，优选为N-羟基丁二酰亚胺或1-羟基苯并三唑。
优选地，在本发明技术方案的基础上，所述方法还包括将得到的化学交联3D结构体置于聚赖氨酸溶液中，得到氨基修饰的3D结构体的步骤；
优选地，聚赖氨酸溶液的质量分数为2-10％，优选为4-6％；
优选地，所述方法还包括将得到的氨基修饰的3D结构体置于有效生物成分溶液中，得到负载有效生物成分的3D结构体。
第五方面，提供了一种上述3D结构体或上述3D结构体的制备方法制得的3D结构体在组织工程中的应用。
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的用于3D打印的浆料以海藻酸盐为基础，增加了聚赖氨酸，通过海藻酸盐与聚赖氨酸之间的物理静电作用，通过静电自组装形成物理交联的三维网状结构，形成水凝胶，浆料打印挤出后可直接成型，提高了海藻酸盐基生物墨水的打印性能，静电作用有利于获得更加稳定的浆料，有助于改善单纯海藻酸盐浆料的结块现象，使浆料形成后更加均匀；同时通过控制海藻酸盐的羧基和聚赖氨酸的氨基的比例，保证物理交联后的网络结构处于较为稳定的状态，使用该浆料无需固化就能直接获得成型结构体，在生理环境下结构不容易被破坏，稳定性较好，改善了传统钙离子交联海藻酸盐水凝胶生理环境下的不稳定性缺陷。
(2)本发明的用于3D打印的浆料通过控制海藻酸盐和聚赖氨酸的比例能够调控浆料的整体电荷，获得不同电荷和电位的结构体，有利于搭载不同类型的物质(例如营养物质、细胞外基质、生长因子等)，能够实现物质的可控释放，促进细胞的粘附和增殖，促进细胞活性和功能(增殖、分化、迁移、分泌或新陈代谢)，改善了海藻酸盐的生物惰性。
(3)作为优选方案，3D打印后的物理交联结构体通过羧基与氨基的进一步化学交联，能得到稳定性更高的3D结构体，能长时间保持其完整性。
(4)作为优选方案，化学交联3D结构体通过聚赖氨酸溶液进一步处理能获得表面氨基修饰的3D结构体，不仅能进一步将羧基反应完全，形成更致密的交联网络，进一步提高稳定性，而且实现了结构体的电荷可调。
(5)由于浆料的稳定性，使用本发明的浆料能够实现复杂模型的打印。
(6)本发明能够用于多种组织修复应用，进一步扩大了海藻酸盐在组织工程领域的应用价值。
附图说明
图1为本发明一种实施方式的浆料及使用其进行3D生物打印的过程示意图；
图2为本发明实施例1和实施例2打印出的骨头模型照片(左侧为实施例1打印出的骨头模型照片，右侧为实施例2打印出的骨头模型照片)；
图3为本发明实施例1和实施例2打印出的骨头模型与对比例1打印出的骨头模型在水中的稳定性试验结果图；
图4为本发明实施例9得到的化学交联支架表面形貌图；
图5为本发明实施例11得到的化学交联支架表面形貌图；
图6为本发明实施例11、实施例15和实施例17得到的支架的表面zeta电位图；
图7为本发明实施例3打印出的物理交联支架与对比例2得到的支架在生理环境下的稳定性试验结果图；
图8为本发明实施例11、实施例15、实施例17以及对比例2得到的支架对硫酸软骨素的吸附和释放图(左侧为吸附图，右侧为释放图)；
图9为本发明实施例11、实施例15、实施例17以及对比例2得到的支架对血管内皮生长因子的吸附和释放图(左侧为吸附图，右侧为释放图)；
图10为本发明实施例20搭载的人骨髓间充质干细胞的支架打印后和培养7天后的活死染色图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
根据本发明的第一个方面，提供了一种用于3D打印的浆料，包括海藻酸盐、聚赖氨酸和水，其中海藻酸盐的质量是水质量的为20-40％，海藻酸盐的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:0.1-2。
浆料也可称为墨水，是用于3D打印的材料。
用于三维生物打印的生物墨水需具备以下性能：a)剪切稀化性能，受到剪切力作用墨水粘度降低利于挤出；b)生物活性，实现高的细胞存活率和生物活性；c)快速成型性能，打印挤出后能够快速成型从而能够构建复杂形状支架；d)可控的降解性能，能够可控地维持打印得到的支架的稳定性。目前广泛使用海藻酸钠作为生物墨水，但是海藻酸钠使用钙离子交联后支架的稳定性较差，在生理环境下钙离子容易与周围的单价离子如钠离子发生置换，从而导致支架的坍塌。且海藻酸钠不具备生物活性，细胞在海藻酸钠支架上粘附与铺展较差，也不具备诱导干细胞分化的能力。
本发明针对海藻酸盐稳定性差和生物惰性等问题，提出了一种海藻酸盐和聚赖氨酸浆料。
海藻酸盐典型但非限制性的例如为海藻酸钠或海藻酸钾，优选是海藻酸钠。
聚赖氨酸(ε-多聚赖氨酸(ε-PL))是一种含有25-30个赖氨酸残基的同型单体聚合物，聚赖氨酸是天然的聚氨基酸，具有很好的生物相容性，而且具有一定的抗菌能力；聚赖氨酸是小分子多肽，海藻酸盐和聚赖氨酸浆料的主体材料还是海藻酸盐，因此聚赖氨酸不同于其他聚电解质，不会影响海藻酸盐剪切稀化的属性，从而不影响该墨水的打印性能。
海藻酸盐和聚赖氨酸之间存在静电作用，通过静电自组装可形成三维网状结构，实现物理性交联。
为了保证墨水的可打印性，控制海藻酸盐的质量是水质量的为20-40％，包括但不限于20％、22％、24％、25％、26％、28％、30％、32％、35％、38％或40％。
海藻酸盐的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:0.1-2，示例性的例如为1:0.1、1:0.2、1:0.5、1:0.6、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.8或1:2。
随着聚赖氨酸比例的提高，电荷相互作用逐渐增强，水凝胶结构在溶剂(例如水、缓冲液或培养基)中更加稳定，但聚赖氨酸比例过大，海藻酸盐作为主体结构相对量少，会影响其结构的稳定性。
需要注意的是，本发明的用于3D打印的浆料除了包括海藻酸盐和聚赖氨酸外，还可以包括有效生物成分，例如生长因子和/或细胞外基质成分等。
本发明的用于3D打印的浆料以海藻酸盐为基础，增加了聚赖氨酸，通过海藻酸盐与聚赖氨酸之间的物理静电作用，形成物理交联的三维网状凝胶结构，静电作用使浆料保持较为稳定的状态，有助于改善单纯海藻酸盐浆料的结块现象，使浆料形成后更加均匀，提高了海藻酸盐基生物墨水的打印性能；同时通过控制海藻酸盐的羧基和聚赖氨酸的氨基的比例，保证物理交联后的网络结构处于较为稳定的状态，使用该浆料打印后的结构体成型性好，无需固化就能直接获得成型结构体，在生理环境下结构不容易被破坏，具有很好的稳定性，改善了传统钙离子交联海藻酸盐水凝胶生理环境下的不稳定性缺陷。
由于浆料易于成型以及其稳定性，使用本发明的浆料能够实现复杂模型的打印。
本发明的用于3D打印的浆料通过控制海藻酸盐和聚赖氨酸的比例能够调控浆料的整体电荷，获得不同电荷和电位的结构体，有利于搭载不同类型的物质(例如营养物质、细胞外基质、生长因子等)，能够实现物质的可控释放，促进细胞的粘附和增殖，促进细胞活性和功能(增殖、分化、迁移、分泌或新陈代谢)，改善了海藻酸盐的生物惰性。本发明能够用于多种组织修复应用，进一步扩大了海藻酸盐在组织工程领域的应用价值。
在一种实施方式中，海藻酸盐的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:0.5-1，优选为1:1。
该比例的海藻酸盐和聚赖氨酸形成的结构更加稳定，尤其当1:1时，结构中电荷平衡，静电网络结构最为稳定。
在一种实施方式中，聚赖氨酸的重均分子量为750-5000，优选为1000-4200；和/或，聚赖氨酸的熔点为170-175℃，优选为172-175℃。
聚赖氨酸的重均分子量包括但不限于880、1030、1175、1800、2000、3000、4200或4700。
聚赖氨酸的熔点包括但不限于170℃、171℃、172℃、173℃、174℃或175℃。
该参数范围内的聚赖氨酸与海藻酸盐形成的结构更加稳定。
在一种实施方式中，浆料还包括有效生物成分，有效生物成分包括营养物质、细胞外基质、生长因子、细胞或药物活性成分中的一种或几种。
营养物质包括但不限于核苷酸、多肽、氨基酸、脂质、碳水化合物(例如单糖、寡糖或多糖)或维生素等；
细胞外基质包括但不限于蛋白聚糖、糖胺聚糖、结构蛋白(例如胶原和弹性蛋白)或粘着蛋白(例如纤粘连蛋白和层粘连蛋白)等；
生长因子包括但不限于胰岛素、类胰岛素生长因子(如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、转化生长因子(如TGFα和TGFβ)、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源生长因子、骨肉瘤来源生长因子、生长激素释放抑制因子、神经生长因子、白细胞介素(如IL-1、IL-2、IL-3)、红细胞生长素、集落刺激因子、皮质醇或甲状腺素等；
细胞包括但不限于细菌、酵母、植物细胞或动物细胞；
药物活性成分包括但不限于rhIL-11、rhIL-2、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rhTNF-α、sTNF-R1或rHuEPO等。
将营养物质、细胞外基质、生长因子、细胞或药物活性成分等有效生物成分加入浆料中，可实现上述物质的负载。
需要注意的是，有效生物成分的负载方式包括以下方式中的一种或两种：(a)在浆料中直接加入有效生物成分进行负载；(b)打印出成品后置于有效生物成分溶液中进行负载。
根据本发明的第二个方面，提供了一种用于3D打印的浆料的制备方法，包括以下步骤：
将海藻酸盐、聚赖氨酸和水混合均匀，得到用于3D打印的浆料。
该浆料的制备方法简单易得。
优选地，用于3D打印的浆料的制备方法，包括以下步骤：将海藻酸盐加入聚赖氨酸和水的溶液中，混合均匀得到浆料。
具体地，方法包括以下步骤：将配方量的聚赖氨酸溶解于水中，混合均匀；将海藻酸盐加入聚赖氨酸水溶液中，混合均匀得到3D打印的浆料。
优选地，聚赖氨酸和水的溶液中还包括有效生物成分。
有效生物成分包括营养物质、细胞外基质、生长因子、细胞或药物活性成分中的一种或几种。
在制备浆料时，生长因子可混合于聚赖氨酸水溶液中；细胞的负载可将聚赖氨酸溶解于含有细胞的培养基溶液中，(这时水的量以培养基溶液中水的量为准)随后加入海藻酸盐混合均匀，得到3D打印的浆料。
根据本发明的第三个方面，提供了一种3D结构体，采用上述用于3D打印的浆料或上述用于3D打印的浆料的制备方法制得的浆料制得。
使用本发明的3D打印浆料可直接形成成型结构体，该结构体在生理环境下结构不容易被破坏，稳定性较好，改善了传统钙离子交联海藻酸盐水凝胶生理环境下的不稳定性缺陷，同时该获得的结构体的整体电荷可控，有利于搭载不同类型的物质，生物活性好。
需要注意的是，浆料可直接通过3D打印获得物理交联的3D结构体，也可以进一步进行光固化等固化方式获得化学交联的3D结构体。
对3D结构体的类型和形状不作限定，3D结构体包括但不限于组织修复支架，还可以是活组织或类器官体等。
根据本发明的第四个方面，提供了一种上述3D结构体的制备方法，包括以下步骤：
使用上述用于3D打印的浆料进行3D打印，得到3D结构体。
3D打印典型但非限制性的是3D生物打印。
该3D结构体的制备方法操作简单，不需要复杂的化学合成过程，可直接打印获得3D结构体。
打印的压力取决于海藻酸钠/聚赖氨酸的比例以及它们在浆料中的质量分数，压力最小可调节至50kPa，适用于含细胞的三维生物打印，上限则取决于打印机的本身参数。
优选地，3D生物打印的打印压力为50-600kPa，打印速度为5-10mm/s。
在一种实施方式中，3D结构体的制备方法还包括将得到的3D结构体置于缩合剂和稳定剂的混合溶液中，得到化学交联3D结构体的步骤。
缩合剂包括水溶性或油溶性缩合剂，优选为水溶性缩合剂，包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
稳定剂指的是能够形成稳定的活化中间体的试剂，包括但不限于酰亚胺或苯并三唑类稳定剂，示例性的例如为N-羟基丁二酰亚胺(NHS)或1-羟基苯并三唑(HOBt)。
优选地，缩合剂和稳定剂的摩尔比为1-2:1，例如1.5:1或2:1。
化学交联方法为氨基和羧基缩合反应，示例性的方式是将羧基活化，再加入含氨基化合物，使氨基与羧基缩合。
通过静电物理交联的3D结构体通过氨基与羧基的化学交联进一步固化，得到稳定性更高的3D结构体，稳定性进一步可控，该3D结构体在水或生理环境中都能保持很高的稳定性。
在一种实施方式中，3D结构体的制备方法还包括将得到的化学交联3D结构体置于聚赖氨酸溶液中，得到氨基修饰的3D结构体的步骤。
化学交联3D结构体中存在未化学交联的多余活化羧基，将结构体置于聚赖氨酸溶液中(浸泡)，能进一步将羧基反应完全，形成更致密的交联网络，从而进一步提高稳定性。
优选地，聚赖氨酸溶液的质量分数为2-10％，优选为4-6％。
聚赖氨酸溶液的质量分数典型但非限制性的例如为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
随着聚赖氨酸溶液质量分数的提升，结构体的稳定性上升，但当大于10％后，聚赖氨酸已经过量，对稳定性没有显著性的提升。
同时，将结构体置于浸泡于一定质量分数的聚赖氨酸溶液中，在聚赖氨酸过量的情况下，可以在结构体表面引入大量的氨基，得到氨基修饰的3D结构体，从而实现结构体的电荷可调。
在一种实施方式中，3D结构体的制备方法还包括将得到的氨基修饰的3D结构体置于有效生物成分溶液中，得到负载有效生物成分的3D结构体。有效生物成分包括营养物质、细胞外基质、生长因子、细胞或药物活性成分中的一种或几种。
通过上述聚赖氨酸溶液调节结构体的电荷情况，从而实现不同有效生物成分的负载，能对细胞的增殖、分化、迁移、新陈代谢进行调控。
一种示例性的3D支架的制备方法，包括以下步骤：
a)制备海藻酸钠/聚赖氨酸浆料：将聚赖氨酸溶解于水中，混合均匀；将海藻酸钠加入聚赖氨酸水溶液中，海藻酸钠在水中的质量百分含量为20-40％，海藻酸钠的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:0.1-2，混合均匀得到海藻酸钠/聚赖氨酸浆料，浆料中可加入有效生物成分；
b)支架打印：将该海藻酸钠/聚赖氨酸浆料装进打印料筒中，在常温下使用三维生物打印机进行三维打印(如图1)。
一种示例性的3D支架的制备方法，包括以下步骤：
a)制备海藻酸钠/聚赖氨酸浆料：将聚赖氨酸溶解于水中，混合均匀；将海藻酸钠加入聚赖氨酸水溶液中，海藻酸钠在水中的质量百分含量为20-40％，海藻酸钠的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:0.1-2，混合均匀得到海藻酸钠/聚赖氨酸浆料，浆料中可加入有效生物成分；
b)支架打印：将该海藻酸钠/聚赖氨酸浆料装进打印料筒中，在常温下使用三维生物打印机进行三维打印(如图1)；
c)将打印出的支架浸泡于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的水溶液中30-40min，得到的化学交联支架。
一种示例性的3D支架的制备方法，包括以下步骤：
a)制备海藻酸钠/聚赖氨酸浆料：将聚赖氨酸溶解于水中，混合均匀；将海藻酸钠加入聚赖氨酸水溶液中，海藻酸钠在水中的质量百分含量为20-40％，海藻酸钠的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:0.1-2，混合均匀得到海藻酸钠/聚赖氨酸浆料，浆料中可加入有效生物成分；
b)支架打印：将该海藻酸钠/聚赖氨酸浆料装进打印料筒中，在常温下使用三维生物打印机进行三维打印(如图1)；
c)将打印出的支架浸泡于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的水溶液中30-40min，得到的化学交联支架；
d)除去交联试剂后，将支架浸泡于质量分数为2-10％的聚赖氨酸水溶液中30-40min，得到氨基修饰的支架。
一种示例性的3D支架的制备方法，包括以下步骤：
a)制备海藻酸钠/聚赖氨酸浆料：将聚赖氨酸溶解于水中，混合均匀；将海藻酸钠加入聚赖氨酸水溶液中，海藻酸钠在水中的质量百分含量为20-40％，海藻酸钠的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:0.1-2，混合均匀得到海藻酸钠/聚赖氨酸浆料，浆料中可加入有效生物成分；
b)支架打印：将该海藻酸钠/聚赖氨酸浆料装进打印料筒中，在常温下使用三维生物打印机进行三维打印(如图1)；
c)后处理：搭载有效生物成分的支架可直接放入培养基中培养；
d)将打印出的支架浸泡于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的水溶液中30-40min，得到的化学交联支架；
e)除去交联试剂后，将支架浸泡于质量分数为2-10％的聚赖氨酸水溶液中30-40min，得到氨基修饰的支架；
f)有效生物成分的吸附：将支架用水清洗数次后，浸泡于含有不同有效生物成分的水溶液中，通过上一步方法调节支架的电荷情况，从而实现不同有效生物成分的负载。
根据本发明的第五个方面，提供了一种上述3D结构体或上述3D结构体的制备方法制得的3D结构体在组织工程中的应用。
典型但非限制性的应用例如为骨-软骨一体化修复支架、血管化组织修复支架，3D结构体可以用于细胞行为研究模型或药物筛选模型。
由于3D结构体具有稳定性较好，生物活性好的优点，可以实现不同类型的物质(营养物质、细胞外基质、生长因子、细胞或药物活性成分)的搭载，能够用于多种组织修复应用，进一步扩大了海藻酸钠在组织工程领域的应用价值。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。本发明涉及的各原料均可通过商购获取。
聚赖氨酸购自麦克林的P832586，Mw<5000。
实施例1海藻酸钠/聚赖氨酸生物墨水的制备及其三维生物打印骨头模型
一种海藻酸钠/聚赖氨酸生物墨水及其三维生物打印骨头模型的制备方法，包括以下步骤：
(1)将2.924g聚赖氨酸溶解于10mL双蒸水中搅拌均匀，称取4g海藻酸钠并加入到聚赖氨酸溶液中搅拌至均匀，得到海藻酸钠的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:1的海藻酸钠/聚赖氨酸生物墨水；
(2)将该生物墨水装进打印料筒中，使用三维生物打印机进行打印骨头模型，打印的压力为600kPa，打印速度为10mm/s。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，海藻酸钠的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为2:1。
图2为实施例1和实施例2浆料打印出的骨头模型照片，图2可以看出，海藻酸钠/聚赖氨酸生物墨水具有自支撑的能力，可以实现复杂模型的打印，成型性较好。
对比例1海藻酸钠生物墨水的制备及其三维生物打印骨头模型
一种海藻酸钠生物墨水及其三维生物打印骨头模型的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取4g海藻酸钠并加入到10mL双蒸水中搅拌至均匀，得到海藻酸钠生物墨水；
(2)将该生物墨水装进打印料筒中，使用三维生物打印机进行打印骨头模型，打印的压力为600kPa，打印速度为10mm/s。
将实施例1、实施例2和对比例1打印出的骨头模型浸泡水中，进行稳定性试验，结果如图3所示。
实施例1、实施例2海藻酸钠/聚赖氨酸生物墨水打印出的骨头模型浸泡水中30min后然能保持其完整性，具有较好的稳定性，而直接用海藻酸钠生物墨水打印出的骨头模型浸泡水中30min后结构几乎被破坏，可见，海藻酸钠/聚赖氨酸生物墨水打印出的结构体在水中的稳定性优于海藻酸钠直接打印出的结构体。
实施例3海藻酸钠/聚赖氨酸生物墨水的制备及其三维生物打印支架
一种海藻酸钠/聚赖氨酸生物墨水及其三维生物打印支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将2.924g聚赖氨酸溶解于10mL双蒸水中搅拌均匀，称取4g海藻酸钠并加入到聚赖氨酸溶液中搅拌至均匀，得到海藻酸钠的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:1的海藻酸钠/聚赖氨酸生物墨水；
(2)将该生物墨水装进打印料筒中，使用三维生物打印机进行打印支架模型，打印的压力为600kPa，打印速度为10mm/s。
实施例4-7
实施例4-7与实施例3的不同之处在于改变聚赖氨酸加入量，使海藻酸钠的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比不同，具体如表1所示。
表1
海藻酸钠的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比
实施例4 4:1
实施例5 2:1
实施例6 1:1.5
实施例7 1:2
实施例8
本实施例与实施例3的区别在于，使用的聚赖氨酸的分子量Mw大于6000。
实施例9-14化学交联支架的制备
各自独立地将实施例3-8三维生物打印得到的支架进行如下步骤：
将支架浸泡于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)比例为2:1的水溶液中，时间为30分钟。使用双蒸水冲洗支架数次，随后冷冻干燥，得到实施例9-14化学交联支架。
实施例9化学交联支架的表面形貌图如图4所示，实施例11化学交联支架的表面形貌图如图5所示。
从扫描电子显微镜图可以看出海藻酸钠的羧基与聚赖氨酸的氨基为1:1的支架表面光滑，海藻酸钠的羧基与聚赖氨酸的氨基为2:1的支架表面具有微纳米级别的纤维状结构，更加接近天然的细胞外基质结构。这时由于1:1配比使海藻酸钠的羧基和聚赖氨酸的氨基理论能完全交联，而2:1海藻酸钠有部分不能与聚赖氨酸的氨基交联，多余的海藻酸钠溶于水中，形成纤维状的形貌。
对比例2
一种海藻酸钠水凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取4g海藻酸钠并加入到10mL双蒸水中搅拌至均匀，得到海藻酸钠生物墨水；
(2)将该生物墨水装进打印料筒中，使用三维生物打印机进行打印支架模型，打印的压力为600kPa，打印速度为10mm/s；
(3)将打印出来的坯体浸泡于1M CaCl2溶液中30min，得到海藻酸钠水凝胶支架。
对比例3
本对比例和实施例9的区别在于，海藻酸钠的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:5。
实施例15-17氨基修饰支架的制备
各自独立地将实施例9-11得到的化学交联支架进行如下步骤：
将化学交联支架浸泡于5％质量分数的聚赖氨酸水溶液中，时间为30分钟。使用双蒸水冲洗支架数次，随后冷冻干燥，得到实施例15-17氨基修饰支架。聚赖氨酸溶液中的过程没有破坏支架的表面纤维状形貌。
实施例11、实施例15和实施例17得到的支架的表面zeta电位图如图6所示，从图中可以看出，海藻酸钠的羧基与聚赖氨酸的氨基的比例以及浸泡的聚赖氨酸溶液的浓度均对支架表面电荷产生影响，支架的表面zeta电位可以通过调节羧基与氨基的比例以及浸泡的聚赖氨酸溶液的质量分数进行调控。
实施例18
本实施例与实施例15的区别在于，聚赖氨酸水溶液质量分数为2％。
实施例19
本实施例与实施例15的区别在于，聚赖氨酸水溶液质量分数为15％。
试验例1生理环境下稳定性测试
将实施例3打印出的物理交联支架和对比例2得到的支架放入PBS溶液中浸泡1、7天，结果见图7。
从图中可以看出，实施例3打印出的物理交联支架能够保持结构稳定，对比例2得到的支架1天时支架表面形貌几乎被破坏，而7天左右就都变成絮状物。
试验例2
将实施例9-19以及对比例2-3得到的支架进行稳定性测试，测试方法如下：将支架浸泡于PBS溶液中，计算1天、7天、14天、21天、28天和56天后支架的质量损失百分比，质量损失％＝(浸泡前支架的质量-浸泡一定时间后支架的质量)/浸泡前支架的质量×100％。
结果如表2所示。
表2
从表2的结果可以看出，化学交联后的支架在水中的稳定性明显高于海藻酸钠水凝胶支架。海藻酸钠的羧基与聚赖氨酸的氨基的比例对支架的稳定性具有重要影响，开始随着聚赖氨酸在海藻酸钠墨水中的用量提高，支架的稳定性会提高，羧基与氨基的比例为1:1时，支架会更加稳定，但聚赖氨酸用量过多，会对支架稳定性产生负面影响。
后续浸泡于聚赖氨酸溶液中聚赖氨酸的质量分数也会对支架的稳定性产生影响，随着聚赖氨酸溶液质量分数的提升，支架稳定性上升，但当大于10％后，支架稳定性差别不大。这是因为使用EDC/NHS交联活化支架中海藻酸钠的羧基后，仍有多余的羧基没有反应，继续将支架浸泡于聚赖氨酸溶液中能将羧基反应完全，形成更致密的交联网络，从而提高稳定性。所以随着浸泡的聚赖氨酸溶液质量分数的提升，支架的稳定性上升，但由于支架中未反应的羧基量是一定的，因此会达到一个平台期。
此外，使用的聚赖氨酸的分子量也会对支架的稳定性产生影响。
试验例3负载生长因子或细胞外基质的活性支架
各自独立地将实施例11得到的化学交联支架的支架、实施例15和实施例17得到的氨基修饰支架、以及对比例2得到的支架进行如下步骤：
将支架浸泡于100ng/mL的血管内皮细胞生长因子(VEGF)溶液或0.5mg/mL，1.0mg/mL，5.0mg/mL硫酸软骨素(CS)溶液中，时间为12小时。测定不同支架对对硫酸软骨素和血管内皮生长因子的吸附和释放，其中浸泡于1.0mg/mL硫酸软骨素溶液中的支架用于测试硫酸软骨素的释放行为。活性支架放置于24孔板中，每孔加入1mL PBS溶液并放置于37℃摇床中，摇速为60转/分。在固定间隔时间后取出100μL溶液用于检测，并加入100μL PBS溶液于原孔中。结果如图8、图9所示。
从图8、图9可以看出，硫酸软骨素是带负电的，血管内皮细胞生长因子带正电，在不同的支架上的吸附量不同，本发明支架能够有效地固定CS以及持续地释放VEGF，以这两者为范例证明了电荷可调控的支架能够有效地搭载细胞外基质和生长因子，提高了海藻酸钠支架的生物活性。
实施例20
制备搭载人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的三维生物打印支架。制备工艺如下:
(1)从培养瓶将hBMSCs消化并重悬浮于5mL培养基中，细胞的浓度为500,000/mL；
(2)将0.731g聚赖氨酸溶解于上述5mL培养基中，继续称取1g海藻酸钠并加入其中搅拌至均匀，得到海藻酸钠的羧基和聚赖氨酸的氨基的比例为1:1且搭载细胞的海藻酸钠/聚赖氨酸生物墨水；
(3)将该生物墨水装进打印料筒中，使用三维生物打印机进行打印。打印压力为100kPa，打印速度为1mm/s。
从活死染色的结果如图10所示，可以看出死细胞较少，说明该生物墨水满足生物相容性的需求。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种用于3D打印的浆料，其特征在于，所述浆料包括海藻酸盐、聚赖氨酸和水，其中海藻酸盐的质量是水质量的20-40％，海藻酸盐的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:0.1-2。
2.按照权利要求1所述的用于3D打印的浆料，其特征在于，海藻酸盐的羧基和聚赖氨酸的氨基的摩尔比为1:0.5-1，优选为1:1。
3.按照权利要求1所述的用于3D打印的浆料，其特征在于，聚赖氨酸的重均分子量为750-5000，优选为1000-4200；
和/或，聚赖氨酸的熔点为170-175℃，优选为172-175℃。
4.按照权利要求1-3任一项所述的用于3D打印的浆料，其特征在于，所述浆料还包括有效生物成分，有效生物成分包括营养物质、细胞外基质、生长因子、细胞或药物活性成分中的一种或几种。
5.一种权利要求1-4任一项所述的用于3D打印的浆料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将海藻酸盐、聚赖氨酸和水混合均匀，得到用于3D打印的浆料；
优选地，将海藻酸盐加入聚赖氨酸和水的溶液中，混合均匀得到浆料；
优选地，聚赖氨酸和水的溶液中还包括有效生物成分。
6.一种3D结构体，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的用于3D打印的浆料或权利要求5所述的用于3D打印的浆料的制备方法制得的浆料制得；
优选地，所述3D结构体包括组织修复支架、活组织或类器官体，优选为组织修复支架。
7.一种权利要求6所述的3D结构体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用所述用于3D打印的浆料进行3D打印，得到3D结构体；
优选地，3D打印的打印压力为50-600kPa，打印速度为5-10mm/s。
8.按照权利要求7所述的3D结构体的制备方法，其特征在于，所述方法还包括将得到的3D结构体置于缩合剂溶液或缩合剂和稳定剂的混合溶液中，得到化学交联3D结构体的步骤；
优选地，缩合剂和稳定剂的摩尔比为1-2:1；
优选地，缩合剂包括水溶性或油溶性缩合剂，优选为水溶性缩合剂，进一步优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
优选地，稳定剂包括酰亚胺或苯并三唑类稳定剂，优选为N-羟基丁二酰亚胺或1-羟基苯并三唑。
9.按照权利要求8所述的3D结构体的制备方法，其特征在于，所述方法还包括将得到的化学交联3D结构体置于聚赖氨酸溶液中，得到氨基修饰的3D结构体的步骤；
优选地，聚赖氨酸溶液的质量分数为2-10％，优选为4-6％；
优选地，所述方法还包括将得到的氨基修饰的3D结构体置于有效生物成分溶液中，得到负载有效生物成分的3D结构体。
10.一种权利要求6所述的3D结构体或权利要求7-9任一项所述的3D结构体的制备方法制得的3D结构体在组织工程中的应用。
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