CN109452291A - 一种防治黄瓜细菌性角斑病的方法 - Google Patents

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关巍
赵廷昌
王铁霖
杨玉文
李智鹏
吴林娜
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Abstract

本发明涉及细菌性角斑病的防治，具体涉及一种防治黄瓜细菌性角斑病的方法。本发明的方法使用1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油浸泡黄瓜种子，对黄瓜细菌性角斑病具有很好的防效。

Description

一种防治黄瓜细菌性角斑病的方法
技术领域
本发明涉及细菌性角斑病的防治，具体涉及一种防治黄瓜细菌性角斑病的方法。
背景技术
黄瓜是我国重要的蔬菜作物，近年来因连作病导致的细菌性病害日益严重。细菌性角斑病是为害黄瓜生产主要病害之一。该病害由丁香假单胞黄瓜致病变种(Pseudomonassyringae pv.lachrymans)引起，主要通过种子进行传播。自上世纪80年代开始在我国华北、东北和内蒙古等黄瓜主要产区逐渐蔓延，为害日益严重(孙福在，何礼远，1988)。近年来，该病已散布到全国范围内的保护地黄瓜，造成严重的经济损失(孔维文等，2016)。
在播种前进行种子处理，可以减少种子带菌量，防治病虫害，促进种子萌发，增加幼苗抗逆性，促进瓜苗强壮、长势旺，达到出苗整齐和迅速等作用(吴凌云等，2015)。目前用于蔬菜种子处理的杀菌剂有限，用于黄瓜种子处理的药剂主要为传统的甲醛、盐酸、硫酸链霉素等，以及保护性杀菌剂多菌灵、福美双等。由于种子处理时使用的药剂比较单一，种子对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗药性已经非常严重(张传青等，2011)。
因此，需要寻求一种新的能够有效防治黄瓜细菌性角斑病的方法。
发明内容
针对上述领域存在的问题，本发明提供一种防治黄瓜细菌性角斑病的方法，使用1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油浸泡黄瓜种子，对黄瓜细菌性角斑病具有很好的防效。
本发明请求保护的技术方案如下：
防治黄瓜细菌性角斑病的方法，其特征在于，使用1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油浸泡黄瓜种子。
优选地，所述1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油的稀释倍数为100-200倍。
优选地，所述1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油的稀释倍数为100倍。
优选地，所述浸泡时间为1小时。
本发明针对黄瓜种子带菌问题，选用组配的1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油和3种生产上常用的防治黄瓜细菌性角斑病的化学药剂，对黄瓜种子进行处理和测定相关指标，结果表明，使用1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油处理黄瓜种子后，能够有效防治黄瓜细菌性角斑病，促进黄瓜的生长。
附图说明
图1.1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油(以下称为“1号杀菌剂”)对黄瓜角斑病菌的最小抑制浓度；
其中，1：KB液体培养基；2：含0.2μg/mL 1号杀菌剂的KB液体培养基；3～9为接种了菌悬液的含不同浓度1号杀菌剂的KB液体培养基，1号杀菌剂的终浓度分别为3：0.2μg/mL；4：0.1μg/mL；5：0.06μg/mL；6：0.05μg/mL；7：0.03μg/mL；8：0.02μg/mL；9：0.01μg/mL；10：KB液体培养基接种菌悬液。
图2.接种黄瓜角斑病菌后各处理病情指数；
黄瓜种子在接种黄瓜角斑病菌后，经过不同种子处理剂消毒，播种出芽后发病，14d后呈现出细菌性角斑病的症状，调查病情指数；横坐标为不同种子处理剂处理，纵坐标为病情指数。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行详细描述，需要理解的是，下述实施例仅用于解释和说明，不限制本发明的保护范围。
供试菌株：黄瓜角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)Psl8菌株，已知菌株，记载在：Yan,S.,Yang,Y.,Wang,T.,Zhao,T.,&Schaad,N.W..(2013).Geneticdiversity analysis of acidovorax citrulli in china.European Journal of PlantPathology,136(1),171-181.，由中国农业科学院植物保护研究所保存。
上述菌株本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起20年内向公众发放用于必要的验证试验。
供试黄瓜品种：中蔬28号，已知品种，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。
主要试剂
异噻唑啉酮、二硫氰甲烷乳油：购自北京化学试剂公司。
1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油：将异噻唑啉酮、二硫氰甲烷乳油和二甲苯按照1：2：97的体积比混合而成。
盐酸、甲醛购自北京广达恒益科技有限公司，其中甲醛为47％分析纯；
72％农用链霉素购自北京中保绿农科技集团有限公司；
KB培养基(King’s B)：胰蛋白胨20g，丙三醇15mL，K2HPO4 1.5g，MgSO4·7H2O1.5g，琼脂15g(液体培养基不加)，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
下述实施例中未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级；未特别说明的试验方法均为本领域常规方法，可参考分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:alaboratory manual，2001)，或制造厂商说明书；未特别说明的仪器和耗材均为可以商购获得的常规产品。
实施例1.1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油(以下称为“1号杀菌剂”)对黄瓜角斑病菌离体抑制作用的测定
测定步骤
用灭菌10μl枪头在超净工作台中挑取KB培养基上生长到对数期(28℃培养48h)的黄瓜角斑病菌Psl8菌株单菌落，接种于装有灭菌的KB液体培养基的试管中，将试管置于恒温摇床上28℃、180rpm培养12～14h制成菌悬液。菌悬液加无菌水调至浓度为103CFU/mL左右。
将不同量的1号杀菌剂分别加入2mL KB液体培养基中，使其终浓度分别为0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.06μg/mL、0.05μg/mL、0.03μg/mL、0.02μg/mL和0.01μg/mL。
1号杀菌剂处理：取10μL上述菌悬液分别加入含不同浓度的1号杀菌剂的KB液体培养基中，得到7种处理；以不接种菌液的KB液体培养基为空白对照；含0.2μg/mL 1号杀菌剂的KB液体培养基作为阴性对照；2mL KB液体培养基中加入10μL上述菌悬液作为阳性对照。28℃、180rpm培养12h后测量OD600吸光值，调查最小抑制浓度。OD值与阴性对照相同的处理，其对应的1号杀菌剂浓度即为最小抑制浓度。
测定结果
如图1所示，培养12h后，0.06μg/mL 1号杀菌剂处理可见轻微浑浊，而0.1μg/mL未见浑浊。吸光值测定结果如表1所示，0.1μg/mL 1号杀菌剂处理的OD600吸光值显著低于0.06μg/mL及更小浓度药剂处理和阳性对照，与空白对照和阴性对照差异不显著，表明1号杀菌剂对黄瓜角斑病菌的离体最小抑制浓度为0.1μg/mL。
表1
注：1,KB液体培养基；2,含0.2μg/mL 1号杀菌剂的KB液体培养基；3，向KB液体培养基中加入1号杀菌剂配成不同终浓度的稀释液，再加入10μL浓度为103CFU/mL的黄瓜角斑病菌Psl8菌悬液；4，2mL KB液体培养基中加入10μL浓度为103CFU/mL的黄瓜角斑病菌Psl8菌悬液；5，不同字母表示组间差异性显著。
实施例2.不同种子处理剂对黄瓜角斑病菌的室内防效测定
1.黄瓜种子接种黄瓜角斑病菌
用灭菌10μl枪头在超净工作台中挑取KB培养基上生长到对数期(28℃培养48h)的黄瓜角斑病菌Psl8菌株单菌落，接种于装有灭菌的KB液体培养基的试管中，将试管置于恒温摇床上28℃、180rpm培养12～14h制成菌悬液。菌悬液接种浓度为108CFU/mL左右。每个处理接种10粒种子，共120粒种子在50mL菌悬液中浸泡1h。浸泡后将种子在无菌水中冲洗3次，晾干待用。
2.不同种子处理剂对黄瓜种子进行处理
配制种子处理剂
1号杀菌剂：1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油，加水分别稀释100倍、200倍和500倍液待用，浓度分别为2.0×104μg/mL，1.0×104μg/mL和0.4×104μg/mL。
甲醛稀释100倍、300倍和700倍液待用，浓度分别为4.7μg/mL，1.57μg/mL和0.67μg/mL。
将72％硫酸链霉素SP稀释成500倍、700倍和1000倍液待用，浓度分别为144μg/mL，50.4μg/mL和72μg/mL。
盐酸溶液稀释成1％(g/g)和8％(g/g)待用。
种子处理
将步骤1晾干的种子分别在以上不同种子处理剂中浸泡。在1号杀菌剂100倍、200倍和500倍液中浸泡1h；在72％硫酸链霉素500倍、700倍和1000倍液中浸泡1h；在甲醛100倍、300倍和700倍液中浸泡5min；在盐酸1％和8％中浸泡3min；以无菌水浸泡种子1h作为对照组。共12种处理，每种处理使用步骤1制备的10粒带菌种子。
浸泡后使用无菌水冲洗3次，晾干后待用。
3.病害调查
将处理晾干后的种子播种入苗盆中，在光照培养箱中培养，光周期16h，光照强度4000lx，温度28℃-16℃，相对湿度90％。出苗14d后，参照已知文献Wang,T.,Guan,W.,Huang,Q.,Yang,Y.,Yan,W.,Sun,B.and Zhao,T.(2016)Quorum-sensing contributes tovirulence,twitching motility,seed attachment and biofilm formation in thewild type strain Aac-5of Acidovorax citrulli.Microb.Pathog.100,133–140.中所记载的方法，调查病情指数，重复三次。
病情指数分级：
病情严重度分为5级，标准如下：
0级------------------------无明显发病症状；
1级------------------------大约25％的叶片面积坏死病变；
3级------------------------大约50％的叶片面积坏死病变；
5级------------------------大约75％的叶片面积坏死病变；
7级------------------------整株幼苗死亡。
病情指数计算公式：
病情指数＝∑(A×B)×100/∑B×7
其中A代表发病等级(0、1、3、5、7)；B代表每一级植物叶片的数量。实验重复三次。
4.统计分析
采用Excel 2013对实验数据进行初步处理和图表制作，同时采用SPSS20进行数据分析，按单因素3重复完全随机设计LSD法进行统计分析和多重比较。
5.实验结果
如表2和图2所示，播种7天后，对照组(CK)处理病情指数最高，达到88.57。各药剂处理中，1号杀菌剂100倍液处理后的黄瓜小苗病情指数最低，防效达到80.65％；1号杀菌剂200倍液处理后的黄瓜小苗病情指数为45.16％，均显著高于72％硫酸链霉素、甲醛和盐酸的各浓度处理。甲醛100倍液和8％盐酸表现出明显药害(表2)。
表2.不同种子处理剂对黄瓜角斑病菌的室内防效

Claims (4)

1.防治黄瓜细菌性角斑病的方法，其特征在于，使用1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油浸泡黄瓜种子。
2.根据权利要求1所述的防治黄瓜细菌性角斑病的方法，其特征在于，所述1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油的稀释倍数为100-200倍。
3.根据权利要求1所述的防治黄瓜细菌性角斑病的方法，其特征在于，所述1％异噻唑啉酮·2％二硫氰甲烷乳油的稀释倍数为100倍。
4.根据权利要求1所述的防治黄瓜细菌性角斑病的方法，其特征在于，所述浸泡时间为1小时。
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