CN109456879A - 用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片及其免对准微加工方法 - Google Patents

Abstract

用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片及其免对准微加工方法，属于微流控芯片技术领域。包括基底层、一体化流道‑电极功能层、顶层。一体化流道‑电极功能层包括主体电极、由主电极延伸入主流道且垂直横跨主流道的叉指电极、主流道入口、主流道出口、主流道由叉指电极非均匀侧壁结构划分而成的并行分流道以及绝缘沟道。本发明通过多层电极构成具有非均匀侧壁的叉指电极来产生水平与竖直方向上的高效的介电泳力以提高分离纯度，同时可以实现细胞聚焦，并通过非均匀侧壁形成的并行流道提高通量；使用均一的导电聚合物一次性填充具有多层结构的SU‑8模具，通过倒模使得一体化流道‑电极结构一次成型。

Description

用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片及其免对准微加工 方法

技术领域

本发明属于微流控芯片技术中的细胞分选与控制技术领域，具体涉及一种用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片及其免对准加工方式。

背景技术

细胞分选技术是指把一种细胞从多细胞样品中分离出来的技术。细胞分选是诊断检测、病理研究等学科经常用到的生物学实验方法，对于许多疾病的早期诊断和预后有着十分重要的意义。在细胞分选的方法中，传统的离心技术需要庞大的样本量且分离纯度低；而可以实现精准分离的流式细胞术价格昂贵且需要专业人员进行操作，更重要的是其需要对细胞进行额外的荧光染色或标记，会影响细胞的生理状态。

微流控芯片技术是指通过微机电系统(MEMS)、分析化学、计算机、电子学、材料科学及生物学、医学的交叉作用实现从试样处理到结果分析的整体微型化和集成化的技术。通常其外观为一块几平方厘米的芯片，芯片内部结构中包含微米甚至纳米尺度的结构，可以自动完成实验及分析的过程，因此微流控芯片也被成为“芯片实验室”(lab on a chip)。近年来，微流控芯片技术因其集成性、高通量、低耗能低成本、高效便携的特点在临床诊断、司法检测、药物筛选、生物工程研究等领域有越来越广阔的应用前景。结合微流控芯片的细胞分选技术相比于传统细胞分选技术，具有高通量、所需样本量少、分离纯度高以及简单易操作的优点。

目前基于微流控芯片的细胞分选方式主要分为生物化学方法和物理方法两大类。生物化学方法是较为传统的细胞分选方式，它通过流经微通道的细胞表面的特异性抗原与流道内壁固定的抗体相结合而将细胞固定在芯片内部，以达到细胞分选的目的；但由于捕获的细胞表面多带有通道内的抗体甚至其他荧光标记、微珠等，这不仅改变了细胞的生理状态，而且使得捕获的细胞难以释放，不利于后续细胞的培养和其性质状态的进一步观察研究。相比之下，通过外加的水力场、声场、电场等环境，根据细胞自身物理形态或利用黏附分子等对细胞表面施加瞬间作用力，使不同细胞在微流控通道所受外力不同，从而实现细胞分选的物理方法应用更为广泛。其中，利用不同种类细胞在介电特性方面的差异来控制其在非均匀电场中产生不同的细胞轨迹以实现细胞分离的介电泳细胞分选技术最受广大研究人员的青睐。

介电泳指的是可极化中性颗粒在非均匀电场中受力运动的现象。介电泳细胞分选技术则是利用微电极制造非均匀电场区域使不同种类的细胞感应出不同的偶极矩，从而实现细胞轨迹操控的技术。相比其他细胞分选的方法，介电泳细胞分选在保持细胞高活性的同时还具有高效率、免标记、简单易操作、成本低等优势。但目前已报道的介电泳细胞分选微芯片大都采用平面结构微电极或者具有均匀侧壁的三维微电极结构，如中国专利201510585845.6，中国专利201510379158.9，这类电极不能沿通道深度产生有效的电场梯度，无法在竖直方向上控制细胞轨迹。香港科技大学的Yobas课题组在2013-2015年的一系列报道中证明了三维硅电极结构可以产生沿通道深度的电场梯度，在竖直方向上将细胞分层以提高分离纯度，但其使用的硅基电极加工工艺复杂且成本昂贵；而使用较低成本的导电聚合物加工三维微电极的方法均采用上述均匀侧壁的电极结构，无法在竖直方向上控制细胞轨迹，此外，其电极和流道需使用不同的材料分别加工而成，故每次加工过程都要进行额外的牺牲层光刻来定义流道，电极填充完成后需去除牺牲层再次填充流道材料以形成流道，加工过程耗时且增加了复杂度。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足，本发明的目的为提供一种用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片及一种免对准的微加工方式，将采用导电聚合物构成的一体化流道-电极功能层。其中微电极结构采用具有非均匀侧壁的三维结构产生高效的介电泳力以提高分离纯度，同时该结构可以对细胞进行高效聚焦，通过非均匀侧壁形成的并行流道提高通量。芯片加工采用相比于硅基器件工艺简洁低成本的软光刻倒膜工艺，且通过均一的导电聚合物材料填充具有多层结构的SU-8模具并倒模使得一体化流道-电极结构一次性成型，进一步简化了工艺并降低了成本。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片，所述微流控芯片包括自上而下依次组合在一起的顶层(1)、一体化流道-电极功能层(2)、基底层(3)；

所述的顶层(1)沿长度方向上设有两个进行插管注入的孔，分别作为流道出入口(4)；

所述一体化流道-电极功能层(2)包含一对长方体主电极(7)、叉指电极(5)；长方体主电极(7)上表面长度方向为x方向，在主电极(7)的上表面与x方向垂直的记为y方向，与x、y方向垂直的主电极高度方向记为z方向；两长方体主电极(7)上表面共平面且侧壁平行相对，两长方体主电极(7)之间具有空隙作为主流道；两长方体主电极(7)相对的侧边上分别具有多个均匀分布的整体为长条状的且在z方向上与主电极高度相等的叉指电极(5)，每个主电极(7)上的长条状叉指电极(5)垂直主电极(7)伸入到主流道并指向对面的主电极(7)，且与对面的主电极(7)之间具有空隙称为电极间窄绝缘沟道(9)；两主电极(7)上的叉指电极(5)在主流道中交替间隔均匀分布；

在两主电极(7)长度方向的两端均设有流道边界墙体(8)，流道边界墙体(8)与两主电极(7)共平面且等高，且在流道边界墙体(8)上各设有一个凹槽通孔与主流道连通，其中一个凹槽通孔为入口处(24)，另一个为出口处(25)；入口处(24)和出口处(25)分别与贯穿顶层(1)的流道出入口(4)上下相对且连通；流道边界墙体(8)与两主电极(7)之间具有空隙记为板极间窄绝缘沟道(6)，每个芯片有四个相同的板极间窄绝缘沟道(6)；

所述整体为长条状的叉指电极(5)分上、下两层结构；上面为长度方向沿y方向的长条状的薄层板(13)，下面为与薄层板(13)的下表面相连的多个沿y方向均匀排列成一排的柱状结构(14)；柱状结构(14)的轴沿z方向且与薄层板(13)垂直；薄层板(13)的两侧壁是对称的呈周期变化的波形结构，使得薄层板(13)沿长度方向的面积呈周期性变大和缩小；柱状结构(14)位于每一个重复周期面积相对较大的薄层板(13)下面，且与柱状结构(14)相对应的薄层板(13)的面积覆盖且大于柱状结构(14)的上端面面积；主流道之间多个叉指电极(5)的所有柱状结构(14)形成矩形阵列，即相邻叉指电极(5)的柱状结构(14)沿x方向前后对准形成阵列，同一叉指电极(5)相邻柱状结构(14)之间的空隙称为柱子间隙(15)，沿x方向柱子间隙(15)前后对准形成垂直于叉指电极的多条并行分流道(10)。

所述介电泳微流控芯片的顶层(1)，包含可以进行插管注入的流道出入口(4)。顶层(1)材料为绝缘透明材质，优选聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

所述介电泳微流控芯片的基底层(3)，为绝缘透明材质，优选玻璃。

所述介电泳微流控芯片的一体化流道-电极功能层(2)，该层结构由均一材料构成，优选固化导电聚合物-银-聚二甲基硅氧烷(AgPDMS)。

所述介电泳微流控芯片的叉指电极(5)的薄层板(13)采用周期性重复的波形结构，优选为多边形形状形成锯齿波外形，或圆弧状的波浪形结构；周期性重复单元(11)每周期长度优选180-350μm，最宽处宽度优选180-280μm，最窄处宽度优选120-220μm；重复周期数优选10-20个。该层厚度优选10-30μm。

所述介电泳微流控芯片的叉指电极(5)的下层柱状结构(14)厚度即轴向长度优选40-70μm，柱状结构的径向最大长度优选100-200μm；对于同一叉指电极(5)的柱状图案，柱子间隙(15)的宽度优选50-150μm，柱子数量优选10-20个，柱子形状可选但不限于圆柱、圆角矩形柱、立方体柱。

所述介电泳微流控芯片的叉指电极(5)对数优选5-15对，相邻叉指电极间距(12)优选80-150μm。

所述介电泳微流控芯片的叉指电极(5)末端与极性相反的主电极(7)之间的电极间窄绝缘沟道(9)宽度优选10-50μm。

所述介电泳微流控芯片的一体化流道-电极功能层(2)，流道边界墙体(8)与两主电极(7)之间的板极间窄绝缘沟道(6)宽度优选100-200μm。

本发明所述介电泳微流控芯片的制备，包括仅需一次倒模且倒模过程中无需对准式光刻工艺的微加工过程，其加工过程如下：

(1)、模具加工；优选通过光刻加工多层SU-8结构，制备成一体化流道-电极功能层(2)所需的模具(20)；模具一经加工完成，重复可用，倒模过程中无需多余对准式光刻步骤；

(2)、在模具(20)定义的沟槽中填充一体化流道-电极功能层(2)的材料，即AgPDMS填充物(17)，并通过研磨使得AgPDMS填充物与模具上表面平齐，加热固化AgPDMS；

(3)、在模具(20)上表面固化一层顶层(1)所需的材料，即PDMS，优选2～6mm；需要注意的是，PDMS仅为芯片顶部，PDMS层无任何图案；

(4)、固化后的顶层(1)与前述步骤中成型的AgPDMS层自然键合成为一体，将这一结构整体从模具(20)上揭下，并在顶层(1)上打孔形成流道出入口(4)，然后再将该结构与基底层(3)键合，优选玻璃-AgPDMS等离子键合。

(5)、使用绝缘材料填充板极间窄绝缘沟道(6)，优选PDMS。

本发明采用的叉指电极(5)具有周期变化波形形状的薄层板(13)连接下层一排等距柱状结构(14)，电极整体呈现出非均匀的侧壁结构，因此不仅能够在水平面(xy平面)产生非均匀电场，并且能够在竖直(z)方向上产生非均匀电场，从而同时产生水平方向与竖直方向的介电泳力场，对细胞进行水平位置与竖直方向上的三维控制与分离，提高分离纯度。

所述叉指电极(5)下部的排型柱状结构(14)，相邻柱子间隙(15)位于电极内部，因此场强极低，形成电场极小值；与现有技术通过改变水平面中电极间距来获得非均匀电场的介电泳电极不同，电极内部形成的极小值相比极大值有3个数量级的差异，因此带来极大的介电泳力场，实现对流道中细胞的有效聚焦。

所述叉指电极(5)下部的排型柱状结构(14)前后对准形成阵列，相邻柱子间隙(15)前后对准形成垂直于叉指电极的多条并行分流道(10)，该流道在叉指电极下半部分穿过而不影响整根电极的导电的连续性。同时并行分流道数量方便扩展而不会改变电场分布，有益于提高样本通量。

所述介电泳微流控芯片的一体化流道-电极功能层(2)，其主电极(7)延伸出的叉指电极(5)由于其独特的非均匀侧壁结构衍生出了横穿电极而过的多条并行分流道(10)而不影响电极导电的连续性；因此该结构不仅作为电极产生三维非均匀电场进而产生介电泳力场，同时也作为流道边界定义了流场特性，将主流道划分为多条并行分流道(10)，允许细胞通过。

所述一体化流道-电极功能层(2)全部由均一导电材料构成，并通过一次倒模工艺微加工而成。

所述介电泳微流控芯片的一体化流道-电极功能层(2)，主电极(7)与出入口流道边界墙体(8)、叉指电极(5)末端与极性相反的主电极(7)之间，设有板极间窄绝缘沟道(6)和电极间窄绝缘沟道(9)。板极间窄绝缘沟道(6)和电极间窄绝缘沟道(9)对整体流场基本无影响，可自然填充样品溶液；为防止板极间窄绝缘沟道(6)漏液，可通过电介质填充来阻塞其末端。

所述一体化流道-电极功能层(2)由两层结构构成，但结构设计不仅限于两层，也可以通过多于两层的结构来增强侧壁的非均匀度，进而增强电场的非均匀度，以产生高效的介电泳力场。

相比现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种以AgPDMS为材料的具有非均匀侧壁的三维微电极，与现有的同类集成AgPDMS电极器件所使用的均匀电极侧壁结构不同，本发明针对现有均匀侧壁电极只能产生水平方向介电力场却无法产生竖直方向介电力场的缺陷，通过非均匀侧壁在竖直和水平方向同时引入非均匀电场产生的介电力场，进而对细胞进行水平与竖直方向上的三维控制与分离，提高分离纯度。三维高度非均匀的电场产生强有力的负介电泳聚焦效应，在分离的同时可以控制流道中的细胞使其聚焦。同时，非均匀侧壁结构衍生的流道边界可以将主流道划分为并行分流道，分流道的数量具有可扩展性，有利于提高样本通量。此外，相比同类功能的集成了硅基或金属三维微电极的器件，本发明使用软光刻倒模完成电极加工，避免了昂贵的微加工工艺。

(2)本发明提供了一种免对准加工方式，这是基于本发明的电极和流道结构由均一的AgPDMS材料构成的特征，不同于现有的集成AgPDMS电极器件所采用的不同材料构造电极(AgPDMS)和流道(PDMS)的特点。本发明通过前期加工好的SU-8模具对AgPDMS材料倒模实现一体化流道-电极的一次成型，避免了现有集成AgPDMS电极器件每次加工时在模具上进行的对准式牺牲层光刻，简化工艺的同时降低成本。

附图说明

图1为本发明所述用于细胞分选和聚焦的介电泳微流控芯片的一种实施例的整体结构示意图，从左起依次为顶层，一体化流道-电极功能层，基底层。

图2为本发明所述用于细胞分选和聚焦的介电泳微流控芯片的一种实施例的叉指电极示意图，分别为(a)俯视图和(b)正视图。

图3为本发明所述用于细胞分选和聚焦的介电泳微流控芯片的一种实施例的非均匀侧壁微电极示意图，分别为(a)正视图(b)侧视图(c)翻转图。

图4为本发明所述用于细胞分选和聚焦的介电泳微流控芯片的一种实施例的窄绝缘沟道示意图，分别为(a)填充前和(b)填充后。

图5为本发明所述免对准微加工方法的加工流程图。

图6为本发明所述免对准微加工方法中，对多层SU-8模具进行AgPDMS填充并研磨过程的示意图。

图7为本发明所述用于细胞分选和聚焦的介电泳微流控芯片的一种实施例的电场分布图。

图8为本发明所述用于细胞分选和聚焦的介电泳微流控芯片的一种实施例的细胞分选示意图，分别为(a)分散状态(b)分选和聚焦状态。

图9为将2μm微球与15μm微球的混合溶液注入本发明具体实施所得的微流控芯片中，通电前后两种微球在流道中的分布图，分别为(a)通电前(b)通电后。

图10为将血细胞与7μm微球的混合溶液注入本发明具体实施所得的微流控芯片中，通电前后细胞和微球在流道中的分布图，分别为(a)通电前(b)通电后。

图11为将血细胞稀释溶液注入本发明具体实施所得的微流控芯片中，通电前后细胞在流道中的分布图，分别为(a)通电前(b)通电后。

附图标记如下：1、顶层，2、一体化流道-电极功能层，3、基底层，4、流道出入口，5、叉指电极，6、板极间窄绝缘沟道，7、长方体主电极，8、流道边界墙体，9、电极间窄绝缘沟道，10、并行分流道，11、周期性重复单元，12、相邻叉指电极间距，13、薄层板，14、柱状结构，15、柱子间隙，16、PDMS，17、AgPDMS填充物，18、上层周期性多边形结构，19、下层排型柱状结构，20、模具，21、硅片，22、电场强度的最大值，23、电场强度的最小值，24、入口处，25、出口处，26、受正向介电泳力(pDEP)的粒子，27、受负向介电泳力(nDEP)的粒子，28、板极间窄绝缘沟道延伸至器件边缘的开口处。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明提供了一种用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片，包括自上而下组合在一起的顶层1、一体化流道-电极功能层2和基底层3，如图1所示。

所述顶层1沿长度方向上设有两个进行插管注入的孔，分别作为流道出入口4。

所述一体化流道-电极功能层2包括如图2所示的一对长方体主电极7、叉指电极5；长方体主电极7上表面长度方向为x方向，在主电极7的上表面与x方向垂直的记为y方向，与x、y方向垂直的主电极高度方向记为z方向；两长方体主电极7上表面共平面且侧壁平行相对，两长方体主电极7之间具有空隙作为主流道；两长方体主电极7上分别具有多个均匀分布的整体为长条状的且在z方向与主电极高度相等的叉指电极5，每个主电极7上的长条状叉指电极5垂直主电极7伸入到主流道并指向对面的主电极7，且与对面的主电极7之间具有空隙称为电极间窄绝缘沟道9；两主电极7上的叉指电极5在主流道中交替间歇均匀分布。

在两主电极7长度方向的两端均设有流道边界墙体8，流道边界墙体8与两主电极7共平面且等高，且在流道边界墙体8上各设有一个凹槽通孔与主流道联通，其中一个凹槽通孔为入口处24，另一个为出口处25；入口处24和出口处25分别与贯穿顶层1的流道出入口4上下相对且连通；流道边界墙体8与两主电极7之间具有空隙记为板极间窄绝缘沟道6，每个芯片有四个板极间窄绝缘沟道6。

所述整体为长条状的叉指电极5分上下两层结构。上面为长度方向沿y方向的长条状的薄层板13，下面为与薄层板13的下表面相连的多个沿y方向均匀排列成一排的柱状结构14；柱状结构14的轴沿z方向且与薄层板13垂直；薄层板13的两侧壁是对称的呈周期变化的波形结构，使得薄层板13沿长度方向的面积呈周期性变大和缩小；柱状结构14位于每一个重复周期面积相对较大的薄层板13下面，且与柱状结构14相对应的薄层板13的面积覆盖且大于柱状结构14的上端面面积；主流道之间多个叉指电极5的所有柱状结构14形成矩形阵列，即相邻叉指电极5的柱状结构14沿x方向前后对准形成阵列，同一叉指电极5相邻柱状结构14之间的空隙称为柱子间隙15，沿x方向柱子间隙15前后对准形成垂直于叉指电极的多条并行分流道10。

所述用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片的顶层1选用透明材料PDMS，厚度为2～4mm；所述基底层3选用透明材料玻璃。

所述用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片的一体化流道-电极功能层2由均一材料构成，具体为固化导电聚合物-银-聚二甲基硅氧烷(AgPDMS)，并通过一次倒模工艺微加工而成。

所述用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片的叉指电极5包括10对电极指，相邻叉指电极间距12最小为100μm，电极叉指均由上层具有周期变化多边形形状的薄层板13连接下层一排等距柱状结构14构成，电极整体呈现出非均匀的侧壁结构如图3所示，因此能够同时在水平面(xy平面)和竖直(z)方向上产生非均匀电场，从而同时产生水平方向与竖直方向的介电泳力场，对细胞进行水平位置与竖直方向上的三维控制与分离，提高分离纯度。

所述用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片的叉指电极5上层的薄层板13采用周期性重复的波形结构，为多边形形状形成锯齿波外形；周期性重复单元11每周期长度为250μm，最宽处宽度为270μm，最窄处宽度为150μm；重复周期数为10个；该层厚度为20μm。

所述用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片的叉指电极5下层的柱状结构14厚度即轴向长度为50μm，柱状结构的径向最大长度为150μm；对于同一叉指电极5的柱状图案，柱子间隙15为100μm，柱子数量为10个，柱子形状为圆柱。

所述用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片的叉指电极5末端与极性相反的主电极7之间的电极间窄绝缘沟道9宽度为40μm。

所述用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片的一体化流道-电极功能层2，其流道边界墙体8与两主电极7之间板极间窄绝缘沟道6宽度为100μm。

所述介电泳微流控芯片的一体化流道-电极功能层的窄绝缘沟道6,9对整体流场基本无影响，可自然填充样品溶液；为防止板极间窄绝缘沟道6漏液，在芯片加工完成后，使用钢管蘸取少量PDMS16置于该绝缘沟道延伸至器件边缘的开口处28，PDMS将通过毛细作用进入该绝缘沟道，以达堵塞绝缘沟道防止漏液的目的，如图4所示。

本发明提供了一种微流控芯片的免对准加工方法，其流程如图5所示，详细描述如下：

(1)模具的加工。在硅片21上分别对两层SU-8进行光刻形成相应的图案(如图5步骤1-2)，之后同时进行显影形成多层的SU-8模具20，包括第一层光刻获得的供填充的下层排型柱状结构19和第二层光刻获得的供填充的上层周期性多边形结构18(如图5步骤3)。该模具一经加工完成，重复可用，倒模过程中无需额外的牺牲层光刻步骤。

(2)将银粉按照85.2％的质量分数与PDMS混合在一起，在研钵中研磨混合物至AgPDMS呈现膏状(时间约一小时及以上)。填充过程如图6所示，将膏状的AgPDMS均匀覆盖在SU-8模具20表面，通过按压使AgPDMS尽可能地填充满SU-8模具上的空白区域；将覆盖有AgPDMS的SU-8模具在纸面上研磨以去除多余的AgPDMS，使得AgPDMS填充物与SU-8模具上表面平齐。将填充好的SU-8模具放在70℃的加热板上加热2小时，使AgPDMS固化，形成一体化的流道-电极功能层2(如图5步骤4)。

(3)在(2)所得的填充有AgPDMS的模具表面浇筑PDMS，高度为2-4mm，在70℃的加热板上加热2小时，使浇筑的PDMS固化，形成芯片的顶层1(如图5步骤5)。

(4)固化后的PDMS顶层1与AgPDMS一体化流道-电极功能层2自然键合成为一体，将这一结构整体从模具20上揭下，在对应芯片出入口位置的PDMS顶层上表面向下方打孔，获得与外界连通的可以插管的流道出入口4。

(5)对(4)所得的器件和载玻片进行超声清洗、IPA冲洗、去离子水冲洗，然后对清洁后的器件和载玻片进行氮气吹干，并在120℃的加热板上加热10分钟以完全去除水分。

(6)将(5)所得的清洁过的器件和载玻片进行等离子键合，获得最终的芯片(如图5步骤6)。

图7显示了所述一体化流道-电极功能层的叉指电极所产生的非均匀电场，电场强度的最大值22在叉指电极上层的薄层板13锯齿波峰处获得，最大值可达10⁵V/m；而电场强度的最小值23在叉指电极下层的圆柱之间的流道内获得，最小值低至10²V/m。图8为所述微流控芯片工作示意图。未通电状态下，所有粒子分散在整个流道内。通电状态下，受正向介电泳力(pDEP)的粒子26将被吸引到电场强度较高的区域，即薄层板13锯齿波形状的波峰处；而受负向介电泳力(nDEP)的粒子27被排斥到电场强度较低的区域，聚焦为珍珠链通过下层柱状电极间的并行分流道10，由此实现了粒子的分选和聚焦。

实施例1

本实施例使用上述实施方式所得的介电泳微流控芯片和作为细胞模型的聚苯乙烯微球进行粒子分选的效果测试，具体步骤如下：

使用去离子水(DI Water)稀释聚苯乙烯微球溶液，得到2μm微球和15μm微球的混合溶液，其中，2μm微球和15μm微球的浓度分别为1×10⁸个/ml和5×10⁶个/ml。将该混合溶液以0.15ml/h的流速注入到上述的介电泳微流控芯片中。从两端主电极7输入幅值为30V_pp，频率为20kHz的正弦信号，在显微镜下观察微球的运动轨迹。

经观察，在未输入电信号时，2μm微球和15μm微球分散在整个流道中，随溶液流动方向出口处25移动，如图9(a)所示。输入电信号后，2μm微球受正向介电泳力(pDEP)被吸引并捕获在电场强度较高的薄层板13锯齿波峰边缘；而15μm微球受负向介电泳力(nDEP)被电场强度高的区域排斥，聚焦成珍珠链通过下层柱状电极间的并行分流道10，如图9(b)所示。说明上述介电泳微流控芯片可以实现粒子的分选和聚焦。

实施例2

本实施例使用上述实施方式所得的介电泳微流控芯片和红细胞与聚苯乙烯微球的混合溶液进行粒子分选的效果测试，具体步骤如下：

使用300mM的D-甘露醇溶液对人体血液进行稀释，将稀释后的血液与大小近似于血细胞的7μm微球的溶液混合，得到两种微粒的混合溶液，溶液电导率为0.01S/m，且血细胞和7μm微球的浓度均为1×10⁷个/ml。同样将该混合溶液以0.15ml/h的流速注入到上述的介电泳微流控芯片中。从两端主电极7输入幅值为35V_pp，频率为1MHz的正弦信号，在显微镜下观察两种微粒的运动轨迹。

经观察，在未输入电信号时，血细胞和7μm微球分散在整个流道中，随溶液流动方向向出口处25移动，如图10(a)所示。输入电信号后，血细胞受到强正向介电泳力(pDEP)，因此被吸引并捕获在电场强度较高的薄层板13锯齿波峰边缘；而7μm微球受负向介电泳力(nDEP)被电场强度高的区域排斥，聚焦成珍珠链通过下层柱状电极间的并行分流道10，如图10(b)所示。说明上述介电泳微流控芯片可以实现细胞的分选和分选过程中的粒子聚焦。

实施例3

本实施例使用上述实施方式所得的介电泳微流控芯片和稀释的人体血液进行细胞聚焦的效果测试，具体步骤如下：

使用300mM的D-甘露醇溶液对人体血液进行稀释，得到血细胞浓度为4×10⁷个/ml的溶液，溶液电导率为0.02S/m。同样将该混合溶液以0.15ml/h的流速注入到上述的介电泳微流控芯片中。从两端主电极7输入幅值为35V_pp，频率为100kHz的正弦信号，在显微镜下观察血细胞的运动轨迹。

经观察，在未输入电信号时，血细胞分散在整个流道中，随溶液流动方向向出口处25移动，如图11(a)所示。输入电信号后，血细胞受负向介电泳力(nDEP)被电场强度高的区域排斥，分散状态的细胞聚焦成窄细胞束通过下层柱状电极间的并行分流道10，如图11(b)所示。说明上述介电泳微流控芯片可以实现细胞的聚焦。

Claims (9)

1.一种用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括自上而下依次组合在一起的顶层(1)、一体化流道-电极功能层(2)、基底层(3)；

所述的顶层(1)沿长度方向上设有两个进行插管注入的孔，分别作为流道出入口(4)；

所述一体化流道-电极功能层(2)包含一对长方体主电极(7)、叉指电极(5)；长方体主电极(7)上表面长度方向为x方向，在主电极(7)上表面与x方向垂直的记为y方向，与x、y方向垂直的主电极高度方向记为z方向；两长方体主电极(7)上表面共平面且侧壁平行相对，两长方体主电极(7)之间具有空隙作为主流道；两长方体主电极(7)相对的侧边上分别具有多个均匀分布的整体为长条状的且在z方向与主电极高度相等的叉指电极(5)，每个主电极(7)上的长条状叉指电极(5)垂直主电极(7)伸入到主流道并指向对面的主电极(7)，且与对面的主电极(7)之间具有空隙称为电极间窄绝缘沟道(9)；两主电极(7)上的叉指电极(5)在主流道中交替间隔均匀分布；

在两主电极(7)长度方向的两端均设有流道边界墙体(8)，流道边界墙体(8)与两主电极(7)共平面且等高，在流道边界墙体(8)上各设有一个凹槽通孔与主流道连通，其中一个凹槽通孔为入口处(24)，另一个为出口处(25)；入口处(24)和出口处(25)分别与贯穿顶层(1)的流道出入口(4)上下相对且连通；流道边界墙体(8)与两主电极(7)之间具有空隙记为板极间窄绝缘沟道(6)；

所述整体为长条状的叉指电极(5)分上、下两层结构；上面为长度方向沿y方向的长条状的薄层板(13)，下面为与薄层板(13)的下表面相连的多个沿y方向均匀排列成一排的柱状结构(14)；柱状结构(14)的轴沿z方向且与薄层板(13)垂直；薄层板(13)的两侧壁是对称的呈周期变化的波形结构，使得薄层板(13)沿长度方向的面积呈周期性变大和缩小；柱状结构(14)位于每一个重复周期面积相对较大的薄层板(13)下面，且与柱状结构(14)相对应的薄层板(13)的面积覆盖且大于柱状结构(14)的上端面面积；主流道之间多个叉指电极(5)的所有柱状结构(14)形成矩形阵列，即相邻叉指电极(5)的柱状结构(14)沿x方向前后对准形成阵列，同一叉指电极(5)相邻柱状结构(14)之间的空隙称为柱子间隙(15)，沿x方向柱子间隙(15)前后对准形成垂直于叉指电极的多条并行分流道(10)。

2.按照权利要求1所述的一种用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片，其特征在于，所述介电泳微流控芯片的顶层(1)材料为绝缘透明材质，优选聚二甲基硅氧烷(PDMS)；所述介电泳微流控芯片的基底层(3)，为绝缘透明材质，优选玻璃。

3.按照权利要求1所述的一种用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片，其特征在于，一体化流道-电极功能层(2)，该层结构由均一材料构成，优选固化导电聚合物-银-聚二甲基硅氧烷(AgPDMS)。

4.按照权利要求1所述的一种用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片，其特征在于，叉指电极(5)的薄层板(13)采用周期性重复的波形结构，为多边形形状形成锯齿波外形，或圆弧状的波浪形结构；周期性重复单元(11)每周期长度为180-350μm，最宽处宽度为180-280μm，最窄处宽度为120-220μm；重复周期数为10-20个；该层厚度为10-30μm。

5.按照权利要求1所述的一种用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片，其特征在于，所述叉指电极(5)的下层柱状结构(14)厚度即轴向长度为40-70μm，柱状结构的径向最大长度为100-200μm；对于同一叉指电极(5)的柱状图案，柱子间隙(15)为50-150μm，柱子数量为10-20个，柱子形状可选但不限于圆柱、圆角矩形柱、立方体柱。

6.按照权利要求1所述的一种用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片，其特征在于，所述介电泳微流控芯片的叉指电极(5)对数为5-15对，相邻叉指电极间距(12)为80-150μm。

7.按照权利要求1所述的一种用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片，其特征在于，所述介电泳微流控芯片的叉指电极(5)末端与极性相反的主电极(7)之间的电极间窄绝缘沟道(9)宽度为10-50μm。

8.按照权利要求1所述的一种用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片，其特征在于，所述介电泳微流控芯片的一体化流道-电极功能层(2)，流道边界墙体(8)与两主电极(7)之间的板极间窄绝缘沟道(6)宽度为100-200μm。

9.制备权利要求1-8任一项所述的一种用于细胞分选与聚焦的介电泳微流控芯片的方法，其特征在于，包括仅需一次倒模且倒模过程中无需对准式光刻工艺的微加工过程，其加工过程如下：

(1)、模具加工；为通过光刻加工多层SU-8结构，制备成一体化流道-电极功能层(2)所需的模具(20)；模具一经加工完成，重复可用，倒模过程中无需多余对准式光刻步骤；

(2)、在模具(20)定义的沟槽中填充一体化流道-电极功能层(2)的材料，优选AgPDMS填充物(17)，并通过研磨使得AgPDMS填充物与模具上表面平齐，加热固化AgPDMS；

(3)、在模具(20)上表面固化一层顶层(1)所需的材料，优选PDMS，优选2～6mm；需要注意的是，PDMS仅为芯片顶部，PDMS层无任何图案；

(4)、固化后的顶层(1)与前述步骤中成型的AgPDMS层自然键合成为一体，将这一结构整体从模具(20)上揭下，并在顶层(1)上打孔形成流道出入口(4)，然后再将该结构与基底层(3)键合，为玻璃-AgPDMS等离子键合；

(5)、使用绝缘材料填充板极间窄绝缘沟道(6)，优选PDMS。