CN109444241A - 一种多巴胺检测方法、检测电极及制备方法、电化学传感器 - Google Patents

一种多巴胺检测方法、检测电极及制备方法、电化学传感器 Download PDF

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Abstract

根据多巴胺分子的特点，多巴胺分子同时具有邻二酚羟基和脂肪伯胺两种特征基团，本发明设计两种功能分子分别特定性的识别多巴胺上的邻二酚羟基和脂肪伯胺基团，可显著地提高多巴胺电化学传感器的选择性。发明一种基于双分子识别的多巴胺电化学传感技术，打破传统的无或单一识别策略，无疑是多巴胺传感器设计重的突破；并且该双分子识别可于一个液滴内完成，大大降低了所需多巴胺样品的容量，可以实现微量体积内多巴胺的高灵敏检测，具有相当重要的现实意义和应用前景。

Description

一种多巴胺检测方法、检测电极及制备方法、电化学传感器
技术领域
本发明涉及一种多巴胺的检测方法，具体涉及一种基于双分子识别的多巴胺检测方法、检测电极及其制备方法、多巴胺检测电化学传感器；属于生物检测技术领域。
背景技术
多巴胺是活体中枢神经系统中重要的神经递质，在调节脑功能过程中起着关键作用，它的失调与多种脑神经退行有关。神经系统疾病如抑郁症,精神分裂症,帕金森病等与多巴胺水平的异常密切相关。因此，通过测量多巴胺在活体脑内的动态变化在技术上为深入了解多巴胺在正常和异常脑功能中的作用具有重要意义。
检测活体脑内多巴胺的水平有两种方式，一种是定位植入微电极通过快速循环伏安法监测，另一种方法是利用微透析活体取样技术从目标脑区取样，再检测样品中的多巴胺。这两种方法是补缀的，各具有优势。微透析活体取样技术是目前最常用的活体脑内采样方法，具有对活体微损伤、实时在体取样的优点。然而，活体脑容量较小，所采集的样品体积较小，通常低至微升级。脑区中具有干扰性的电活性小分子众多，且多巴胺的含量低至纳摩尔每升，要测定微量样品中的多巴胺水平无疑给分析方法带来了巨大的挑战。
目前已经发展起来的检测多巴胺的方法很多，如荧光分析方法，紫外可见分析方法，高效液体色谱与毛细管色谱分析方法等。然而这些检测方法均存在一定的劣势，如要求样品体积过大，要求检测仪器精密、投入过大等。电化学传感技术具有可设计性强，灵敏度高，成本较低等多种优点，是检测多巴胺的经典分析方法。然而目前的电化学传感器均采用无识别单元或单个识别单元策略构筑，易受到脑区其他活性物质如高浓度的抗坏血酸、二羟基苯乙酸和高香草酸等的干扰，这些因素严重制约了其在含低浓度多巴胺的脑样品检测中的应用；同时，由于活体脑样品的体积极小，低至μL级，且多巴胺在脑内的浓度低至nM级，稀释使一般的传感器达不到灵敏检测的要求。
发明内容
针对现有技术中，脑内多巴胺检测易到受到多种电活性干扰物质的干扰，本发明解决传感器检测多巴胺的选择性问题。由于活体脑样品的体积极小，低至μL级，且多巴胺在脑内的浓度低至nM级，稀释使一般的传感器达不到灵敏检测的要求，本发明解决传感器检测μL级容量样品的问题。针对目前电化学传感器检测多巴胺存在选择性不良，灵敏度不高，且所需样品容量较大等问题，本发明提出一种检测多巴胺的方案，并设计了一种高灵敏高选择性的检测多巴胺的电极和电化学生物传感器，可实现微升级生物样品中的多巴胺检测。进一步的应用研究表明，该电化学传感器能够对脑内多巴胺水平的动态变化实现离线监测。
根据多巴胺分子的特点，多巴胺分子同时具有邻二酚羟基和脂肪伯胺两种特征基团，本发明设计两种功能分子分别特定性的识别多巴胺上的邻二酚羟基和脂肪伯胺基团，可显著地提高多巴胺电化学传感器的选择性。因此，发明一种基于双分子识别的多巴胺电化学传感技术，打破传统的无或单一识别策略，无疑是多巴胺传感器设计重的突破；并且该双分子识别可于一个液滴内完成，大大降低了所需多巴胺样品的容量，可以实现微量体积内多巴胺的高灵敏检测，具有相当重要的现实意义和应用前景。
本发明的第一个目的，提供一种基于双分子识别的多巴胺检测方法。利用多巴胺分子中两个特定的基团，采用两种功能性分子分别对其进行识别，提高多巴胺检测的选择性，从而排除干扰，保证多巴胺检测的准确性。
本发明的第二个目的，提供一种基于双分子识别的多巴胺检测电极。利用本发明双分子识别的原理，研究出一种检测电极，该双分子识别于一个液滴内完成，大大降低了所需多巴胺样品的容量，可以实现微量体积内多巴胺的高灵敏检测。
本发明的第三个目的，提供一种基于双分子识别的多巴胺检测电极的制备方法。制备获得能够实现双分子识别的多巴胺检测电极。
本发明的第四个目的，提供一种基于双分子识别的多巴胺电化学传感器，该传感器利用本发明制备的基于双分子识别的多巴胺检测电极，用于检测多巴胺。
本发明的第五个目的，提供一种多巴胺的检测方法，采用本发明提供的基于双分子识别的多巴胺电化学传感器监测多巴胺的方法。
根据本发明提供的第一种实施方案，提供一种基于双分子识别的多巴胺检测方法。
一种基于双分子识别的多巴胺检测方法，该多巴胺检测方法为：以(N-羟基丁二酰亚胺酯)识别多巴胺上的脂肪伯胺基，以硼酸基识别多巴胺上的邻二酚羟基，然后利用含有硼酸基物质的可逆性电化学行为，检测含有硼酸基物质的电化学信号，从而检测出多巴胺的浓度或含量。
作为优选，所述(N-羟基丁二酰亚胺酯)来源于3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)。
作为优选，所述硼酸基来源于二茂铁硼酸和/或1,1-二硼酸二茂铁。
根据本发明提供的第二种实施方案，提供一种基于双分子识别的多巴胺检测电极。
一种基于双分子识别的多巴胺检测电极，该多巴胺检测电极为：将含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质键合在基础电极上，然后利用多巴胺上的脂肪伯胺基与(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的键合作用将多巴胺键合在含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质上，再利用多巴胺上的邻二酚羟基与硼酸基的键合作用将含有硼酸基的物质键合在多巴胺上，得到的即为基于双分子识别的多巴胺检测电极。
作为优选，所述基础电极为金电极或碳电极。
作为优选，所述电极为沉积纳米金的丝网印刷电极。
作为优选，所述含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质为3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)。
作为优选，所述含有硼酸基的物质为二茂铁硼酸和/或1,1-二硼酸二茂铁。
根据本发明提供的第三种实施方案，提供一种基于双分子识别的多巴胺检测电极的制备方法。
一种基于双分子识别的多巴胺检测电极的制备方法或制备第二种实施方案中所述多巴胺检测电极的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将丝网印刷电极SC浸泡在金离子溶液中，通过还原，在丝网印刷电极上沉积纳米金，得到的电极标记为SC/Au；
(2)将步骤(1)获得的SC/Au电极浸泡在含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质中，反应一段时间，清洗，使得含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质键合在SC/Au电极上，得到的电极标记为SC/Au/DSP；
(3)将含有多巴胺的人工脑脊液滴加在步骤(2)制得的SC/Au/DSP电极上，反应一段时间，清洗，通过多巴胺上的脂肪伯胺基与(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的键合作用，将多巴胺键合在含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质上，得到的电极标记为SC/Au/DSP/DA；
(4)将步骤(3)得到的SC/Au/DSP/DA电极浸泡在含有硼酸基的物质中，反应一段时间，清洗，通过多巴胺上的邻二酚羟基与硼酸基的键合作用，将含有硼酸基的物质键合在多巴胺上，得到的电极标记为SC/Au/DSP/DA/FBA，该电极即为基于双分子识别的多巴胺检测电极。
作为优选，步骤(1)中所述金离子溶液为氯金酸溶液。优选为含有氯金酸的硫酸溶液。
作为优选，步骤(1)中所述还原采用的是物质还原法或恒压电位沉积法。
作为优选，步骤(2)中所述含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质为3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)。
作为优选，步骤(2)中含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质的浓度为0.1-20mM，优选为0.5-10mM，更优选为1-5mM。
作为优选，步骤(2)中反应的温度为1-20℃，优选为2-10℃，更优选为3-8℃。
作为优选，步骤(2)中浸泡时间为1-48h，优选为2-24h，更优选为4-12h。
作为优选，步骤(2)中所述清洗采用蒸馏水清洗。
作为优选，步骤(3)中所述反应为在黑暗环境下反应。
作为优选，步骤(3)中反应时间为0.5-24h，优选为1-12h，更优选为2-8h。
作为优选，步骤(3)中所述清洗采用蒸馏水清洗。
作为优选，步骤(4)中所述含有硼酸基的物质为二茂铁硼酸和/或1,1-二硼酸二茂铁。
作为优选，步骤(4)中所述含有硼酸基的物质优选为二茂铁硼酸和/或1,1-二硼酸二茂铁的磷酸缓冲溶液。
作为优选，步骤(4)中所述含有硼酸基的物质的浓度为0.1-20mM，优选为0.5-10mM，更优选为1-5mM。
作为优选，步骤(4)中浸泡时间为0.5-24h，优选为1-12h，更优选为2-8h。
作为优选，步骤(4)中所述清洗采用蒸馏水清洗。
根据本发明提供的第四种实施方案，提供一种基于双分子识别的多巴胺电化学传感器。
一种基于双分子识别的多巴胺电化学传感器，该电化学传感器包括第二种实施方案中所述的多巴胺检测电极或根据地三种实施方案中所述方法制备的多巴胺检测电极。
根据本发明提供的第五种实施方案，提供一种多巴胺的检测方法。
一种多巴胺的检测方法，将第四种实施方案中所述的多巴胺电化学传感器置于溶液中，采用差示脉冲伏安法扫描，读取含有硼酸基物质的电信号；含有硼酸基物质的电还原峰的强度与多巴胺的浓度或含量成正比。
作为优选，所述溶液为磷酸缓冲溶液。
作为优选，所述采用差示脉冲伏安法扫描的参数为：电位从0.8至-0.2V，优选为0.6至-0.1V，更优选为0.42至-0.07V。电势阶跃为1-10mV，优选为2-8mV，更优选为3-6mV。脉冲宽度为0.01-0.2s，优选为0.02-0.1s，更优选为0.03-0.8s。脉冲周期为0.05-1s，优选为0.1-0.8s，更优选为0.15-0.5s。脉冲幅度5-50mV，优选为10-40mV，更优选为15-30mV。
作为优选，该检测方法用于检测活体受钾离子和/或诺米芬辛药物刺激下获得的多巴胺的浓度或含量。
在本发明中，步骤(1)中含有氯金酸的硫酸溶液中，氯金酸的摩尔浓度为5-50mM，优选为10-40mM，更优选为15-30mM，例如20mM。含有氯金酸的硫酸溶液中，硫酸的摩尔浓度为0.1-2M，优选为0.2-1.5M，更优选为0.3-1M，例如0.5M。
在本发明中，步骤(1)中可以采用电还原法将金离子溶液(例如氯金酸溶液)中的金离子还原成金纳米粒子，金纳米粒子沉积(或覆盖或负载)在碳电极(玻碳电极或丝网印刷电极)上。所述电还原法为恒压电位沉积法。恒压电位沉积法中：工作电位为-0.1至-1V，优选为-0.15至-0.5V，更优选为-0.2至-0.4V，例如-0.2V。工作时间为30-300s，优选为60-250s，更优选为90-200s，例如150s。
在本发明中，步骤(3)中，在步骤(2)制得的SC/Au/DSP电极上滴加含有多巴胺的人工脑脊液的量为5-60μL，优选为5.5-40μL，更优选为6-20μL，进一步优选为6.5-10μL；例如7μL，9μL。
在本发明中，步骤(4)中含有硼酸基的物质优选为二茂铁硼酸和/或1,1-二硼酸二茂铁的磷酸缓冲溶液。作为优选，含有硼酸基的物质的浓度为0.1-20mM，优选为0.5-10mM，更优选为1-5mM。磷酸缓冲溶液的浓度为0.01-1M，优选为0.05-0.8M，更优选为0.08-0.5M，例如0.1M。磷酸缓冲溶液的pH值为7.0-8.5，优选为7.1-8.0，更优选为7.2-7.8，例如7.4。
在本发明中，利用多巴胺分子同时具有邻二酚羟基和脂肪伯胺两种特征基团，以此设计两种功能分子分别识别多巴胺。本发明利用的两个分子是二硫代二丙酸(N-羟基丁二酰亚胺酯)和二茂铁硼酸，本质是利用N-羟基丁二酰亚胺酯识别脂肪伯胺基形成酰胺键，硼酸基团识别邻二酚羟基形成硼酸酯，达到双分子识别的效果。因此，本专利也通用于含N-羟基丁二酰亚胺酯的分子和硼酸基团的分子分别与多巴胺作用，发生双识别过程。(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团与多巴胺上的胺基键合形成酰胺键。硼酸基和邻二酚羟基键合形成硼酸酯。
目前的电化学传感器均采用无识别单元或单个识别单元策略构筑，该方法易受到脑区其他活性物质如高浓度的抗坏血酸、二羟基苯乙酸和高香草酸等的干扰，这些因素严重制约了生物样品中多巴胺检测的应用。多巴胺分子同时具有邻二酚羟基和脂肪伯胺两种特征基团，以此设计两种功能分子分别识别多巴胺，可显著地提高多巴胺电化学传感器的选择性。
一般的脑源生物样品容量较小，且从活体脑内取得样本越小越有利于活体损伤后的恢复，从而使取样风险降至最低。目前的电化学传感技术检测多巴胺均在含多巴胺样品的溶液中直接检测，所需的容量较大，不适用于小容量脑样品的分析。更重要的是多巴胺在脑内的浓度较低，稀释样品获取更大的体积导致大部分电化学传感器达不到如此低的检测限。本发明将多巴胺分子在电极上实现液滴识别，可显著降低多巴胺样品的容量，本发明设计的传感器可将多巴胺样品容量降低至微升级别。
在本发明中，选用的的基础电极为金电极或者沉积纳米金的丝网印刷电极(碳电极)，然后将含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质键合在基础电极上，通过该(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团与脂肪伯胺基的键合作用，实现第一次对多巴胺的识别。多巴胺通过脂肪伯胺基与(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的键合作用，将多巴胺键合(固定)在含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质，从而实现将多巴胺固定在电极上。然后利用多巴胺上的邻二酚羟基与硼酸基的键合作用，将含有硼酸基的物质键合在多巴胺上，通过硼酸基实现第二次对多巴胺的识别。将含有硼酸基的物质键合在多巴胺上，从而实现将含有硼酸基的物质固定在电极上，获得基于双分子识别的多巴胺检测电极。总之，首先将多巴胺分子通过DSP第一次识别键合到电极表面，再通过FBA的第二次识别键合到电极表面，同时输出信号。DSP和FBA的识别都是针对多巴胺上特定的基团，实现对多巴胺的双分子识别目的和效果。
在本发明的优选方案中，含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质为3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)，含有硼酸基的物质为二茂铁硼酸。首先在碳电极(玻碳电极或丝网印刷电极)上沉积一层纳米金，然后通过金-硫键将3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)键合在电极上。然后利用多巴胺上的特性基团——脂肪伯胺基，与3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)中的(N-羟基丁二酰亚胺酯)的第一次特征识别，将多巴胺键合在电极上。再利用多巴胺上的特性基团——邻二酚羟基，与二茂铁硼酸中的硼酸基的第二次特征识别，将二茂铁硼酸键合在电极上，获得基于双分子识别的多巴胺检测电极。然后利用二茂铁具有可逆性的稳定的电化学行为，可以输出电化学信号，从而实现对多巴胺的检测。
在本发明中，双分子识别为采用两种具有特定结构的分子对多巴胺上两个特性的基团进行识别。由于相对于脑体中的其他物质，多巴胺分子上的脂肪伯胺基和邻二酚羟基为两个特征基团，通过(N-羟基丁二酰亚胺酯)对多巴胺上的脂肪伯胺基的识别、硼酸基对多巴胺上的邻二酚羟基的识别，实现双分子识别检测多巴胺，双重选择和筛选，从而高效的排除其他活性物质的干扰，实现高选择性的检测多巴胺。
在本发明的优选方案中，二茂铁硼酸不仅与多巴胺中和邻二酚羟基形成硼酸酯结构，而且二茂铁具有可逆性的稳定的电化学行为，可以输出电化学信号。具体步骤如下：
将上述本发明制备的电化学传感器置于磷酸缓冲溶液中，采用差示脉冲伏安法扫描，读出电信号。于170mV处出现二茂铁的电还原峰，并且该峰电流强度会随着多巴胺浓度的增大显著增强。
在本发明中，通过选择含有硼酸基物质，其中硼酸基与多巴胺上的邻二酚羟基键合，含有硼酸基物质还含有可以表现出电化学行为的基团，通过检测含有硼酸基物质中可以变现电化学性质基团的电化学信号，可以准确的检测出多巴胺的浓度、含量及其变化情况。本发明制备的电极或传感器灵敏度极高，可以检测出脑脊液中浓度为纳摩尔级别的多巴胺的含量。同时，本发明的方案通过将多巴胺滴加在电极上，克服了现有技术中需要在多巴胺液体中检测的问题，本发明只需要滴加一滴或几滴(实验过程中1滴就足以检测出多巴胺的浓度和含量)含有多巴胺的脑脊液在制备的电极上，因此所需样品容量极小，样品所需量低至微升(μL)级。
本发明利用不同的分子分别在常温(或低温)下与多巴胺上的脂肪伯胺基和邻二酚羟基键合，以此为基础来构建双分子识别的多巴胺电化学传感器。采用N-羟基丁二酰亚胺酯识别脂肪伯胺基形成酰胺键，硼酸基团识别邻二酚羟基形成硼酸酯，达到双分子识别的效果。N-羟基丁二酰亚胺酯与多巴胺上的脂肪伯胺键合，可实现液滴识别，使多巴胺样品容量降低至微升级别。
在本发明中，含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质只要满足该物质的分子结构中包含“(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团”和“硫”原子即可，也就是只要含有硫原子和(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质就可以用于本发明检测多巴胺的方法，也可以用于本发明提出的基于双分子识别的多巴胺检测电极。“硫”原子用于与金纳米粒子通过金-硫键使得含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质负载在电极上。“(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团”用于与多巴胺中的脂肪伯胺基键合，将多巴胺负载在电极上。
在本发明中，含有硼酸基的物质只要满足该物质的分子结构中包含“硼酸基”和具有可逆性稳定电化学行为的基团即可，也就是说，只要含有“硼酸基”和具有可逆性稳定电化学行为的基团的物质可以用于本发明检测多巴胺的方法，也可以用于本发明提出的基于双分子识别的多巴胺检测电极。“硼酸基”用于与多巴胺上的邻二酚羟基键合，将含有硼酸基物质负载在电极上。具有可逆性稳定电化学行为的基团用于通过差示脉冲伏安法检测其电化学信号(电还原峰)。通过检测具有可逆性稳定电化学行为的基团的电化学信号的强弱，即可得知含有硼酸基的物质的含量，而含有硼酸基的物质与多巴胺定量结合，从而可以得出多巴胺的含量或浓度。具有可逆性稳定电化学行为的基团可以是“二茂铁”基团。
在本发明中，利用微透析活体取样系统，将活体脑透析样品取出，具体步骤如下：微量蠕动泵装载两根气密性注射器A和B，A注射器传递空白人工脑脊液，通过八通阀进入植入活体脑内的微透析探针。活体脑内的小分子发生自由扩散，通过探针上的半透膜进入探针内侧的空白人工脑脊液。随着探针内侧空白人工脑脊液的流动，小分子不断扩散入内，用样品收集器收集得到脑微透析液。收集样品参数，流速2μL/min，单个时间4min，单个样品容量8μL。B注射器传递含K+(60mM)和诺米芬辛药物(10μM)，通过八通阀上装载的样品定量环(60μL)进入活体探针，从而扩散入活体脑内。每一只大鼠给予的刺激顺序为60mM K+，60mMK+，10μM诺米芬辛药物，每次刺激间隔时间90min以给予大鼠足够的恢复时间，避免两个刺激之间的交叉干扰。
在本发明中，将本发明制备的所述多巴胺电化学传感器应用于活体受钾离子(优选为高浓度钾离子)和诺米芬辛药物刺激下的多巴胺水平变化中的检测。
将收集的多巴胺样品分别按本发明制备多巴胺检测电极的方法，滴涂于电极上，制备获得多巴胺传感器，按照本发明检测多巴胺的方法读出电化学信号。大鼠正常状态下，多巴胺的水平大约为8-12nM，而60mM K+反透析刺激使多巴胺的水平大约上升至基底水平的4-6倍，10μM诺米芬辛药物反透析刺激使多巴胺的水平大约上升至基底水平的8-10倍。
本发明的实施例主要描述了所述传感器对脑区微透析样品中多巴胺的检测，也通用于一般生物样品中多巴胺的检测。
本发明一种具体制备基于双分子识别的多巴胺检测电极的方法，由3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DSP)和二茂铁硼酸(FBA)分别识别多巴胺上的脂肪伯胺基和邻二酚羟基。以此为基础构建多巴胺检测电极(电化学传感器)，具体包括以下步骤：
(1)将丝网印刷电极(SC)在含氯金酸(20mM)的硫酸(0.5M)溶液中恒电位沉积金离子为金纳米粒子，工作电位-0.2V，工作时间150s，所得电极标记为SC/Au；
(2)将步骤(1)中制备的电极在3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DSP，2mM)的溶液中于4℃下浸泡8小时，用蒸馏水彻底清洗；3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)通过金-硫键与丝网印刷电极上的金纳米粒子键合，所得电极标记为SC/Au/DSP；
(3)将含7μL多巴胺的人工脑脊液滴涂至步骤(2)中制备的电极上，该液滴在黑暗处反应4小时，用蒸馏水彻底清洗；多巴胺上的脂肪伯胺基与3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)中的(N-羟基丁二酰亚胺酯)键合，所得电极标记为SC/Au/DSP/DA；
(4)将步骤(3)中制备的电极在二茂铁硼酸(FBA，2mM)的磷酸缓冲溶液(0.1M，pH7.4)中浸泡3小时，用蒸馏水彻底清洗；二茂铁硼酸与多巴胺上的邻二酚羟基键合，所得电极标记为SC/Au/DSP/DA/FBA。
与现有技术相比较，本发明的技术方案具有以下有益技术效果：
本发明采用(N-羟基丁二酰亚胺酯)和硼酸基分别识别多巴胺上的脂肪伯胺基和邻二酚羟基的原理，以此为基础构建双分子识别的多巴胺电极和多巴胺电化学传感器。该传感器随着多巴胺浓度的增加出现显著的电信号增强现象，而且该传感器对多巴胺的检测具有明显的高选择性响应，能够实现多巴胺高灵敏度检测的效果。相比于现在的一些技术，本发明中的多巴胺电化学传感器对微升级容量样品中的低至纳摩尔浓度级的多巴胺实现准确检出，且该传感器装置轻便且小茂，适合于随处携带和实际临床应用。尤其是对容量较小的临床生物样品中的多巴胺检测具有良好的应用前景和极其重大的价值。
附图说明
图1为制备的传感器的光电子能谱表征：Au4f7/2和Au4f5/2。附图中：各电极分别为(a)SC，(b)SC/Au，(c)SC/Au/DSP，(d)SC/Au/DSP/DA和(e)SC/Au/DSP/DA/FcBA。
图2为制备的传感器的光电子能谱表征：S2s和S2p。附图中：各电极分别为(a)SC，(b)SC/Au，(c)SC/Au/DSP，(d)SC/Au/DSP/DA和(e)SC/Au/DSP/DA/FcBA。
图3为制备的传感器的光电子能谱表征：N1s。附图中：各电极分别为(a)SC，(b)SC/Au，(c)SC/Au/DSP，(d)SC/Au/DSP/DA和(e)SC/Au/DSP/DA/FcBA。
图4为制备的传感器的光电子能谱表征：Fe2p3/2和Fe2p1/2。附图中：各电极分别为(a)SC，(b)SC/Au，(c)SC/Au/DSP，(d)SC/Au/DSP/DA和(e)SC/Au/DSP/DA/FcBA。
图5为电沉积金的表面扫描电子微显微图。
图6为不同的电极在磷酸缓冲溶液(pH 7.4)中扫描得到的差示脉冲伏安图。附图中：(a)SC/DSP/DA/FcBA，(b)SC/Au/DA/FcBA，(c)SC/Au/DSP/aCSF/FcBA，(d)SC/Au/DSP/DA，(e)SC/Au/DSP/DA/FcBA。
图7为所述的电化学传感器检测系列不同浓度的多巴胺在磷酸缓冲溶液中扫描得到的差示脉冲伏安图。附图中：a至k分别为1,2,4,6,8,10,20,40,60,80,100nM。
图8为各种生物活性干扰物质对所述的电化学传感器的峰电流密度数据图。附图中：各干扰物质分别为(b)空白人工脑脊液；(c)5-羟基吲哚乙酸(2μM)；(d)高香草酸(2μM)；(e)二羟基苯乙酸(2μM)；(f)去甲肾上腺素(5nM)；(g)5-羟色胺(5nM)；(h)3-甲氧基多巴胺(20nM)；(i)酪氨酸(20nM)；(j)肾上腺素(20nM)；(k)色氨酸(50nM)；(l)酪胺(50nM)；(m)尿酸(20μM)；(n)抗坏血酸(0.1mM)；(o)葡萄糖(5mM)；(p)乳酸(5mM)。其中(a)为40nM多巴胺的电流密度响应。
图9为各种生物活性干扰物质和多巴胺混合溶液对所述的电化学传感器的峰电流密度数据图。附图中：各干扰物质分别为(b)5-羟基吲哚乙酸(2μM)；(c)高香草酸(2μM)；(d)二羟基苯乙酸(2μM)；(e)去甲肾上腺素(5nM)；(f)5-羟色胺(5nM)；(g)3-甲氧基多巴胺(20nM)；(h)酪氨酸(20nM)；(i)肾上腺素(20nM)；(j)色氨酸(50nM)；(k)酪胺(50nM)；(l)尿酸(20μM)；(m)抗坏血酸(0.1mM)；(n)葡萄糖(5mM)；(o)乳酸(5mM)。其中(a)为40nM纯多巴胺的电流密度响应。
图10为所述的电化学传感器检测大鼠微透析液中多巴胺在磷酸缓冲溶液中扫描得到的部分差示脉冲伏安图。附图中：其中分别在136min，256min和381min对大鼠实施60mMK+，60mM K+，10μM诺米芬辛药物的反透析刺激。
图11为所述的电化学传感器检测大鼠微透析液中多巴胺水平(多巴胺浓度或含量)随时间变化的图。
具体实施方式
以下就本发明的技术方案举例说明，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例内容。
实施例1
一种基于双分子识别的多巴胺检测方法，该多巴胺检测方法为：以(N-羟基丁二酰亚胺酯)识别多巴胺上的脂肪伯胺基，以硼酸基识别多巴胺上的邻二酚羟基，然后利用含有硼酸基物质的可逆性电化学行为，检测含有硼酸基物质的电化学信号，从而检测出多巴胺的浓度或含量。
实施例2
重复实施例1，只是所述(N-羟基丁二酰亚胺酯)来源于3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)。所述硼酸基来源于二茂铁硼酸。
实施例3
重复实施例2，只是所述硼酸基来源于1,1-二硼酸二茂铁。
实施例4
一种基于双分子识别的多巴胺检测电极，该多巴胺检测电极为：将3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)键合在沉积纳米金的丝网印刷电极上，然后利用多巴胺上的脂肪伯胺基与(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的键合作用将多巴胺键合在3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)上，再利用多巴胺上的邻二酚羟基与硼酸基的键合作用将二茂铁硼酸键合在多巴胺上，得到的即为基于双分子识别的多巴胺检测电极。
实施例5
一种基于双分子识别的多巴胺检测电极的制备方法或制备第二种实施方案中所述多巴胺检测电极的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将丝网印刷电极SC浸泡在氯金酸(20mM)的硫酸(0.5M)溶液中，通过恒压电位沉积法还原，工作电位-0.2V，工作时间150s；在丝网印刷电极上沉积纳米金，得到的电极标记为SC/Au；
(2)将步骤(1)获得的SC/Au电极浸泡在含有3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(DSP，2mM)中，于4℃下浸泡8小时，用蒸馏水彻底清洗，使得3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)与金纳米粒子通过金-硫键键合在SC/Au电极上，得到的电极标记为SC/Au/DSP；
(3)将含有7μL多巴胺的人工脑脊液滴加在步骤(2)制得的SC/Au/DSP电极上，在黑暗环境下反应4h，用蒸馏水彻底清洗，通过多巴胺上的脂肪伯胺基与(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的键合作用，将多巴胺键合在含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质上，得到的电极标记为SC/Au/DSP/DA；
(4)将步骤(3)得到的SC/Au/DSP/DA电极浸泡在二茂铁硼酸(FBA，2mM)的磷酸缓冲溶液(0.1M，pH 7.4)中，浸泡3小时，用蒸馏水彻底清洗，通过多巴胺上的邻二酚羟基与硼酸基的键合作用，将二茂铁硼酸键合在多巴胺上，得到的电极标记为SC/Au/DSP/DA/FBA，该电极即为基于双分子识别的多巴胺检测电极。
实施例6
重复实施例5，只是步骤(4)中的二茂铁硼酸用1,1-二硼酸二茂铁的磷酸缓冲溶液替代。
实施例7
重复实施例5，只是步骤(2)中含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质的浓度为5mM，步骤(2)中反应的温度为8℃，步骤(2)中浸泡时间为12h。步骤(3)中反应时间为8h。步骤(4)中所述含有硼酸基的物质的浓度为5mM，步骤(4)中浸泡时间为6h。
实施例7
重复实施例5，只是步骤(1)中含有氯金酸的硫酸溶液中，氯金酸的摩尔浓度为35mM，硫酸的摩尔浓度为1M。恒压电位沉积法中：工作电位为-0.4V。工作时间为200s。
实施例8
重复实施例5，只是步骤(3)中，在步骤(2)制得的SC/Au/DSP电极上滴加含有多巴胺的人工脑脊液的量为9μL。
实施例9
重复实施例6，只是步骤(4)中1,1-二硼酸二茂铁的磷酸缓冲溶液中，1,1-二硼酸二茂铁的浓度为5mM。磷酸缓冲溶液的浓度为0.3M。磷酸缓冲溶液的pH值为7.8。
应用实施例1
将按实施例5制备的电极分别用X光电子能谱表征各元素在电极表面的键合。如图1，2，3，4中的a曲线所示，裸丝网印刷电极上没有任何金的特征峰；如b曲线所示，而电沉积金后出现分别于84.1eV和87.8eV两处出现信号峰，分别对应Au4f7/2和Au4f5/2的XPS能谱，这说明金成功地被沉积到丝网印刷电极表面。同时，电沉积金后出现于169.0eV出现S2p特征峰，这主要是因为电沉积金所采用的溶液是硫酸，电沉积金中存在残留的硫酸根。如曲线c所示，在金表面进一步键合3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)，于162.5eV处出现S2s特征峰对应金硫键官能团，401.25eV处出现N1s特征峰，这说明3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)通过金-硫键修饰于电极表面。如曲线d所示，进一步修饰多巴胺和二茂铁硼酸于708.8和720.6eV处出现Fe2p3/2和Fe2p1/2特征峰，说明二茂铁硼酸成功修饰至电极表面。
应用实施例2
将金通过电沉积至丝网印刷电极表面后，通过扫描电化学显微镜观察金的形貌。如图5所示，金以树枝状覆盖于丝网印刷电极表面，为3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)的键合提高更大的金比表面积。
应用实施例3
实验步骤由逐步化学反应策略制备，依次为(a)SC电极，(b)SC/Au电极，(c)SC/Au/DSP电极，(d)SC/Au/DSP/DA电极和(e)SC/Au/DSP/DA/FBA电极。将上述电极分别置于磷酸缓冲溶液(pH 7.4)中进行差示脉冲伏安扫描如图6。多巴胺浓度40nM。扫描参数：电位从0.42至-0.07V，电势阶跃4mV，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.2s，脉冲幅度20mV。很明显，在多巴胺的存在下，于170mV处出现二茂铁的电还原峰，这说明所制备的传感器对多巴胺具有良好的电流响应。
配置系列浓度的多巴胺溶液，1,2,4,6,8,10,20,40,60,80,100nM，分别如实施例5制备电化学传感器并置于磷酸缓冲溶液(pH 7.4)中进行差示脉冲伏安扫描如图7。170mV处的峰电流密度随着多巴胺浓度的升高呈现线性增长。因此，所述电化学传感器的峰电流密度可以用于多巴胺浓度的定量计算，电还原峰与多巴胺的浓度成正比。
应用实施例4
配置系列干扰物质，空白人工脑脊液，5-羟基吲哚乙酸(2μM)，高香草酸(2μM)，二羟基苯乙酸(2μM)，去甲肾上腺素(5nM)，5-羟色胺(5nM)，3-甲氧基多巴胺(20nM)，酪氨酸(20nM)，肾上腺素(20nM)，色氨酸(50nM)，酪胺(50nM)，尿酸(20μM)，抗坏血酸(0.1mM)，葡萄糖(5mM)，乳酸(5mM)。分别如实施例5制备电化学传感器并置于磷酸缓冲溶液(pH 7.4)中进行差示脉冲伏安扫描，得到峰电流密度如图8所示。与40nM多巴胺溶液制备的电化学传感器对比，上述干扰物质所得到的峰电流密度均较小，这说明该传感器对抗各种生物活性干扰物质，具有对多巴胺分析的专属性。
配置多巴胺和系列干扰物质的混合物，其中多巴胺浓度均为40nM，其他干扰物质包括5-羟基吲哚乙酸(2μM)，高香草酸(2μM)，二羟基苯乙酸(2μM)，去甲肾上腺素(5nM)，5-羟色胺(5nM)，3-甲氧基多巴胺(20nM)，酪氨酸(20nM)，肾上腺素(20nM)，色氨酸(50nM)，酪胺(50nM)，尿酸(20μM)，抗坏血酸(0.1mM)，葡萄糖(5mM)，乳酸(5mM)。分别如实施例5制备电化学传感器并置于磷酸缓冲溶液(pH 7.4)中进行差示脉冲伏安扫描，得到峰电流密度如图9所示。与40nM多巴胺溶液制备的电化学传感器对比，上述干扰物质所得到的峰电流密度均与纯多巴胺制备电化学传感器所得到的峰电流密度相当，这说明该传感器可对抗各种生物活性干扰物质对多巴胺检测的干扰。
应用实施例5
将步骤3收集的脑透析液，分别实施例5制备电化学传感器并置于磷酸缓冲溶液(pH 7.4)中进行差示脉冲伏安扫描。图10为部分差示脉冲伏安图，其中分别在136min，256min和381min对大鼠实施60mM K+，60mM K+，10μM诺米芬辛药物的反透析刺激。
在K+和诺米芬辛药物的刺激下，170mV处二茂铁的电还原峰电流密度明显增强，这说明K+和诺米芬辛药物可以刺激多巴胺在脑内的瞬时分泌，使其细胞外液多巴胺的浓度显著增加。
将上述检测的多巴胺浓度随时间作成一条曲线，如图11所示。多巴胺的基底浓度为12.03±1.08nM，第一次60mM K+刺激使多巴胺浓度上升至48.08±3.75nM，随后恢复基底水平；第二次60mM K+刺激使多巴胺浓度上升至53.49±3.04nM，随后恢复基底水平；第三次10μM诺米芬辛药物使多巴胺浓度上升至89.95±2.10nM，随后恢复基底水平。

Claims (10)

1.一种基于双分子识别的多巴胺检测方法，其特征在于：该多巴胺检测方法为：以(N-羟基丁二酰亚胺酯)识别多巴胺上的脂肪伯胺基，以硼酸基识别多巴胺上的邻二酚羟基，然后利用含有硼酸基物质的可逆性电化学行为，检测含有硼酸基物质的电化学信号，从而检测出多巴胺的浓度或含量。
2.根据权利要求1所述的多巴胺检测方法，其特征在于：所述(N-羟基丁二酰亚胺酯)来源于3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)；和/或
所述硼酸基来源于二茂铁硼酸和/或1,1-二硼酸二茂铁。
3.一种基于双分子识别的多巴胺检测电极，该多巴胺检测电极为：将含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质键合在基础电极上，然后利用多巴胺上的脂肪伯胺基与(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的键合作用将多巴胺键合在含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质上，再利用多巴胺上的邻二酚羟基与硼酸基的键合作用将含有硼酸基的物质键合在多巴胺上，得到的即为基于双分子识别的多巴胺检测电极。
4.根据权利要求3所述的多巴胺检测电极，其特征在于：所述基础电极为金电极或碳电极；作为优选，所述电极为沉积纳米金的丝网印刷电极；和/或
所述含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质为3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)；和/或
所述含有硼酸基的物质为二茂铁硼酸和/或1,1-二硼酸二茂铁。
5.一种基于双分子识别的多巴胺检测电极的制备方法或制备权利要求3或4所述多巴胺检测电极的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将丝网印刷电极SC浸泡在金离子溶液中，通过还原，在丝网印刷电极上沉积纳米金，得到的电极标记为SC/Au；
(2)将步骤(1)获得的SC/Au电极浸泡在含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质中，反应一段时间，清洗，使得含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质键合在SC/Au电极上，得到的电极标记为SC/Au/DSP；
(3)将含有多巴胺的人工脑脊液滴加在步骤(2)制得的SC/Au/DSP电极上，反应一段时间，清洗，通过多巴胺上的脂肪伯胺基与(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的键合作用，将多巴胺键合在含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质上，得到的电极标记为SC/Au/DSP/DA；
(4)将步骤(3)得到的SC/Au/DSP/DA电极浸泡在含有硼酸基的物质中，反应一段时间，清洗，通过多巴胺上的邻二酚羟基与硼酸基的键合作用，将含有硼酸基的物质键合在多巴胺上，得到的电极标记为SC/Au/DSP/DA/FBA，该电极即为基于双分子识别的多巴胺检测电极。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述金离子溶液为氯金酸溶液，优选为含有氯金酸的硫酸溶液；所述还原采用的是物质还原法或恒压电位沉积法；和/或
步骤(2)中所述含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质为3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)；作为优选，含有(N-羟基丁二酰亚胺酯)基团的物质的浓度为0.1-20mM，优选为0.5-10mM，更优选为1-5mM；反应的温度为1-20℃，优选为2-10℃，更优选为3-8℃；浸泡时间为1-48h，优选为2-24h，更优选为4-12h；所述清洗采用蒸馏水清洗。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述反应为在黑暗环境下反应；反应时间为0.5-24h，优选为1-12h，更优选为2-8h；所述清洗采用蒸馏水清洗；和/或
步骤(4)中所述含有硼酸基的物质为二茂铁硼酸和/或1,1-二硼酸二茂铁；含有硼酸基的物质优选为二茂铁硼酸和/或1,1-二硼酸二茂铁的磷酸缓冲溶液；作为优选，含有硼酸基的物质的浓度为0.1-20mM，优选为0.5-10mM，更优选为1-5mM；浸泡时间为0.5-24h，优选为1-12h，更优选为2-8h；所述清洗采用蒸馏水清洗。
8.一种基于双分子识别的多巴胺电化学传感器，其特征在于：该电化学传感器包括权利要求3或4所述的多巴胺检测电极或根据权利要求5-7中任一项所述方法制备的多巴胺检测电极。
9.一种多巴胺的检测方法，其特征在于：将权利要求8所述的多巴胺电化学传感器置于溶液中，采用差示脉冲伏安法扫描，读取含有硼酸基物质的电信号；含有硼酸基物质的电还原峰的强度与多巴胺的浓度或含量成正比；作为优选。所述溶液为磷酸缓冲溶液；所述采用差示脉冲伏安法扫描的参数为：电位从0.8至-0.2V(优选为0.6至-0.1V，更优选为0.42至-0.07V)；电势阶跃为1-10mV(优选为2-8mV，更优选为3-6mV)；脉冲宽度为0.01-0.2s(优选为0.02-0.1s，更优选为0.03-0.8s)；脉冲周期为0.05-1s(优选为0.1-0.8s，更优选为0.15-0.5s)；脉冲幅度5-50mV(优选为10-40mV，更优选为15-30mV)。
10.根据权利要求9所述的多巴胺的检测方法，其特征在于：该检测方法用于检测活体受钾离子和/或诺米芬辛药物刺激下获得的多巴胺的浓度或含量。
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