CN109456874B - 一种细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片 - Google Patents

一种细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片；包括依次连接的进口单元、单细胞介电泳操控单元和出口单元；所述进口单元包括细胞混合液进口和缓冲液进口；所述单细胞介电泳操控单元包括含有微阱的微流道、可寻址金属电极和平板电极。本发明还提供一种单细胞双向介电泳操控方法。本发明与现有细胞操控技术相比，具有芯片结构和加工工艺简单、单细胞操控能力、集成化高、操作简单、细胞回收率高和细胞分选纯度高的优点。

Description

一种细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片
技术领域
本发明涉及单细胞操控、分离和分选，可用于单细胞培养分析、药物传送评估、药效鉴定、癌症监测和效果评估等领域，具体地，涉及一种细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片。
背景技术
如今，运动神经元症(渐冻人症)、艾滋病、白血病、癌症和类风湿被世界卫生组织列为世界五大疑难杂症，它们严重威胁着人类的健康。针对癌症、白血病和艾滋病等疾病的检测，临床上通常需要进行血液分析。而在血液分析之前，需要将目标细胞与其他细胞分离，获得高纯度的目标细胞显得十分必要，目前临床上最为常见的细胞分离方法是梯度离心方法。在细胞分离领域，就目前技术而言，高纯度的细胞分离能力是一个极具挑战的事情。
微流控技术在微环境下能够精确操控微流控的能力使得它在细胞操控领域具有得天独厚的优势。基于微流控技术，细胞分离技术已有光学分离技术、电学分离技术、磁学分离技术、声波学分离技术和机械力分选技术。其中，光学力和磁学力细胞分离技术已有商业化的产品，但它们仍旧存在分离纯度不高和设备昂贵的缺点。介电泳第一次被H.A.Pohl提出以来，由于其具有无需标定、无需预充电和可控地操控的能力，使得它在细胞操控领域成为一种强有力的工具。H.A.Pohl等在Science，1966，152(3722)：647-649首次使用介电泳的方法成功的分离了死的和活的酵母细胞。检索文献可知，利用介电泳的方式已经实现了循环肿瘤细胞、干细胞、白细胞、细菌和病毒的分离。然而，大多数现有的介电泳细胞操控平台的细胞分离纯度不高，并且难以在单细胞尺度上对目标细胞进行操控。
发明内容
针对现有技术中存在的目前细胞分选设备的分选纯度不高的缺陷，本发明的目的在于提供一种细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片。该芯片在微流道一侧设置于微电极一一对应的微阱，微阱的设置保证了单个细胞操控的可行性。另外，微阱是设置在平板电极和可寻址电极之间，无需进行加工上下层电极和嵌与两层电极之间的微阱，这大大的简化了芯片加工工艺，大幅度的提高成品率的同时降低加工成本。该芯片在单细胞尺度上保证了目标细胞分离的纯度。该芯片利用介电泳原理，针对细胞在不同频率下表现出正负向介电泳的现象来实现细胞操控。单细胞操控流程为细胞流经介电泳单细胞操控区域时，利用细胞正向介电泳将细胞捕获于微阱中；接着使用细胞缓冲液清洗未被捕获于微阱的细胞；通过单独控制需要移出的目标细胞所在微阱对应的电极，利用细胞负向介电泳将微阱中的单个细胞移出微阱。最后，使用缓冲液将移出的细胞移至细胞回收出口回收，完成单个细胞100％纯度分离。本发明具有工艺简单、成本低廉、细胞回收率高、纯度高和单细胞操控能力的特点。
具体来说，本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片，所述芯片包括依次连接的进口单元1、单细胞介电泳操控单元和出口单元2；
所述进口单元1包括细胞混合液进口和缓冲液进口；
所述单细胞介电泳操控单元包括含有微阱9的微流道3、可寻址电极4和平板电极8；
所述微流道3设于可寻址电极4和平板电极8之间；且所述微阱9设于微流道3靠近可寻址电极4的一侧；
所述微阱9与所述可寻址电极4一一对应；
所述可寻址电极4的另一端为可寻址电极驱动输入引脚4’；
所述进口单元1和出口单元2贯穿依次设置于衬底5之上的透明密封层7和介电层6；
所述进口单元1、单细胞介电泳操控单元和出口单元2设置于衬底5之上。
所述可寻址电极4和平板电极8包裹于介电层6内；所述电极驱动输入引脚4’上方无介电层6，与外界驱动电路连接。
所述含有微阱9的微流道3是介电层6通过光刻的方式制备而得。
优选的，衬底5为硅、玻璃或聚合物衬底，厚度为0.5mm～3mm。
优选的，可寻址电极4的材料为导电金属；所述可寻址电极4形状为针尖形、方形或弧形，厚度为0.1μm～1mm，可寻址电极4宽W1为1μm～1mm，相邻两可寻址电极4的间距W2为2～5倍的可寻址电极(4)宽W1，数目可为任意个数。更优选的，所述寻址电极4的个数为64～4096个。
优选的，可寻址电极4与微阱9的间距W4为1μm～50μm。
优选的，介电层6的材料为SU8光刻胶或光敏性聚酰亚胺。
优选的，微阱9可为任意形状，尺寸根据操控的细胞尺寸设置。
优选的，含有微阱9的微流道3深为20μm～200μm，宽20μm～300μm；所述含有微阱9的微流道3一端与进口单元相1连通，另一端与出口单元2相连通。
优选的，平板电极8材料为导电金属，宽度为10μm～10mm，厚度与可寻址电极4的厚度一致；所述平板电极8与含有微阱9的微流道3的间距W3为1μm～50μm。
优选的，透明密封层7为玻璃或透明聚合物，厚度为100μm～10mm。
第二方面，本发明还涉及一种应用上述任一项所述的细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片的单细胞操控方法，所述方法包括如下步骤：
S1、细胞混合液从细胞混合液进口进入，流经单细胞介电泳操控单元时，在施加了特定频率F1的电驱动的可寻址电极4的作用下，使细胞进行正向介电泳被捕获至微阱9中；
S2、缓冲液从缓冲液进口进入，将未被捕获于微阱9的细胞排出双向介电泳单细胞操控微流控芯片；捕获于微阱9中的目标细胞，在施加了特定频率F2的电驱动的可寻址电极4的作用下，使该电极对应的微阱9中的细胞进行负向介电泳而移出微阱9；
S3、利用缓冲液将目标细胞从出口单元2移出。
优选的，特定频率F1和特定频率F2的电驱动的波形为三角波、方波或正弦波，频率为1Hz～10MHz，峰值为5V～20V。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明将三维电极两维化，将微阱设置于平板电极与可寻址电极之间，并靠近可寻址电极的一侧，取消了制作三维电极的工艺和简化了微阱与介电层的加工流程，提高了成品率，并能降低成本。
2、本发明利用细胞双向介电泳特性，利用正向介电泳捕获细胞，然后利用流体力学排除未捕获的细胞；再通过控制单个电极使细胞负介电泳，将目标细胞从微阱中排除，接着利用流体力学回收目标细胞。相对于单向介电泳芯片而言，降低了芯片的复杂度；相对于三维电极而言，又避免了三维电极复杂的制备工艺。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明未带密封层的俯视图示意图；
图2为本发明未带密封层的俯视局部放大示意图；
图3为A-A’截面示意图；
图4为B-B’截面示意图；
图5为本发明的电极局部的显微镜照片；
图6为本发明的微阱的显微镜照片；
图7为本发明的芯片的内部电场仿真结果；
图8为本发明的实物照片。
其中，1为进口单元，2为出口单元，3为微流道，4为可寻址电极，4’为可寻址电极驱动输入引脚，5为衬底，6为介电层，7为透明密封层，8为平板电极，9为微阱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明提供一种细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片，如图1-3，芯片包括依次连接的进口单元1、单细胞介电泳操控单元和出口单元2。
所述进口单元1包括细胞混合液进口和缓冲液进口；
所述单细胞介电泳操控单元包括含有微阱9的微流道3、可寻址电极4和平板电极8；
所述微流道3设于可寻址电极4和平板电极8之间；且所述微阱9设于微流道3靠近可寻址电极4的一侧；
所述微阱9与所述可寻址电极4一一对应；
所述可寻址电极一端为电极端4，另一端为电极驱动输入引脚4’；
所述进口单元1和出口单元2贯穿透明密封层7和介电层6，可以理解为微流道通过进口单元1和出口单元2与外界连通；
所述进口单元1、单细胞介电泳操控单元和出口单元2设置于衬底5之上；
所述衬底5为硅、玻璃或聚合物衬底，厚度为0.5mm～3mm；
所述可寻址电极4的材料为导电金属；
所述可寻址电极4形状为针尖形，方形、弧形，厚度为0.1μm～1mm，可寻址电极4宽W1为1μm～1mm，两可寻址电极4的间距W2为2～5倍的可寻址电极(4)宽W1，数目可为任意个数；
所述可寻址电极4与微阱9的间距W4为1μm～50μm；
所述介电层6的材料为SU8光刻胶或光敏性聚酰亚胺；
所述微阱9可为任意形状，尺寸根据操控的细胞尺寸设置；
所述含有微阱9的微流道3深为20μm～200μm，宽为20μm～300μm；
所述含有微阱9的微流道3一端与进口单元相1连通，另一端与出口单元2相连通；
所述平板电极8材料为导电金属，宽度为10μm～10mm，厚度与可寻址电极4的厚度一致；
所述平板电极8与含有微阱9的微流道3的间距W3为1μm～50μm；
所述透明密封层7为玻璃或透明聚合物，厚度为100μm～10mm；
所述的细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片的单细胞操控方法包括如下步骤：
S1、细胞混合液从细胞混合液进口进入，流经单细胞介电泳操控单元时，在施加了特定频率F1的电驱动的可寻址电极4的作用下，使细胞进行正向介电泳被捕获至微阱9中；
S2、缓冲液从缓冲液进口进入，将未被捕获于微阱的细胞排出双向介电泳单细胞操控微流控芯片；捕获于微阱9中的目标细胞，在施加了特定频率F2的电驱动的可寻址电极4的作用下，使该电极对应的微阱中的细胞进行负向介电泳而移出微阱；
S3、利用缓冲液将目标细胞从出口单元2移出；
所述特定频率F1和特定频率F2的电驱动的波形为三角波、方波或正弦波，频率为1Hz～10MHz，峰峰值为5V～20V。
下面对本发明进行更为具体的说明。具体实施例如下：
实施例1
本发明提供一种细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片，如图1俯视图所示，芯片包括依次连接的进口单元1、单细胞介电泳操控单元和出口单元2。
所述进口单元1包括细胞混合液进口和缓冲液进口；
所述单细胞介电泳操控单元包括含有微阱9的微流道3、可寻址电极4和平板电极8；
所述可寻址电极4的另一端为电极驱动输入引脚4’；
所述进口单元1通过设置有微阱的微流道3连通到出口单元2；
所述微阱9设置于靠近可寻址电极4一侧的微流道3侧壁上；
所述衬底5为玻璃衬底，厚度为0.5mm；
所述介电层6的材料为光敏性聚酰亚胺，厚度为50μm；
如图2局部俯视图所示，所述微阱9与可寻址电极4一一对应；
所述微阱9为方形，尺寸为30μm×30μm；
所述可寻址电极4形状为针尖形，厚度为10μm，可寻址电极4宽W1为30μm，
两可寻址电极4的间距W2为90μm，数目为64个；
所述平板电极8与含有微阱9的微流道3的间距W3为20μm；
所述可寻址电极4与微阱9的间距W4为20μm；
如图3截面图A-A’所示，所述进口单元1和出口单元2贯穿透明密封层7和介电层6，可以理解为微流道通过进口单元1和出口单元2与外界连通；
所述介电层6和透明密封层7依次设置于衬底5之上；
如图4截面图B-B’所示，所述可寻址电极4和平板电极8包裹于介电层6内；
所述电极驱动输入引脚4’上方无介电层6，可以与外界驱动电路连接；
所述含有微阱9的微流道3是介电层6通过光刻的方式制备；
所述透明密封层7为聚二甲基硅氧烷，厚度为3mm；
如图5显微镜照片所示，所述可寻址电极4的材料为铜，并且在铜表面镀0.5μm金，防止铜氧化；
所述平板电极8材料为铜，在铜表面镀0.5μm金，防止铜氧化，宽度为1000μm，厚度与可寻址电极4的厚度一致；
如图6显微镜照片所示，所述含有微阱9的微流道3深为50μm，宽为50μm；
如图7仿真图所示，针尖状的可寻址电极4产生的不均匀电场的电场梯度高达8.9×105V/m，微阱内部的电场强度远高于微流道内部的电场强度；可以理解为，细胞在正向介电泳的作用下往电场强度强处移动而被捕获于微阱之中；相反地，细胞在负向介电泳的作用下，将从微阱中被移出；
如图8实物照片所示，所述侧壁开有微阱的微流道3一端与进口单元相1连通，另一端与出口单元2相连通；
所述电极驱动输入引脚4’和平板电极8通过金线焊接到印刷电路板上；
所述的细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片的单细胞操控方法包括如下步骤：
S1、细胞混合液从细胞混合液进口进入，流经单细胞介电泳操控单元时，在施加了特定频率F1的电驱动的可寻址电极4的作用下，使细胞进行正向介电泳被捕获至微阱9中；
S2、缓冲液从缓冲液进口进入，将未被捕获于微阱9的细胞排出双向介电泳单细胞操控微流控芯片；捕获于微阱9中的目标细胞，在施加了特定频率F2的电驱动的可寻址电极4的作用下，使该电极对应的微阱9中的细胞进行负向介电泳而移出微阱9；
S3、利用缓冲液将目标细胞从出口单元2移出；
所述特定频率F1的电驱动为方波，频率为1kHz，峰峰值为20V；
所述特定频率F2的电驱动为方波，频率为2MHz，峰峰值为20V。
采用本实施例的单细胞微流控芯片操控细胞，该芯片能够实现单个细胞或单一多个细胞批量捕获、释放和回收。
实施例2
本实施例涉及一种细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片，为实施例1的变化例，所不同之处在于：在实施例2中，可寻址电极4材料为金，厚度为0.5μm，可寻址电极4宽W1为10μm，两可寻址电极4的间距W2为30μm，数目为128个；所述介电层6的材料为SU8；所述可寻址电极4与微阱9的间距W4为10μm；所述微阱9尺寸为20μm×20μm；所述含有微阱9的微流道3深为20μm，宽100μm；平板电极8材料可为金，宽度为2000μm，厚度与可寻址电极4的厚度一致；所述平板电极8与含有微阱9的微流道3的间距W3为30μm；所述透明密封层7为玻璃，厚度为1000μm；所述特定频率F1的电驱动为正弦波，频率为0.5kHz，峰峰值为10V；所述特定频率F2的电驱动为正弦波，频率为5MHz，峰峰值为10V。
采用本实施例的单细胞微流控芯片操控循环肿瘤细胞，该芯片能够实现单个细胞或单一多个细胞批量捕获、释放和回收。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (11)

1.一种细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片，其特征在于，所述芯片包括依次连接的进口单元(1)、单细胞介电泳操控单元和出口单元(2)；
所述进口单元(1)包括细胞混合液进口和缓冲液进口；
所述单细胞介电泳操控单元包括含有微阱(9)的微流道(3)、可寻址电极(4)和平板电极(8)；
所述微流道(3)设于可寻址电极(4)和平板电极(8)之间，且所述微阱(9)设于微流道(3)靠近可寻址电极(4)的一侧；所述芯片将三维电极两维化，无需进行加工上下层电极和嵌与两层电极之间的微阱；
所述微阱(9)与所述可寻址电极(4)一一对应；
所述可寻址电极(4)的另一端为可寻址电极驱动输入引脚(4’)；
所述进口单元(1)、单细胞介电泳操控单元和出口单元(2)设置于衬底(5)之上；
所述进口单元(1)和出口单元(2)贯穿依 次设置于衬底(5)之上的透明密封层(7)和介电层(6)。
2.如权利要求1所述的细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片，其特征在于，所述衬底(5)为硅、玻璃或聚合物衬底，厚度为0.5mm～3mm。
3.如权利要求1所述的细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片，其特征在于，所述可寻址电极(4)的材料为导电金属；所述可寻址电极(4)形状为针尖形、方形或弧形，厚度为0.1μm～1mm，可寻址电极(4)宽W1为1μm～1mm，两可寻址电极(4)的间距W2为2～5倍的可寻址电极(4)宽W1，数目可为任意个数。
4.如权利要求1所述的细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片，其特征在于，所述可寻址电极(4)与微阱(9)的间距W4为1μm～50μm。
5.如权利要求1所述的细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片，其特征在于，所述介电层(6)的材料为SU8光刻胶或光敏性聚酰亚胺。
6.如权利要求1所述的细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片，其特征在于，所述微阱(9)可为任意形状，尺寸根据操控的细胞尺寸设置。
7.如权利要求1所述的细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片，其特征在于，所述含有微阱(9)的微流道(3)深为20μm～200μm，宽20μm～300μm；所述含有微阱(9)的微流道(3)一端与进口单元(1)相连通，另一端与出口单元(2)相连通。
8.如权利要求1所述的细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片，其特征在于，所述平板电极(8)材料为导电金属，宽度为10μm～10mm，厚度与可寻址电极(4)的厚度一致；所述平板电极(8)与含有微阱(9)的微流道(3)的间距W3为1μm～50μm。
9.如权利要求1所述的细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片，其特征在于，所述透明密封层(7)为玻璃或透明聚合物，厚度为100μm～10mm。
10.一种应用如权利要求1～9中任一项所述的细胞双向介电泳单细胞操控微流控芯片的单细胞操控方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、细胞混合液从细胞混合液进口进入，流经单细胞介电泳操控单元时，在施加了频率F1的电驱动的可寻址电极(4)的作用下，使细胞进行正向介电泳被捕获至微阱(9)中；
S2、缓冲液从缓冲液进口进入，将未被捕获于微阱(9)的细胞排出双向介电泳单细胞操控微流控芯片；捕获于微阱(9)中的目标细胞，在施加了频率F2的电驱动的可寻址电极(4)的作用下，使该电极对应的微阱(9)中的细胞进行负向介电泳而移出微阱(9)；
S3、利用缓冲液将目标细胞从出口单元(2)移出。
11.如权利要求10所述的单细胞操控方法，其特征在于，所述频率F1和频率F2的电驱动的波形为三角波、方波或正弦波，频率为1Hz～10MHz，峰值为5V～20V。
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