CN109432445B - 酶基复合纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种酶基复合纳米探针及其制备方法和应用。所述酶基复合纳米探针为纳米核壳结构，其核体包括上转换纳米粒，用于包覆所述核体的壳层的材料包括用于包覆所述核体的油酸层、与所述油酸层结合的两亲性聚合物，在所述油酸层与两亲性聚合物共同构成的疏水区域还负载有氧气敏感荧光分子，在两亲性聚合物上还结合有D‑氨基酸氧化酶基团。所述酶基复合纳米探针通过所含的核体和壳层之间的协同增效作用，有效整合近红外光体内检测效果好和D‑氨基酸氧化酶基团特异性高的优点，赋予其灵敏度高、特异性强、非入侵等优点，从而实现体内D‑氨基酸的高效检测。另外，所述酶基复合纳米探针结构稳定，性能稳定，且其制备方法工艺条件可控，制备的酶基复合纳米探针性能稳定。

Description

酶基复合纳米探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种纳米探针材料技术领域，具体涉及一种酶基复合纳米探针及其制备方法和应用。
背景技术
众所周知，氨基酸是生命体系中地位举足轻重的有机化合物。长久以来，科学家一直认为在高等生物中仅存在L-氨基酸，其对映异构体D-氨基酸则仅存在于细菌等低等微生物中。但随着检测技术的进步和研究的深入，研究者陆续在哺乳动物和人类的中枢神经系统、肝脏和胃液中检测到多种D-氨基酸。更有意义的是，越来越多的研究显示，D-氨基酸在多种神经疾病发生发展、神经递质分泌等过程中扮演重要角色，而且还是早期胃癌的标志物之一。因此，在活体中检测D-氨基酸具有重要意义。
传统D-氨基酸检测技术主要为基于仪器的物理方法，包括高效液相色谱、气相色谱和毛细管电泳等。但这些基于仪器的检测方法常需要复杂的前处理过程和昂贵的手性耗材，导致检测结果误差大、成本高、耗时长。为克服以上不足，研究者们着力于开发更为特异性的检测方法，以期减少前处理过程，降低成本，提高检测准确度。
研究发现，在生物体中，存在一种能特异性识别并催化D-氨基酸氧化的酶，也即是D-氨基酸氧化酶。经酶促反应，D-氨基酸被氧化，同时消耗氧气，产生过氧化氢和铵离子。D-氨基酸氧化酶对底物具有高度的立体选择性，仅能识别D-氨基酸，不能识别L-氨基酸，因此是特异性检测D-氨基酸的理想工具。受以上特性启发，别具匠心的研究者们开发了多种基于D-氨基酸氧化酶的电化学检测策略，用于D-氨基酸特异性检测。相比于基于仪器的物理方法，这些D-氨基酸检测策略有效减少了前处理过程，改善了检测的便捷性和特异性，但是这些探针仍无法用于体内或者需要将电极植入体内，临床操作面临严峻挑战。
另外，由于光学探针具有成本低、安全性好、灵敏度高等优点，研发者也在尝试研发光学探针用于D-氨基酸检测，如可通过紫外/可见光区的荧光或者吸光度信号快速检测D-氨基酸。但目前这些基于紫外/可见光的光学探针仍面临光子体内穿透深度受限的瓶颈问题，对于解决D-氨基酸相关神经科学或者肿瘤学问题的贡献十分有限。因此，探索和开发一种具有体内D-氨基酸检测能力的荧光探针一直是当前本领域努力解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种酶基复合纳米探针及其制备方法和应用，以解决现有光学探针用于检测体内D-氨基酸时存在的光子体内穿透深度受限的瓶颈技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明的一方面，提供了一种酶基复合纳米探针。所述酶基复合纳米探针为纳米核壳结构，其核体包括上转换纳米粒，用于包覆所述核体的壳层的材料包括用于包覆所述核体的油酸、与所述油酸结合的两亲性聚合物，在所述油酸层与两亲性聚合物共同构成的疏水区域还负载有氧气敏感荧光分子，在两亲性聚合物上还结合有D-氨基酸氧化酶基团。
本发明的另一方面，提供了一种酶基复合纳米探针的制备方法。所述酶基复合纳米探针的制备方法包括如下步骤：
将油酸包裹的上转换纳米粒与两亲性聚合物进行混合处理并分离纯化，得到水溶性上转换纳米粒；
将所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子进行混合处理并分离纯化，得到载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒；
将所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶进行混合处理并进行偶联反应处理，得到酶基复合纳米探针。
本发明的又一方面，提供了本发明酶基复合纳米探针的应用方法。具体地，所述酶基复合纳米探针在制备用于体内D-氨基酸的检测试剂或以D-氨基酸为检测对象的医用体内诊断试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明所述酶基复合纳米探针含有上转换纳米粒的核体，其能够被体内穿透能力强的近红外光激发，且发射光谱可调，非常适合用于体内检测与成像；壳层所负载的氧气敏感荧光分子能够有效感知氧气浓度变化，且可被核体上转换纳米粒激发并发射近红外光区荧光；另外，壳层所负载的D-氨基酸氧化酶基团能特异性识别D-氨基酸并催化其反应，消耗氧气，引起氧气敏感分子荧光信号改变，将D-氨基酸浓度信号转化为近红外光信号，其显著区别于常见的生物自发光，可有效降低背景干扰，提高检测灵敏度。因此，所述酶基复合纳米探针通过所含的核体和壳层之间的协同增效作用，有效整合近红外光体内检测效果好和D-氨基酸氧化酶基团特异性高的优势，赋予酶基复合纳米探针灵敏度高、特异性强、非入侵等优点，有效克服现有检测技术的不足，从而能实现体内D-氨基酸的高效检测。另外，所述酶基复合纳米探针结构稳定，性能稳定。
本发明所述酶基复合纳米探针的制备方法通过将上转换纳米粒作为核体，然后将氧气敏感荧光分子和D-氨基酸氧化酶有序组装到含有两亲性聚合物的壳层中，这样一方面能够有效保证所述酶基复合纳米探针的结构稳定，而且还能把上转换纳米粒、氧气敏感荧光分子和D-氨基酸氧化酶的功能结合起来，将D-氨基酸的浓度信号转化为近红外荧光信号，从而实现体内D-氨基酸有效监测检测；另一方面，所述酶基复合纳米探针的制备方法工艺条件可控，制备的酶基复合纳米探针性能稳定。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为本发明实施例酶基复合纳米探针的结构示意图；
图2为本发明实施例酶基复合纳米探针的制备方法工艺流程示意图；
图3为本发明实施例酶基复合纳米探针的制备方法中酶基复合纳米探针先后顺序组装流程示意图；
图4为本发明实施例1-7提供的酶基复合纳米探针与对比例1提供的对照纳米探针体内D-氨基酸荧光检测实验步骤示意图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例说明书中所提到的各组分的质量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间质量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例说明书各组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地，本发明实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
一方面，本发明实施例提供了一种酶基复合纳米探针。所述酶基复合纳米探针为纳米核壳结构，其结构如图1所示，其包括核体01和包覆于核体01的壳层02。
其中，所示核体01的材料包括上转换纳米粒，以所述上转换纳米粒作为核体01的材料，不但赋予所述核体01优异的光学性能，而且其制备工艺成熟，颗粒粒径大小可控，尺寸均匀，可被近红外光有效激发，发光效率高，且发射光谱可调。在一实施例中，所述上转换纳米粒包括但不仅仅为NaYF4:X、NaGdF4:X、NaYF4:X@NaYF4中的一种，其中，所述X为掺杂元素，且包括Er和Yb。选用该类的上转换纳米粒作为核体01的材料，能够赋予核体01更优异的光学性能，当然其粒径大小可控，尺寸均匀。
在另一实施例中，所述核体的直径可以控制为15-30nm，以调节所述酶基复合纳米探针检测体内D-氨基酸的效果。
所述酶基复合纳米探针所含的包覆于核体01的壳层02的结构如图1中所示，其包括油酸层21、两亲性聚合物22、氧气敏感荧光分子23和D-氨基酸氧化酶基团24。其中，所述油酸层21包覆于所述壳体01，所述两亲性聚合物22由于含有疏水基团和亲水基团，因此，所述两亲性聚合物22通过疏水基团与油性的所述油酸层21中的油酸的疏水性相互作用结合到油酸层21上。与此同时，由于油酸与两亲性聚合物22均具有疏水特性，因此，两者结合后会共同构成疏水区域，该疏水区域构成了氧气敏感荧光分子23的负载场所，也即是所述氧气敏感荧光分子23负载(物理负载)在油酸与两亲性聚合物22共同构成疏水区域内。所述D-氨基酸氧化酶基团24是结合在两亲性聚合物22上，具体是通过偶联结合在所述两亲性聚合物22的亲水基团上。正因所述酶基复合纳米探针具有所述的结构，有效提高核体01与所述壳层02之间的结合强度，赋予所述酶基复合纳米探针结构稳定性和性能的稳定性。同时由于所述壳层02中油酸层21和两亲性聚合物22的存在，一方面使得壳层02能够与核体01牢固结合，赋予上转换纳米粒良好的亲水性，可稳定的分散在生理液体等水相环境中，为体内检测创造条件；另一方面能够有效负载氧气敏感荧光分子23和D-氨基酸氧化酶基团24，且合理控制二者与上转换纳米粒之间的空间距离，保证上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子23之间有高效的能量转移，且D-氨基酸氧化酶基团24能高特异性识别环境中的D-氨基酸，将D-氨基酸浓度信号转化为氧气敏感荧光分子荧光信号，从而赋予所述酶基复合纳米探针体内D-氨基酸高效检测特性。其中，所述氧气敏感荧光分子23的存在赋予所述酶基复合纳米探针灵敏的感知氧气浓度变化并发射近红外光区荧光特性。所述D-氨基酸氧化酶基团24的存在赋予所述酶基复合纳米探针高度特异性识别D-氨基酸，不能识别L-氨基酸的能力。
在一实施例中，所述两亲性聚合物22包括C18-PEG-COOH，或C18-PEG-COOH与C18-PEG、C18-PEG-OH中的至少一种的混合物。其中，所述C18-PEG-COOH与C18-PEG、C18-PEG-OH中的至少一种的质量比为1：(0-9)。优选的，所述两亲性聚合物优选选用分子量为2kDa～10kDa的两亲性聚合物，如所述C18-PEG、C18-PEG-COOH、C18-PEG-OH的分子量为2kDa～10kDa。
在一实施例中，所述氧气敏感荧光分子23的负载量(氧气敏感分子的质量除以整个探针的质量)优选控制为0.5％-5％；所述D-氨基酸氧化酶基团24的负载量优选控制为0.5％-5％。通过优化氧气敏感荧光分子23和D-氨基酸氧化酶基团24的负载量，从而提高所述酶基复合纳米探针对体内D-氨基酸检查的灵敏度。在具体实施例中，所述氧气敏感荧光分子23可以但不仅仅为钯八乙基卟啉、铂八乙基卟啉、铂(Ⅱ)-四(五氟苯)卟吩中的至少一种。
因此，上文各实施例中酶基复合纳米探针在近红外光(980nm)的照射下，所含核体01的上转换纳米粒能通过能量转移过程激发氧气敏感分子发射近红外区荧光(650-700nm)，壳层02中所含的D-氨基酸氧化酶基团24能特异性识别D-氨基酸并催化其快速氧化，剧烈消耗环境中的氧气，从而引起氧气敏感分子23荧光信号的改变。因此，所述酶基复合纳米探针通过如图1所示的独特设计，将D-氨基酸的浓度信号转化为氧气敏感分子的近红外荧光信号，实现D-氨基酸的快速、高灵敏检测。通过所含的核体01和壳层02之间的协同增效作用，有效整合近红外光优异的体内检测能力和D-氨基酸氧化酶高特异性识别能力，赋予酶基复合纳米探针灵敏度高、特异性强、非入侵等优点，有效克服现有检测技术的不足，从而能实现体内D-氨基酸的高效检测。另外，所述酶基复合纳米探针结构稳定，性能稳定。
另一方面，本发明实施例还提供了酶基复合纳米探针的制备方法。所述酶基复合纳米探针的制备方法工艺流程如图2和3所示，其包括如下步骤：
步骤S01：将油酸包裹的上转换纳米粒与两亲性聚合物进行混合处理并分离纯化，得到水溶性上转换纳米粒；
步骤S02：将所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子进行混合处理并分离纯化，得到载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒；
步骤S03：将所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶进行混合处理并进行共价偶联反应处理，得到酶基复合纳米探针。
其中，所述步骤S01中，所述油酸包裹的上转换纳米粒与两亲性聚合物进行混合处理过程中，所述两亲性聚合物能够通过与油酸层的疏水相互作用结合到油酸层的表面，具体如图3中所示。在一实施例中，所述上转换纳米粒与两亲性聚合物可以按照质量比为1：(4-10)的比例进行混合处理。在具体实施例中，所述两亲性聚合物包括C18-PEG-COOH，或C18-PEG-COOH与C18-PEG、C18-PEG-OH中的至少一种的混合物。优选的，所述两亲性聚合物分子量为2kDa～10kDa的两亲性聚合物，如所述C18-PEG、C18-PEG-COOH、C18-PEG-OH的分子量为2kDa～10kDa。
在一实施例中，所述油酸包覆的上转换纳米粒可以按照现有上转换纳米粒的制备方法制备获得，具体的可以按照下文实施例1和2中步骤S11的方法制备相应的上转换纳米粒。一实施例中，所述上转换纳米粒的粒径可以是15-30nm。
另外，在步骤S01中，所述油酸包覆的上转换纳米粒与所述两亲性聚合物之间的混合是充分的，如混合处理24h以上，使得所述两亲性聚合物与油酸包覆层充分结合。构成所述上转换纳米粒与两亲性聚合物混合处理的溶剂可以是三氯甲烷、丙酮等溶剂。待步骤S01完毕后，还包括对制备的水溶性上转换纳米粒进行分离纯化的步骤，如洗涤处理，具体的如离心清洗3次。
所述步骤S02中，将所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子进行混合处理后，氧气敏感荧光分子会通过相似相容原理负载在由油酸与两亲性聚合物两者共同构成的疏水区域内，如图3所示。
所述氧气敏感荧光分子的负载赋予壳层含有氧气敏感荧光功能分子，从而赋予制备的酶基复合纳米探针灵敏感知氧气浓度变化并发射近红外光区荧光特性。在具体实施例中，所述水溶性上转换纳米粒与所述氧气敏感荧光分子是按照质量比为100：(0.5-10)的比例进行混合处理，从而在所述壳层中负载适量的氧气敏感荧光分子，优化制备的酶基复合纳米探针氧气浓度依赖的近红外光区荧光性能。在具体实施例中，所述氧气敏感荧光分子可以但不仅仅包括钯八乙基卟啉、铂八乙基卟啉、铂(Ⅱ)-四(五氟苯)卟吩中的至少一种。
另外，在步骤S02中，所述水溶性上转换纳米粒与所述氧气敏感荧光分子之间的混合处理应该是充分的，如混合处理24h以上。构成所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子混合处理并反应的溶剂可以是四氢呋喃、三氯甲烷、二甲基亚砜等。待步骤S02完毕后，还包括对制备的水溶性上转换纳米粒进行纯化处理，如洗涤处理，具体的如离心清洗3次。
所述步骤S03中，将所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶进行混合处理并进行共价偶联反应后，所述D-氨基酸氧化酶基团偶联在所述两亲性聚合物上，如图3所示。由于含有D-氨基酸氧化酶功能基团，从而赋予制备的酶基复合纳米探针特异性响应D-氨基酸的特性。在一实施例中，在将所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶进行混合处理并进行偶联反应处理的步骤中，是先将所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与EDC/NHS溶液进行混合，然后加入所述D-氨基酸氧化酶混合处理并进行偶联反应处理。在具体实施例中，所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与所述D-氨基酸氧化酶是按照质量比为100：(0.5-10)的比例进行混合处理。
另外，在步骤S03中，所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与所述D-氨基酸氧化酶之间的偶联反应应该是充分的，如反应4～24h。构成所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶混合处理并反应的溶剂可以是超纯水、pH＝8.0的磷酸缓冲液等。待步骤S03中反应完毕后，还包括对制备的酶基复合纳米探针进行洗涤处理，如离心清洗3次。
因此，上述酶基复合纳米探针的制备方法各实施例中通过将上转换纳米粒作为核体，然后将氧气敏感荧光分子和D-氨基酸氧化酶有序组装到含有两亲性聚合物的壳层中，能有效保证所述酶基复合纳米探针的结构稳定性，而且能有效感知D-氨基酸浓度变化，发射近红外光区荧光，从而实现体内D-氨基酸有效监测检测；另一方面，所述酶基复合纳米探针的制备方法工艺条件可控，制备的酶基复合纳米探针结构可控，且性能稳定。
再一方面，在所述酶基复合纳米探针及其制备方法的基础上，本发明实施例还提供了上文所述酶基复合纳米探针的应用。上文所述酶基复合纳米探针结构和性能稳定，能够特异性地感知D-氨基酸浓度变化，并发射近红外光区荧光，可实现体内D-氨基酸的高效检测。因此，所述酶基复合纳米探针可以在制备用于体内D-氨基酸的检测试剂或制备以D-氨基酸为检测对象的医用体内诊断试剂中的应用。
以下通过多个具体实施例来举例说明本发明实施例酶基复合纳米探针及其制备方法等。
实施例1
本实施例提供了一种酶基复合纳米探针及其制备方法。所述酶基复合纳米探针的结构如图1所示，其为核壳结构，其核体粒径为20nm，核体包括NaYF4，掺杂元素为Er和Yb；壳层材料包含油酸层和与油酸层结合的C18-PEG-COOH两亲性聚合物，在所述壳层中组装有氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉和D-氨基酸氧化酶基团。
所述酶基复合纳米探针的制备方法包括如下步骤：
S11:将用于制备NaYF4：Er,Yb的稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备油酸包裹上转换纳米粒；
S12:将制备的油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到水溶性上转换纳米粒；其中，所述油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物按照质量比为1：6的比例添加混合；
S13:将制备的水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒；其中，所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉按照质量比为100：2的比例添加混合；
S14:将EDC/NHS溶液加入到制备的载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒溶液中，然后与D-氨基酸氧化酶在搅拌条件下混合，反应4～24h后，离心清洗3次，得到酶基复合纳米探针；其中，所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶按照质量比为100：2的比例添加混合。
实施例2
本实施例提供了一种酶基复合纳米探针及其制备方法。所述酶基复合纳米探针的结构如图1所示，其为核壳结构，其核体粒径为20nm，核体包括NaGdF4，掺杂元素优选为Er和Yb；壳层材料包含油酸层和与油酸层结合的C18-PEG-COOH两亲性聚合物，在所述壳层中结合有氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉和D-氨基酸氧化酶。
所述酶基复合纳米探针的制备方法包括如下步骤：
S11:将用于制备NaGdF4：Er,Yb的稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备油酸包裹上转换纳米粒；
S12:将制备的油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到水溶性上转换纳米粒；其中，所述油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物按照质量比为1：6的比例添加混合；
S13:将制备的水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒；其中，所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉按照质量比为100：2的比例添加混合；
S14:将EDC/NHS溶液加入到制备的载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒溶液中，然后与D-氨基酸氧化酶在搅拌条件下混合，反应4～24h后，离心清洗3次，得到酶基复合纳米探针；其中，所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶按照质量比为100：2的比例添加混合。
实施例3
本实施例提供了一种酶基复合纳米探针及其制备方法。所述酶基复合纳米探针的结构如图1所示，其为核壳结构，其核体粒径为26nm，核体包括NaYF4:Er,Yb@NaYF4，掺杂元素优选为Er和Yb；壳层材料包含油酸层和与油酸层结合的C18-PEG-COOH两亲性聚合物，在所述壳层中结合有氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉和D-氨基酸氧化酶。
所述酶基复合纳米探针的制备方法包括如下步骤：
S11:将用于制备NaYF4:Er,Yb的稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备上转换纳米粒NaYF4:Er,Yb；再将上一步制备的NaYF4:Er,Yb、稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备油酸包裹上转换纳米粒NaYF4:Er,Yb@NaYF4；
S12:将制备的油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到水溶性上转换纳米粒；其中，所述油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物按照质量比为1：6的比例添加混合；
S13:将制备的水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒；其中，所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉按照质量比为100：2的比例添加混合；
S14:将EDC/NHS溶液加入到制备的载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒溶液中，然后与D-氨基酸氧化酶在搅拌条件下混合，反应4～24h后，离心清洗3次，得到酶基复合纳米探针；其中，所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶按照质量比为100：2的比例添加混合。
实施例4
本实施例提供了一种酶基复合纳米探针及其制备方法。所述酶基复合纳米探针的结构如图1所示，其为核壳结构，其核体粒径为26nm，核体包括NaYF4:Er,Yb@NaYF4，掺杂元素优选为Er和Yb；壳层材料包含油酸层和与油酸层结合的C18-PEG-COOH两亲性聚合物，在所述壳层中结合有氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉和D-氨基酸氧化酶。
所述酶基复合纳米探针的制备方法包括如下步骤：
S11:将用于制备NaYF4:Er,Yb的稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备上转换纳米粒NaYF4:Er,Yb；再将上一步制备的NaYF4:Er,Yb、稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备油酸包裹上转换纳米粒NaYF4:Er,Yb@NaYF4；
S12:将制备的油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到水溶性上转换纳米粒；其中，所述油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物按照质量比为1：6的比例添加混合；
S13:将制备的水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒；其中，所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉按照质量比为100：0.5的比例添加混合；
S14:将EDC/NHS溶液加入到制备的载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒溶液中，然后与D-氨基酸氧化酶在搅拌条件下混合，反应4～24h后，离心清洗3次，得到酶基复合纳米探针；其中，所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶按照质量比为100：2的比例添加混合。
实施例5
本实施例提供了一种酶基复合纳米探针及其制备方法。所述酶基复合纳米探针的结构如图1所示，其为核壳结构，其核体粒径为26nm，核体包括NaYF4:Er,Yb@NaYF4，掺杂元素优选为Er和Yb；壳层材料包含油酸层和与油酸层结合的C18-PEG-COOH两亲性聚合物，在所述壳层中结合有氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉和D-氨基酸氧化酶。
所述酶基复合纳米探针的制备方法包括如下步骤：
S11:将用于制备NaYF4:Er,Yb的稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备上转换纳米粒NaYF4:Er,Yb；再将上一步制备的NaYF4:Er,Yb、稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备油酸包裹上转换纳米粒NaYF4:Er,Yb@NaYF4；
S12:将制备的油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到水溶性上转换纳米粒；其中，所述油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物按照质量比为1：6的比例添加混合；
S13:将制备的水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒；其中，所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉按照质量比为100：10的比例添加混合；
S14:将EDC/NHS溶液加入到制备的载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒溶液中，然后与D-氨基酸氧化酶在搅拌条件下混合，反应4～24h后，离心清洗3次，得到酶基复合纳米探针；其中，所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶按照质量比为100：2的比例添加混合。
实施例6
本实施例提供了一种酶基复合纳米探针及其制备方法。所述酶基复合纳米探针的结构如图1所示，其为核壳结构，其核体粒径为26nm，核体包括NaYF4:Er,Yb@NaYF4，掺杂元素优选为Er和Yb；壳层材料包含油酸层和与油酸层结合的C18-PEG-COOH与C18-PEG-OH按照质量比为1：5的两亲性聚合物，在所述壳层中结合有氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉和D-氨基酸氧化酶。
所述酶基复合纳米探针的制备方法包括如下步骤：
S11:将用于制备NaYF4:Er,Yb的稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备上转换纳米粒NaYF4:Er,Yb；再将上一步制备的NaYF4:Er,Yb、稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备油酸包裹上转换纳米粒NaYF4:Er,Yb@NaYF4；
S12:将制备的油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH和C18-PEG-OH两亲性聚合物在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到水溶性上转换纳米粒；其中，所述油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物按照质量比为1：6的比例添加混合；其中，C18-PEG-COOH与C18-PEG-OH的质量比为1：5；
S13:将制备的水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子钯八乙基卟啉在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒；其中，所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子钯八乙基卟啉按照质量比为100：2的比例添加混合；
S14:将EDC/NHS溶液加入到制备的载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒溶液中，然后与D-氨基酸氧化酶在搅拌条件下混合，反应4～24h后，离心清洗3次，得到酶基复合纳米探针；其中，所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶按照质量比为100：0.5的比例添加混合。
实施例7
本实施例提供了一种酶基复合纳米探针及其制备方法。所述酶基复合纳米探针的结构如图1所示，其为核壳结构，其核体粒径为26nm，核体包括NaYF4:Er,Yb@NaYF4，掺杂元素优选为Er和Yb；壳层材料包含油酸层和与油酸层结合的C18-PEG-COOH与C18-PEG按照质量比为1：9的两亲性聚合物，在所述壳层中结合有氧气敏感荧光分子铂(Ⅱ)-四(五氟苯)卟吩和D-氨基酸氧化酶。
所述酶基复合纳米探针的制备方法包括如下步骤：
S11:将用于制备NaYF4:Er,Yb的稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备上转换纳米粒NaYF4:Er,Yb；再将上一步制备的NaYF4:Er,Yb、稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备油酸包裹上转换纳米粒NaYF4:Er,Yb@NaYF4；
S12:将制备的油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH和C18-PEG两亲性聚合物在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到水溶性上转换纳米粒；其中，所述油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物按照质量比为1：6的比例添加混合；其中，C18-PEG-COOH与C18-PEG的质量比为1：9；
S13:将制备的水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂(Ⅱ)-四(五氟苯)卟吩在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒；其中，所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂(Ⅱ)-四(五氟苯)卟吩按照质量比为100：2的比例添加混合；
S14:将EDC/NHS溶液加入到制备的载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒溶液中，然后与D-氨基酸氧化酶在搅拌条件下混合，反应4～24h后，离心清洗3次，得到酶基复合纳米探针；其中，所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶按照质量比为100：10的比例添加混合。
对比例1
本对比例提供了一种对照纳米探针。所述对照纳米探针为核壳结构，其核体粒径为26nm，核体包括NaYF4:Er,Yb@NaYF4，掺杂元素优选为Er和Yb；壳层材料包含油酸层和与油酸层结合的C18-PEG-COOH两亲性聚合物，在所述壳层中结合有氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉。
所述对照纳米探针的制备方法包括如下步骤：
S11:将用于制备NaYF4:Er,Yb的稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备上转换纳米粒NaYF4:Er,Yb；再将上一步制备的NaYF4:Er,Yb、稀土原料与油酸和1-十八烯混合，在氮气保护下制备油酸包裹上转换纳米粒NaYF4:Er,Yb@NaYF4；
S12:将制备的油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到水溶性上转换纳米粒；其中，所述油酸包裹上转换纳米粒与C18-PEG-COOH两亲性聚合物按照质量比为1：6的比例添加混合；
S13:将制备的水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉在搅拌条件下混合，反应24h后，离心清洗3次，得到载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒；其中，所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子铂八乙基卟啉按照质量比为100：2的比例添加混合。
酶基复合纳米探针的体内D-氨基酸荧光检测实验
将实施例1-7提供的酶基复合纳米探针和对比例1提供的对照纳米探针进行体内D-氨基酸的荧光检测实验，具体方法如图4所示，具体如下：
先对实验鼠分别进行皮下注射本实施例1-7酶基复合纳米探针和对比例1对照纳米探针，然后对实验鼠腹腔注射D-氨基酸，最后分别对实验鼠进行近红外荧光成像处理，读取注射部位的近红外荧光信号。
实验结果：经过对各实验鼠进行近红外荧光成像处理得知，注射有本发明实施例酶基复合纳米探针的部位具有良好的成像效果，而对比例则无成像效果。由此可知，本发明实施例提供的酶基复合纳米探针具有灵敏的D-氨基酸响应性，且对D-氨基酸具有高特异性，能够有效实现体内D-氨基酸的高效检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酶基复合纳米探针，其特征在于：所述酶基复合纳米探针为纳米核壳结构，其核体包括上转换纳米粒，用于包覆所述核体的壳层的材料包括用于包覆所述核体的油酸层、与所述油酸层结合的两亲性聚合物，在所述油酸层与两亲性聚合物共同构成的疏水区域还负载有氧气敏感荧光分子，在两亲性聚合物上还结合有D-氨基酸氧化酶基团；所述两亲性聚合物包括C18-PEG-COOH，或C18-PEG-COOH与C18-PEG的混合物，或C18-PEG-COOH与C18-PEG-OH的混合物中的一种；所述氧气敏感荧光分子为钯八乙基卟啉、铂八乙基卟啉、铂(Ⅱ)-四(五氟苯)卟吩中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的酶基复合纳米探针，其特征在于：所述氧气敏感荧光分子在所述酶基复合纳米探针中的负载量为0.5-5wt％；和/或
所述D-氨基酸氧化酶基团在所述酶基复合纳米探针中的负载量为0.5-5wt％。
3.根据权利要求1或2所述的酶基复合纳米探针，其特征在于：所述上转换纳米粒为NaYF4:X、NaGdF4:X、NaYF4:X@NaYF4中的一种，其中，所述X为掺杂元素，且包括Er和Yb。
4.根据权利要求3所述的酶基复合纳米探针，其特征在于：所述两亲性聚合物的分子量为2kDa～10kDa。
5.根据权利要求1、2、4任一项所述的酶基复合纳米探针，其特征在于：所述核体的直径为15-30nm。
6.一种如权利要求 1所述酶基复合纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
将油酸包裹的上转换纳米粒与两亲性聚合物进行混合处理并分离纯化，得到水溶性上转换纳米粒；其中，所述两亲性聚合物包括C18-PEG-COOH，或C18-PEG-COOH与C18-PEG的混合物，或C18-PEG-COOH与C18-PEG-OH的混合物中的一种；
将所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子进行混合处理并分离纯化，得到载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒；
将所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶进行混合处理并进行偶联反应处理，得到酶基复合纳米探针。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：在将上转换纳米粒与两亲性聚合物进行混合处理的步骤中，所述上转换纳米粒与所述两亲性聚合物是按照质量比为1：(4-10)的比例进行混合处理。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：在将所述水溶性上转换纳米粒与氧气敏感荧光分子进行混合处理的步骤中，所述水溶性上转换纳米粒与所述氧气敏感荧光分子是按照质量比为100：(0.5-10)的比例进行混合处理。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：在将所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与D-氨基酸氧化酶进行混合处理并进行偶联反应处理的步骤中，是先将所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与EDC/NHS溶液进行混合，然后加入所述D-氨基酸氧化酶混合处理并进行偶联反应处理；和/或
所述载氧气敏感荧光分子的上转换纳米粒与所述D-氨基酸氧化酶是按照质量比为100：(0.5-10)的比例进行混合处理。
10.根据权利要求1-5任一项所述的酶基复合纳米探针在制备用于体内D-氨基酸的检测试剂或以D-氨基酸为检测对象的医用体内诊断试剂中的应用。
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