CN109439673B - Ubox泛素连接酶基因StPUB27提高马铃薯抗旱性的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子遗传育种领域，提供了马铃薯“Atlantic”和“青薯9号”Ubox泛素连接酶基因StPUB27序列，泛素连接酶基因StPUB27克隆方法并验证了该基因功能，进一步确定该基因在调节离体叶片失水率和气孔导度、不改变脯氨酸含量、提高马铃薯渗透胁迫耐受能力，提高马铃薯抗旱能力中的的应用。

Description

Ubox泛素连接酶基因StPUB27提高马铃薯抗旱性的应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，具体涉及Ubox泛素连接酶基因StPUB27提高马铃薯抗旱性的应用。

背景技术

马铃薯（Solanum tuberosum L.）属于茄科块茎作物，发源于安第斯山脉，具有很高的经济价值。人类驯化并种植马铃薯已有8000多年的历史。2016年世界粮农组织（FAO）的统计资料显示，马铃薯全球种植面积达到19,246,462公顷，年产量376,826,967吨（http://www.fao.org/home/en/），仅次于玉米、小麦和水稻，属于第四大粮食作物。截止2018年5月全球共有163个国家种植马铃薯（http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC），且种植面积近年来持续增加，许多贫困地区居民的粮食和营养主要来源于马铃薯。马铃薯也是一种理想的食品，含有丰富的淀粉、蛋白质、维生素C、B族维生素、矿物质、β-胡萝卜素、有机酸等营养物质，马铃薯还广泛用作工业原料和燃料生产。

泛素-蛋白酶体系统是最重要的、有高度选择性的蛋白质降解途径，也是重要的蛋白质翻译后修饰方式，研究表明泛素化系统参与调控非生物胁迫等众多生理过程。泛素化系统在植物的胁迫应答中的广泛作用表明泛素化修饰的靶蛋白可能是响应各种胁迫信号通路中的关键蛋白，因此，系统的筛选马铃薯泛素化修饰蛋白，特别是干旱胁迫下泛素化修饰差异蛋白，这对揭示泛素化修饰参与马铃薯干旱胁迫中的生理作用具有重要意义。

现有技术存在的问题：现有技术中未见马铃薯泛素连接酶基因StPUB27的克隆及其应用；特别是未见马铃薯不同品种中StPUB27基因的克隆和应用。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供了马铃薯泛素连接酶基因StPUB27序列、克隆方法及其应用。为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

1、泛素连接酶基因StPUB27及其克隆方法，具体包括如下步骤：（1）总RNA提取及cDNA的合成；（2）引物设计及基因克隆；（3）克隆载体构建及基因测序。

2、泛素连接酶基因StPUB27功能验证方法，具体包括如下步骤：（1）StPUB27植物过表达载体构建；（2）StPUB27-RNAi载体构建；（3）马铃薯遗传转化和植株再生；（4）外源基因表达量检测；（5）转基因株系生理生化指标测定及抗旱性评价。

3、泛素连接酶基因StPUB27调节离体叶片失水率和气孔导度中的应用

35S::StPUB27过表达转基因植株、stpub27抑制表达转基因植株和野生型植株离体叶片均表现出快速失水，10 min失水约20%，80 min失水达70%以上，并且10-40 min失水率增加较快。组间分析发现，自20 min起组间失水率出现显著差异，35S::StPUB27植株的叶片失水率显著高于野生型，stpub27植株的叶片失水率显著低于野生型。结果预示着StPUB27跟马铃薯离体叶片失水率呈负相关。

采用气孔宽与长的比值表示35S::StPUB27过表达转基因植株、stpub27抑制表达转基因植株和野生型植株叶片气孔导度。结果发现，在PEG胁迫处理下野生型植株气孔导度逐渐缩小，至8 h后气孔关闭，在PEG胁迫处理下stpub27植株气孔导度逐渐缩小，与野生型保持一致，而35S::StPUB27植株气孔导度虽然也缩小，但8 h后仍然保持较大气孔导度。说明StPUB27基因的过表达使马铃薯叶片气孔导度增大，StPUB27基因参与马铃薯叶片气孔运动。

4、泛素连接酶基因StPUB27调节叶片相对电导率中的应用

采用PEG对35S::StPUB27植株、stpub27植株和野生型植株进行渗透胁迫，并于不同时间收集新鲜叶片测定相对电导率。PEG能够显著增加野生型和转基因植株马铃薯叶片相对电导率。进一步分析发现PEG处理8 h后stpub27植株相对电导率显著低于野生型植株，PEG处理12 h后35S::StPUB27植株相对电导率显著高于野生型植株，但随着PEG胁迫时间进一步延长至32 h后，不同组间相对电导率差异不再显著。结果预示着StPUB27基因的下调能够在一定程度上保护细胞，防止渗透胁迫引起的离子渗漏，原因是stpub27植株叶片拥有更强保水性，而使细胞伤害程度降低。

5、泛素连接酶基因StPUB27不改变脯氨酸含量中的应用

脯氨酸是植物重要的渗透调节物质，几乎所有植物在干旱胁迫下均大量积累脯氨酸来应对干旱胁迫，脯氨酸在细胞内的快速积累依赖于蛋白质快速降解和其他氨基酸的转化，因此，泛素化降解途径是积累脯氨酸最重要的途径之一。本申请对35S::StPUB27植株、stpub27植株和野生型植株进行PEG渗透胁迫，并于不同时间收集新鲜叶片测定脯氨酸含量。结果显示，PEG能够显著增加野生型和转基因植株马铃薯叶片脯氨酸含量。进一步分析发现相同处理时间后各组马铃薯叶片脯氨酸含量均未表现出显著差异。说明StPUB27基因并未参与脯氨酸代谢通路，对渗透调节物质脯氨酸的积累没有贡献。

有益效果：本申请提供了马铃薯“Atlantic”和“青薯9号”Ubox泛素连接酶基因StPUB27序列，泛素连接酶基因StPUB27克隆方法并验证了该基因功能，进一步确定该基因在调节离体叶片失水率和气孔导度、不改变脯氨酸含量、提高马铃薯渗透胁迫耐受能力，最终提高马铃薯抗旱能力中的的应用。

附图说明

图1为转基因植株离体叶片失水率；

图2为转基因植株叶片气孔导度；

图3为转基因植株叶片气孔显微照片；

图4为转基因植株叶片相对电导率；

图5为转基因植株叶片脯氨酸含量；

图6为StPUB27序列比对图。

具体实施方式

为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本实施例提供马铃薯泛素连接酶基因StPUB27及其克隆方法，具体包括如下步骤：

1. 总RNA提取及cDNA的合成

（1）分别取“Atlantic”和“青薯9号”试管苗幼叶100 mg在液氮中研磨成粉末，按照附录VI所述的方法提取马铃薯总RNA，经Quawell Q5000超微量紫外分光光度计测定纯度和浓度，取OD260/280位于1.9-2.1之间的RNA样品用于逆转录反应。

（2）上述RNA样品置于碎冰中缓慢解冻，TIANGEN FastQuant RT试剂盒室温下解冻后涡旋混匀，再置于碎冰中。

（3）取上述经DEPC处理的微量离心管加入RNA 2 μg（根据浓度计算得到相应体积）、5×gDNA Buffer 2 μL、RNase Free ddH2O 补足至20 μL。置于PCR仪上42℃反应3min，使样品中的DNA充分水解。

（4）取出上述离心管，加入10×Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer Mix 2 μL、RNase Free ddH2O 补足至20 μL。置于PCR仪上42℃反应15 min，95℃变性3 min。取出逆转录得到的cDNA稀释10倍用于后续PCR扩增。

2. 引物设计及基因克隆

从马铃薯基因组数据库（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/）中下载StPUB27的转录本序列（PGSC0003DMT400062931），利用NCBI Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）在线工具在5'-UTR和3'-UTR分别设计引物F: 5'-GCT↓CTAGAAGAGCTCATTAACACATCAAATTCA-3'，R: 5'-TCCCCC↓GGGGCTCTTGCCACTAATCTTGCC-3'（粗体分别为Xba I和Sma I内切酶识别位点，箭头为酶切位点，下划线为保护碱基)，设计的引物采用DNAMAN分析引物自身互补情况，选择没有自身互补的引物对送上海生工合成。

以马铃薯cDNA的第一链为模板采用冷启动对StPUB27基因编码区进行PCR扩增，反应体系为：TaKaRa Taq（5 U/μL）0.25 μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 4 μL，cDNA模板500 ng，引物(10 μmol/L)各1.0 μL，ddH2O补充至50 μL。反应程序为：35个循环(98℃变性10 s，57.8℃退火30 s，72℃延伸2.5 min)，72℃延伸10 min，产物经琼脂糖电泳检测特异性。

3. 克隆载体构建及基因测序

（1）取上述具有清晰条带的琼脂糖凝胶，采用附录III所述方法回收StPUB27基因片段，并采用Quawell Q5000超微量紫外分光光度计测定纯度和浓度。

（2）在微量离心管中加入克隆载体pMD18-T 1 μL，目的片段0.3 pmol（根据浓度换算成体积），用ddH2O补足至5 μL，震荡混匀并离心数秒，置于PCR仪上16℃ 30 min，4℃保存。

（3）采用附录IV所述方法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。

（4）大肠杆菌DH5α感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于碎冰中解冻，吸取上述重组DNA轻轻地加入到刚刚解冻的感受态细胞中央，冰浴30 min。

（5）将感受态细胞在孵育器上42℃热激45 s，迅速转入碎冰中静置2 min。

（6）加入500 μL LB培养基，颠倒混匀，置于37℃ 摇床上静置10 min后37℃ 200r/min振荡培养1 h。

（7）将事先配置好的100 mL固体LB培养基微波炉中加热熔化，冷却至50℃时加入附录II所述的Amp、IPTG和X-Gal母液各100 μL，倒入无菌培养皿中使其凝固。

（8）吸取上述菌液100 μL加入培养皿，涂布均匀，培养箱中37℃倒置培养12 h。

（9）用无菌枪头挑取白色单菌落，加入到4 mL LB培养基(含50 ng/mL Amp)中，37℃ 260 r/min振荡培养12 h。

（10）取1 μL菌液，采用5.2.3所述的PCR反应条件进行菌液PCR鉴定，并经琼脂糖电泳检测扩增特异性。

（11）将经PCR鉴定含有目的片段的菌液送上海生工测序（测序采用通用引物M13），进一步鉴定基因序列的完整性，并将序列结果与马铃薯数据库测序二倍体材料“DM1-3”相应序列进行比对。StPUB27序列见附图6和附列表。

实施例2

本实施例提供泛素连接酶基因StPUB27功能验证方法，具体包括如下步骤：

1. StPUB27植物过表达载体构建

（1）将上述所述含有pMD18T-StPUB27（“Atlantic”StPUB27基因）质粒的大肠杆菌和含有植物过表达载体CPB质粒的大肠杆菌分别加入到5 mL LB培养基中振荡培养12 h，按照附录V所述方法提取质粒，并采用Quawell Q5000测定质粒浓度。

（2）在微量离心管中加入10×M Buffer 4 µL，0.1% BSA 4 µL，质粒DNA 1 µg（需根据浓度换算成体积），XbaI 1 µL，SmaI 1 µL，ddH2O补足至40 µL，震荡混匀并离心数秒，置于PCR仪37℃反应1 h进行双酶切。

（3）采用附录III所述的方法回收经酶切后含有粘性末端的“Atlantic”StPUB27基因片段和CPB质粒，并采用Quawell Q5000测定浓度。

（4）根据目的基因片段和载体的浓度按物质的量之比为5:1进行混合，取5 µL混合物加入微量离心管中，并加入5×T4 DNA Ligase Buffer 2 µL，T4 DNA Ligase 1 µL，ddH2O 2 µL。震荡混匀并离心数秒，置于PCR仪25℃反应4 h。

（5）采用附录IV所述方法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。

（6）大肠杆菌DH5α感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于碎冰中解冻，吸取上述重组DNA轻轻地加入到刚刚解冻的感受态细胞中央，冰浴30 min。将感受态细胞在孵育器上42℃热激45 s，迅速转入碎冰中静置2 min。

（7）加入500 µL LB培养基，颠倒混匀，置于37℃ 摇床上静置10 min，然后37℃200 r/min振荡培养1 h。

（8）将事先配置好的100 mL固体LB培养基微波炉中加热熔化，冷却至50℃时加入附录II所述的Kan母液100 µL，倒入无菌培养皿中使其凝固。

（9）取上述菌液100 µL加入培养皿涂布均匀，37℃倒置培养12 h。

（10）用无菌枪头挑取单菌落，加入到4 mL LB培养基(含50 ng/mL Kan)中，37℃260 r/min振荡培养12 h。

（11）取1 μL菌液，采用5.2.3所述的PCR反应条件进行菌液PCR鉴定，并经1%琼脂糖电泳检测。

（12）取经PCR鉴定含有目的片段的菌液50 μL加入到4 mL LB培养基，37℃ 260 r/min振荡培养12 h。按照附录V所述方法提取质粒，并采用Quawell Q5000测定质粒浓度。

（13）采用附录IV所述方法制备农杆菌LBA4404感受态细胞。

（14）农杆菌感受态细胞从-80℃冰箱取出，在碎冰中解冻，在固液共存态时将上述重组质粒加入到菌液中央，碎冰中静置30 min。

（15）上述农杆菌感受态细胞置于液氮中2 min，然后在37℃孵育器中放置5 min，再加入800 μL LB培养基，230 r/min，28℃培养3 h。

（16）将事先配置好的100 mL固体LB培养基微波炉中加热熔化，冷却至50℃时加入附录II所述的Rif和Kan母液100 µL，倒入无菌培养皿中使其凝固。

（17）将菌液5000 r/min 4℃离心收集菌体，再用100 μL LB培养液重悬，涂布于上述培养皿中，28℃倒置培养48 h。

（18）用无菌枪头挑取单菌落，加入到4 mL LB培养基(含50 ng/mL Kan和50 ng/mLRif)中，28℃ 230 r/min振荡培养48 h。

（19）取1 μL菌液，采用5.2.3所述的PCR反应条件进行菌液PCR鉴定，扩增产物经1%琼脂糖电泳检测。

2.StPUB27-RNAi载体构建

（1）根据马铃薯基因组数据库StPUB27基因的转录本序列（PGSC0003DMT400062931），利用在线工具NCBI Primer-BLAST在CDS设计引物F: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCCACTCTGTAGCGAGTCA-3'，R: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACATTCTGCCCAGGTTGTGA-3'（粗体为保护碱基，下划线为attB接头序列)。设计的引物采用DNAMAN分析引物自身互补情况，没有自身互补现象的引物由上海生工合成。

（2）采用5.2.2所述“Atlantic”cDNA，以冷启动对StPUB27干扰片段进行PCR扩增，反应体系为：TaKaRa Taq（5 U/µL）0.25 µL，10×PCR Buffer 5 µL，dNTP Mixture（2.5mmol/L）4 µL，cDNA模板500 ng，引物（10 µmol/L）各1.0 µL，ddH2O补充至50 µL。反应程序为：35个循环（98℃变性10 s，57.2℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

（3）取上述具有清晰条带的琼脂糖凝胶，采用附录III所述方法回收StPUB27基因片段，并采用Quawell Q5000超微量紫外分光光度计测定纯度和浓度。

（4）在微量离心管中加入克隆载体pEASY-T1 1 µL，目的片段4 µL，震荡混匀并离心数秒，置于PCR仪上25℃ 5 min，反应结束后取出置于碎冰中。

（5）将附录IV所述方法制备得大肠杆菌DH5α感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于碎冰中解冻，吸取上述重组DNA轻轻地加入到刚刚解冻的感受态细胞中央，冰浴30 min。

（6）将感受态细胞在孵育器上42℃热激45 s，迅速转入碎冰静置2 min。

（7）加入500 µL LB培养基，颠倒混匀，置于37℃摇床上静置10 min，然后37℃ 200r/min振荡培养1 h。

（8）将事先配置好的100 mL固体LB培养基微波炉中加热熔化，冷却至50℃时加入附录II所述的Kan、IPTG和X-Gal母液各100 µL，倒入无菌培养皿中使其凝固。

（9）取上述菌液100 µL加入培养皿涂布均匀，37℃倒置培养12 h。

（10）用无菌枪头挑取白色单菌落，加入到4 mL LB培养基（含50 ng/mL Kan）中，37℃ 260 r/min振荡培养12 h。

（11）取1 µL 菌液，采用上述步骤（2）所述的PCR反应条件进行菌液PCR鉴定，产物经1%琼脂糖电泳检测。

（12）将经PCR鉴定含有目的片段的菌液送上海生工测序，进一步鉴定序列的完整性。

（13）将上述含有“Atlantic”pEASY-T1-StPUB27i质粒的大肠杆菌和pDONRA221质粒的大肠杆菌分别加入到5 mL LB培养基中振荡培养12 h，按照附录V所述方法提取质粒，并采用Quawell Q5000测定质粒浓度。

（14）在微量离心管中加入10×M Buffer 2 µL，0.1% BSA 2 µL，pEASY-T1-StPUB27i质粒DNA 1 µg（需根据浓度换算成体积），XbaI 1 µL，ddH2O补足至20 µL。震荡混匀并离心数秒，置于PCR仪37℃反应1 h进行单酶切。

（15）往酶切产物中加入2 µL（0.1倍体积）3 mol/L醋酸钠溶液，500 µL（25倍体积）在碎冰中预冷的无水乙醇，颠倒混匀后加入到DNA吸附柱中充分离心，并用70%乙醇清洗两次，最后用PH为8.0的TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl和1 mmol/L EDTA）溶解，至浓度为50-150 ng/µL。

（16）根据pEASY-T1-StPUB27i与pDONR221核苷酸数和浓度，计算其等物质的量时的体积比，然后按总物质的量为100 fmol（1 mol=1015 fmol）进行等物质的量混合，再加入BP Clonase II enzyme mix 2 µL，并用TE Buffer 补足至8 µL，震荡混匀并短暂离心后25℃反应1 h。

（17）加入Proteinase K solution 1 µL，37℃反应10 min。同源重组的pDONRA221-StPUB27i质粒按5.2.4步骤3-10导入大肠杆菌DH5α感受态细胞。

（18）分别将含有pDONRA221-StPUB27i和pHellsgate8的大肠杆菌加入到5 mL LB培养基中振荡培养12 h，按照附录V所述方法提取质粒，并采用Quawell Q5000测定质粒浓度。

（19）根据pDONR221-StPUB27i与pHellsgate8核苷酸数和浓度，计算其等物质的量时的体积比，然后按总物质的量为100 fmol（1 mol=1015 fmol）进行等物质的量混合，再加入LR Clonase II enzyme mix 2 µL，并用TE Buffer 补足至10 µL，震荡混匀并短暂离心后25℃反应1 h。

（20）加入Proteinase K solution 1 µL，37℃反应10 min。同源重组的pHellsgate8-StPUB27i质粒按5.2.4步骤3-10导入大肠杆菌DH5α感受态细胞。

（21）采用附录IV所述方法制备农杆菌LBA4404感受态细胞。

（22）农杆菌感受态细胞从-80℃冰箱取出，在碎冰中解冻，在固液共存态时将上述重组质粒加入到菌液中央，碎冰中静置30 min。

（23）将上述农杆菌感受态细胞置于液氮中2 min，然后在37℃孵育器中放置5min，再加入800 μL LB培养基，230 r/min，28℃培养3 h。

（24）将事先配置好的100 mL固体LB培养基微波炉中加热熔化，冷却至50℃时加入附录II所述的Rif和Kan母液100 µL，倒入无菌培养皿中使其凝固。

（25）将菌液5000 r/min 4℃离心收集菌体，再用100 μL LB培养液重悬，涂布于上述培养皿中，28℃倒置培养48 h。

（26）用无菌枪头挑取单菌落，加入到4 mL LB培养基(含50 ng/mL Kan和50 ng/mLRif)中，28℃ 230 r/min振荡培养48 h。

（27）取1 μL菌液，采用6.2.2.1步骤（2）所述的PCR反应条件进行菌液PCR鉴定，并经1%琼脂糖电泳检测。

3. 马铃薯遗传转化和植株再生

（1）将马铃薯栽培品种“Atlantic”试管苗培养30 d，更换含有0.2%活性炭和8%蔗糖的MS培养基后全暗培养2个月获得试管薯。

（2）将含有CPB-StPUB27和pHellsgate8-StPUB27i的农杆菌在含有Kan和Rif的LB培养液中28℃震荡培养，直至菌液浓度OD600达到0.5，然后5000 r/min离心6 min，收集菌体，用50 mL液体MS重悬。

（3）将100 mL MS固体培养基在微波炉中熔化，降温至50℃时加入附录II所述的试剂母液，包括：IAA 100 μL、GA3 20 μL、6-BA 50 μL、ZT 20 μL、Kan 50 μL、Carb 50 μL，混匀后迅速倒入培养皿中凝固，得到分化培养基。

（4）将马铃薯试管薯切成3-6 mm薄片后浸泡在含有农杆菌工程菌的MS液体培养基中侵染10 min，用无菌滤纸吸干薯片上多余的菌液，均匀平铺在分化培养基上，置于光照2000 lx（16 h/d），温度20±2℃的条件下进行选择培养。

（5）待分化出的芽长到1 cm时切下芽转入含75 mg/L Kan和200 mg/L Carb的固体MS生根培养基上进行诱导生根筛选，从而获得完整植株。

（6）截取CPB和pHellsgate8载体中新霉素磷酸转移酶NPT-Ⅱ序列（Kan抗性基因），利用在线工具NCBI Primer-BLAST设计鉴定引物（F: GCTATGACTGGGCACAACAG，R:ATACCGTAAAGCACGAGGAA，扩增片段676 bp），设计的引物采用DNAMAN分析引物自身互补情况，没有自身互补现象的引物由上海生工合成。

（7）根据附录VII所述方法提取转基因植株DNA，采用鉴定引物进行PCR扩增检测，反应程序为：预变性94℃ 4 min，35个循环（94 ℃变性10 s，56.0℃退火30 s，72℃延伸45s），最后72℃延伸10 min，最后采用1%琼脂糖凝胶电泳对转化植株中外源片段进行检测。

4. 外源基因表达量检测

（1）截取StPUB27 CDS区避开RNAi片段和U-box保守结构域利用在线工具NCBIPrimer-BLAST设计并合成qRT-PCR扩增引物F: CGGAGGTATTAGCCGCTCTG；R:TCTTTGCTTGGCTGGTTCCT（过表达和RNAi引物序列相同）。同时设计合成表3.1内参基因EF1α（F: GATGGTCAGACCCGTGAACA；R: CCTTGGAGTACTTCGGGGTG）和sec3（F:GCTTGCACACGCCATATCAAT；R: TGGATTTTACCACCTTCCGCA）的引物序列。

（2）根据附录VI所述方法提取转基因株系总RNA，采用TIANGEN试剂盒，按2.2.3.1所述方法进行逆转录得到cDNA。

（3）采用TIANGEN试剂盒进行qRT-PCR，反应体系为：2×SuperReal PreMix Plus10 μL，cDNA模板1 μg，引物（10 μmol/L）各0.6 μL，ddH2O补充至20 μL。反应程序为：95℃预变性4 min，38个循环（95℃变性15 s，57.8℃退火30 s，72℃延伸30 s），收集各反应Ct值，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

5. 转基因株系生理生化指标测定及抗旱性评价。

分别取过表达和RNAi干扰表达相对表达量变化最明显的3个株系转接到自主设计的培养管中（同时培养野生型植株），每个株系3株，继代培养28 d后取等质量的各组叶片在室温和相对湿度35%条件下测定离体叶片失水率(失水率=∆m/m0，∆m：质量变化量，m0：叶片鲜重)。另取野生型、过表达和干扰表达的植株转接到自主设计的培养管中，转化植株每组3个株系，每个株系3株，继代培养28 d后分成6组，对其中3组更换含有20% PEG的MS培养基进行渗透胁迫。胁迫处理4 h和8 h后采集各组叶片在下表皮涂抹瞬间强力胶水（502胶水），快速的用两块载玻片夹住，待胶水凝固后，轻轻撕下叶片（此时叶表皮被粘在载玻片上），然后在光学显微镜下观察并拍摄照片。采用盲法各组随机选取18个气孔计算气孔导度，气孔导度以气孔宽度与长度的比值进行表示。

分别取过表达和干扰表达相对表达量变化最明显的3个株系转接到自主设计的培养管中（同时培养野生型植株），转化植株每组3个株系，每个株系3株，培养28 d后从底部更换含有20% PEG的MS培养液进行胁迫，并于0、4、8、12、24、32 h后收集新鲜叶片测定相对电导率和脯氨酸含量。其中，相对电导率测定采用浸泡法进行测定，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法进行测定。

实施例3

本实施例提供泛素连接酶基因StPUB27的应用，具体包括如下：

（1）泛素连接酶基因StPUB27调节离体叶片失水率和气孔导度中的应用

如图1所示，35S::StPUB27植株、stpub27植株和野生型植株离体叶片均表现出快速失水，10 min失水约20%，80 min失水达70%以上，并且10-40 min失水率增加较快。组间分析发现，自20 min起组间失水率出现显著差异，35S::StPUB27植株的叶片失水率显著高于野生型，stpub27植株的叶片失水率显著低于野生型。结果预示着StPUB27跟马铃薯离体叶片失水率呈负相关。

如图2（表1）和图3所示，采用气孔宽与长的比值表示35S::StPUB27植株、stpub27植株和野生型植株叶片气孔导度。结果发现，在PEG胁迫处理下野生型植株气孔导度逐渐缩小，至8 h后气孔关闭，在PEG胁迫处理下stpub27植株气孔导度逐渐缩小，与野生型保持一致，而35S::StPUB27植株气孔导度虽然也缩小，但8 h后仍然保持较大气孔导度。说明StPUB27基因的过表达使马铃薯叶片气孔导度增大，StPUB27基因参与马铃薯叶片气孔运动。

（2）泛素连接酶基因StPUB27调节叶片相对电导率中的应用

采用PEG对35S::StPUB27植株、stpub27植株和野生型植株进行渗透胁迫，并于不同时间收集新鲜叶片测定相对电导率。结果如图4所示，PEG能够显著增加野生型和转基因植株马铃薯叶片相对电导率。进一步分析发现PEG处理8 h后stpub27植株相对电导率显著低于野生型植株，PEG处理12 h后35S::StPUB27植株相对电导率显著高于野生型植株，但随着PEG胁迫时间进一步延长至32 h后，不同组间相对电导率差异不再显著。结果预示着StPUB27基因的下调能够在一定程度上保护细胞，防止渗透胁迫引起的离子渗漏，这可能的原因是stpub27植株叶片拥有更强保水性，而使细胞伤害程度降低。

（3）泛素连接酶基因StPUB27不改变马铃薯脯氨酸含量但提高马铃薯渗透胁迫耐受能力的应用

对35S::StPUB27植株、stpub27植株和野生型植株进行PEG渗透胁迫，并于不同时间收集新鲜叶片测定脯氨酸含量。结果如图5所示，PEG能够显著增加野生型和转基因植株马铃薯叶片脯氨酸含量。进一步分析发现相同处理时间后各组马铃薯叶片脯氨酸含量均未表现出显著差异。说明StPUB27基因并未参与脯氨酸代谢通路，对渗透调节物质脯氨酸的积累没有贡献。

实施例4

本实施例提供本申请的常用实验技术，包括附录I至附录VII，具体如下：

附录I LB培养基

LB液体培养基的配置：500 mL体系中包括：酵母提取物5 g；胰蛋白胨5 g；NaCl 1g；蒸馏水500 mL。取各成分混合，调节pH值为7.0，121℃高温高压灭菌15 min，固体LB培养基需在灭菌之前加入0.5%琼脂。

附录II 常用试剂母液的配置

1、20 mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）溶液：取X-Gal 100 mg 在超净工作台加入二甲基甲酰胺（DMF）5 mL溶液，震荡混匀，过0.22 μm无菌滤膜，分装在1.5mL离心管中，用锡箔纸包裹-20℃避光保存。

2、100 mg/mL异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）：取1000 mg IPTG，溶于10 mL无菌的ddH₂O中，过0.22 μm无菌滤膜，分装在1.5 mL离心管中， -20℃保存。

3、100 mg/mL氨苄青霉素（Amp）：取1000 mg Amp白色粉末，溶于10 mL无菌的ddH₂O中，过0.22 μm无菌滤膜，1.5 mL离心管分装，-20℃保存。

4、50 mg/mL卡那霉素（Kan）：取500 mg Kan白色粉末，溶于10 mL无菌ddH₂O中，过0.22 μm无菌滤膜，分装在1.5 mL离心管中，-20℃保存。

5、50 mg/mL 利福平（Rif）：取500 mg Rif红色粉末，溶于10 mL的二甲亚砜（DMSO），剧烈震荡，充分溶解后过0.22 μm无菌滤膜，分装在1.5 mL离心管中，-20℃保存。

6、1 mg/mL 吲哚乙酸（IAA）：取10 mg IAA白色粉末，溶于1 mL无水乙醇，再加入9mL无菌ddH₂O中，过0.22 μm无菌滤膜，分装在1.5 mL离心管中，-20℃保存。

7、0.3 mg/mL萘乙酸（NAA）：取3 mg NAA白色粉末，溶于1 mL无水乙醇，再加入9 mL无菌ddH₂O中，过0.22 μm无菌滤膜，分装在1.5 mL离心管中，-20℃保存。

8、0.2 mg/mL赤霉素（GA3）：取2 mg GA3白色粉末，溶于1 mL无水乙醇，再加入9 mL无菌ddH₂O中，过0.22 μm无菌滤膜，分装在1.5 mL离心管中，-20℃保存。

9、2 mg/mL玉米素（ZT）：取20 mg ZT白色粉末，溶于1 mL无水乙醇，再加入9 mL无菌ddH₂O中，过0.22 μm无菌滤膜，1.5 mL离心管分装，-20℃保存。

10、0.5 mg/mL 6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）：取5 mg 6-BA白色粉末溶于1 mL无水乙醇，再加入9 mL无菌ddH₂O中，过0.22 μm无菌滤膜，分装在1.5 mL离心管中，-20℃保存。

附录III 琼脂糖凝胶电泳胶回收DNA片段

按照上海生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书操作（有删改），具体步骤如下：

1、将手术刀片用0.5 mol/L氢氧化钠溶液浸泡12 h，蒸馏水冲洗3遍，置于广口瓶中灭菌，在紫外灯下将琼脂糖电泳后有清晰条带的琼脂糖凝胶用刀片切下含DNA片段的胶块，放入2.0 mL离心管中，称重。切胶应当快速准切，避免长时间在紫外光下暴露和切下多余的胶块。

2、根据胶块的重量和浓度，按每100 mg琼脂糖（如胶块不足100 mg则用水补充至100 mg）加300-600 μL的比例加入Buffer B2。

3、将离心管置于50℃水浴5-10 min，期间不断颠倒混匀，直至胶块完全溶化。

4、将溶化好的溶液全部移入吸附柱，12000 r/min（离心半径5 cm，约8050×g）离心30 s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回原收集管中。如果溶胶液总体积大于750 μL，则需多次离心回收DNA。

5、向吸附柱中加入300 μL Buffer B2，12000 r/min离心30 s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回原收集管中。

6、向吸附柱中加入500 μL Wash Solution冲洗吸附柱，12000 r/min离心30 s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

7、重复步骤6一次。

8、将空吸附柱和收集管放入离心机，12000 r/min离心2 min，充分去除冲洗液。

9、在吸附膜中央加入15-40 μL Elution Buffer（2.5 mmol/L Tris-HCl），室温静置2 min，12000 r/min离心1 min。所得DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

附录IV 大肠杆菌和农杆菌感受态细胞的制备

1、大肠杆菌感受态制备

（1）将-80℃保存的大肠杆菌DH5α取出在碎冰中解冻，吸取100 μL涂布于LB平板上，培养12 h。

（2）用灭菌的20 µL小枪头挑取LB平板上经活化培养的大肠杆菌单菌落，并将粘有单菌落的小枪头放入到盛有LB液体培养基的4 mL无菌离心管中，在37℃，260 r/min的条件下震荡培养12 h。

（3）吸取经过12 h培养的菌液500 μL加入30 mL LB液体培养基中，继续培养3-6 h至OD₆₀₀为0.5左右。

（4）将菌浓度符合要求的培养物转入50 mL无菌离心管中，并在碎冰中放置10min。然后在4℃，3000 r/min（离心半径5 cm）的条件下离心10 min，弃去上清液。用碎冰中预冷的0.1 mol/L CaCl₂溶液将菌体重悬，并在冰浴中放置30 min。将重悬液4℃，6000 r/min，离心10 min，弃去上清液。

（5）用1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl₂溶液重悬菌体，并分装在离心管中，每支50 μL，加入50 μL 15%的甘油，置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

2、农杆菌感受态制备

（1）将-80℃保存的农杆菌LBA4404取出在碎冰中解冻，吸取100 μL涂布于LB平板上，培养24 h。用无菌枪头挑取单菌落在4 mL LB液体培养基中28℃ 230 r/min震荡培养12h进行活化。

（2）取上述活化的菌液1 mL加入到含50 mL LB培养基的锥形瓶中，再加入Rif母液50 μL（终浓度50 ng/mL），28℃ 230 r/min震荡培养8-12 h至OD₆₀₀为0.5左右。

（3）将菌液转入无菌离心管，4℃ 5000 r/min离心10 min，弃去上清液，倒置在无菌滤纸上。

（4）加入10 mL 0.5 mol/L的无菌NaCl溶液，涡旋振荡使菌体重悬，4℃ 5000 r/min离心10 min，弃去上清液，收集菌体。

（5）用2 mL 20 mmol/L CaCl₂溶液将菌体重悬后分装在1.5 mL离心管中，加入等体积15%的甘油后经液氮速冻放在超低温冰箱中保存备用。

附录V 大肠杆菌质粒提取

按TIANGEN质粒小提试剂盒说明书进行操作（有删改），具体步骤如下：

1、向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500 μL的平衡液BL，12000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2、取1-5 mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000 r/min离心1 min，弃去上清液，并用移液器尽量吸除上清液。

3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μL溶液P1，使用移液器吸打使菌体彻底悬浮。

4、向离心管中加入250 μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

5、向离心管中加入350 μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，12000 r/min离心10 min。

6、将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀，12000 r/min离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7、向吸附柱CP3中加入500 μL去蛋白液PD，12000 r/min离心30-60 s，弃去收集管中的废液，将吸附柱CP3放回原收集管中。

8、向吸附柱CP3中加入600 μL漂洗液PW（事先已加入无水乙醇），12000 r/min离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

9、重复操作步骤8。

10、将吸附柱CP3放入收集管中，12000 r/min离心2 min，将吸附柱中残余的漂洗液充分去除。

11、将吸附柱CP3置于一个无菌干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12000 r/min离心2 min将质粒溶液收集到离心管中。

附录VI 植物总RNA提取

按TIANGEN质粒小提试剂盒说明书进行操作（有删改），具体步骤如下：

1、圆底离心管、镊子、剪刀、移液枪吸头、研磨棒等器具使用0.1% DEPC溶液浸泡24h，取出后置于塑料盒中，用报纸包好于高压灭菌锅120℃ 30 min灭菌两次，于超净台中通风干燥，备用。

2、取植物组织约200 mg置于圆底离心管，圆底离心管外壁浸入液氮中冷冻（避免液氮进入离心管带来污染），采用研磨棒不断研磨直至样品呈粉末状，期间圆底离心管不断伸入液氮中冷冻。

3、向样品中加入l.0 mL裂解液RZ，上下颠倒混匀，室温下放置5 min，4℃条件下12000 rmp离心8 min，缓慢吸取上清液至新的离心管中。

4、再加入200 μL CH₃Cl，涡旋混匀器震荡混匀，室温下放置3 min后在4℃条件下12000 r/min离心8 min，缓慢吸取上清液（三层中的最上层）至新的离心管中。

5、根据上述液体体积加入约0.5倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，将溶液连同白色沉淀一起转移到RNA吸附柱CR3中，4℃条件下12000 rmp离心30 s，弃废液。

6、向RNA吸附柱CR3中加入去蛋白液RD 500 μL，4℃条件下12000 rmp离心30 s，弃废液。

7、向RNA吸附柱CR3中加入漂洗液RW 500 μL，4℃条件下12000 r/min离心30 s，弃废液，再向吸附柱CR3加入漂洗液RW 500 μL，4℃条件下12000 r/min离心30 s，弃废液。

8、将RNA吸附柱CR3置于超净台中风干5 min，加入0.1% DEPC水溶液50 μL进行洗脱，4℃条件下12000 r/min离心3 min，回收洗脱液。

9、取1 μL RNA样品以0.1% DEPC水溶液为对照采用微量紫外分光光度计测定浓度和纯度，取OD_260/280位于1.9-2.1之间的RNA样品用于后续实验。

附录VII 植物基因组DNA提取

按TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒的说明书操作（有删改），具体步骤如下：

1、取植物组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分碾磨。

2、将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 µL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

3、加入700 µL氯仿，充分混匀，12000 r/min（~13400×g）离心5 min。

4、小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700 µL缓冲液GP2，充分混匀。

5、将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000 r/min（~13400×g）离心30 s，弃掉废液。

6、向吸附柱CB3中加入500 µL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000 r/min（~13400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7、向吸附柱CB3中加入600 µL 漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000 r/min（~13400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8、重复操作步骤7。

9、将吸附柱CB3放回收集管中，12000 r/min（~13400×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10、将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12000 r/min（~13400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

序列表

<110> 甘肃农业大学

<120> Ubox泛素连接酶基因StPUB27及其应用

<150> 201810815410X

<151> 2018-07-24

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2049

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 1

atgattcaaa gatttgatcg gaatgatcgc cggattttga cattcccggc ggtacatcca 60

tgtgagggga tatctccggc taccctttta gattctttga ttactctgtc taagggcata 120

tgcagtttca aattgaaatt ctttccatct caacggagaa atgttcgcga aatgattagg 180

caagtgggga tcctcttgat ttttttcgag gaaatccggg atcatctacc tagtggtgga 240

gattccattg ttctttgttt tgcagaacta cacacaacgt ttcaaaagat taagttttta 300

ttagatgatt gtatgcgtga gggggcgaaa acttggatgc ttatgaaatc ccactctgta 360

gcgagtcaat ttcaagtttt ggttagaact gtggctactg cacttgatgt tcttcctttg 420

aattctctta atgtttccag agaaatcaag gagttggttc taatggtggc taatcaagca 480

cagagggcaa aaatggagct cgacccggaa gacgaagaag ctgtgaagag agtaattttg 540

cttttgaacc aatttgagaa taagtttcag cctgaccccc gtgtaatcaa gaaatttctg 600

gattatcttg atatcacaac ctgggaagaa tgtcacaagg agattaaatt cttagaggat 660

gagattaatt tcgaatgctc ggagaattac gaacgagaag tacctatgct aagcagttta 720

gttggattct tgagctattg caggggaatt ttgtttgagg actctgttta tgggaactct 780

gatcaatcag atggaacatc caacctggaa actctgagtt gcttgaatcc tgaggatttc 840

aggtgtccca tttctctgga actcatgacg gatccagtga cagtgtccac gggccagact 900

tatgatcgct cttcgattca aaaatggctc aagtcaggga acctcctctg tcccaaaaca 960

ggggcgacat tacagagcac agaattagta cctaattcct ctctgcggaa cctcatccaa 1020

caattctgtg ctgataatgg aatatcacta gctaaatcaa ggaagaagag tcgtgatata 1080

tcgcggacaa ttttgccagg aaatccagca gctgcggaag caatcaaatt cctctccgaa 1140

tttctcgcgt gcaggctgta ttttggttct gatcagcaga aaaccaaggc cgcttatgaa 1200

attcgcttgc ttgcaaaatc aaatatattc aaccggtccg tgttaatcga agctgcaaca 1260

atcccagcac tcttacaaat gcttattaca aatgatccat ctatgcaaga gcattcaatt 1320

tccgccttgc tcaaactatc taaacattcc aacggaaaga aagtgatcat ggaaaatagg 1380

ggcctgaatt cgattcttgg agttctcagg aatggcctaa agctagaatc aaagcaaatt 1440

gcagctgcga taatcttcta catctcttca cctcgtgaat accgcaagct aataggcgaa 1500

aatccagaag tatttccagc tttagtggac ttaatcaaac acggaacaag ttgcgggaaa 1560

aagaatgcga ttgttgcaat attcgggctg ctgttgagtc acaggaacca cgagagagca 1620

cttggtgcag gaacagttcc agcactagtc aatcttttag cttcttcaga taaagttgaa 1680

ctaaacacag atgcacttgc ggttttagct acattagccg aaagaacaga agggtctttc 1740

gcgattttag aagcttcagc attaccagta atcttgaatc aattacagaa cacaacatct 1800

cgagcgggaa aagagtattg tgtttccatt ttgttgtcat tatgtgtcaa tagtggcgcg 1860

gaggtattag ctgctctggt aagagaaaag gcgcttatgc cacttcttta ttcactttta 1920

acagaaggaa ccagccaagc aaagaagagg acacggtctc ttatcaaaat tctacagaga 1980

ttttgtgaaa cgagcacttc taggcttgtg agtgaagttc cacaagaaca atttattgat 2040

gtaaggtga 2049

<210> 2

<211> 2049

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 2

atgattcaaa gatttgatcg gaatgatcgc cggattttga cattcccggc ggtacatcca 60

tgtgagggga tatctccggc taccctttta gattctttga ttactctatc taagggcata 120

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ttagatgatt gtgtgcgtga gggggcgaaa acttggatgc ttatgaaatc ccactctgta 360

gcgagtcaat ttcaagtttt ggttagaact gtggctactg cacttgatgt tcttcctttg 420

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cagagggcga aaatggagct cgacccggaa gacgaggaag ctgtgaagag agtaattttg 540

cttttgaacc aatttgagaa taagtttcag cctgaccccc gtgtaatcaa gaaatttctg 600

gattatcttg atatcacaac ctgggaagaa tgtcacaagg agattaaatt cttagaggat 660

gagattaatt tcgaatgctc agagaattac gaacgagaag tacctatgct aagcagttta 720

gtcggattct tgagctattg caggggaatt ttgtttgagg actctgttta tgggaacact 780

gatcaatcag atggaacatc caacctggaa actctgagtt gcttgaatcc tgaggatttc 840

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tatgatcgcg cttcgattca aaaatggctc aagtcaggga acctcctctg tcccaaaaca 960

ggggagacat tacagagcac agaattagta cctaattcct ctctgcggaa cctcatccaa 1020

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tttctcgcgt gcaggctgta ttttggttct gatcagcaga aaaccaaggc tgcttatgaa 1200

attcgcttgc ttgcaaaatc aaatatattt aaccggtccg tgttaatcga agctgcaaca 1260

atcccagcac tcttacaaat gcttagtata aatgatccat ctatgcaaga gcattcaatt 1320

tccgccttgc tcaaactatc gaaacattcc aacggaaaga aagtgatcat ggaaaatagg 1380

ggcctgaatt cgattcttgg agttctcagg aatggcctaa agctagaatc aaagcaaatt 1440

gcagctgcga taatcttcta catctcttca cctcgtgaat accgcaagct aataggcgaa 1500

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cttggtgcag gaacagttcc agcactagtc aatcttttag cttcttcaga taaagttgaa 1680

ctaaacacag atgcacttgc ggttttagct acattagccg aaagaacaga agggtctttc 1740

gcgattttag aagcttcagc attaccagta atcttgaatc aattacagaa cacaacatct 1800

cgagcgggaa aagagtattg tgtttccatt ttgttgtcat tatgtgtcaa tagtggcgcg 1860

gaggtattag ccgctctggt aagagaaaag gcgcttatgc cacttcttta ttcactttta 1920

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ttttgtgaaa cgagcacttc taggcttgtg agtgaagttc cacaagaaca atttattgat 2040

gtaaggtga 2049

Claims (1)

1.泛素连接酶基因StPUB27提高马铃薯抗旱性的应用，其特征在于所述StPUB27基因CDS序列“Atlantic”如序列表SEQ ID NO：1，“青薯9号”如序列表SEQ ID NO：2所示；所述StPUB27基因通过调节马铃薯离体叶片失水率、气孔导度和叶片相对电导率提高马铃薯抗旱性。

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