CN109432083A - Egcg在制备改善血糖波动导致的内皮细胞损伤药物中的应用 - Google Patents

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CN109432083A CN201811635048.4A CN201811635048A CN109432083A CN 109432083 A CN109432083 A CN 109432083A CN 201811635048 A CN201811635048 A CN 201811635048A CN 109432083 A CN109432083 A CN 109432083A
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Abstract

本发明公开了EGCG在制备改善血糖波动导致的内皮细胞损伤药物中的应用。本发明首次发现绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯能够改善血糖波动环境中内皮细胞损伤。本发明为目前血糖波动导致的内皮细胞损伤的治疗提供了一种全新的选择和思路，拓宽了改善血糖波动导致的内皮细胞损伤药物的选择领域，也为该技术领域的发展做出了贡献。

Description

EGCG在制备改善血糖波动导致的内皮细胞损伤药物中的应用
技术领域
本发明涉及EGCG的一种新用途，具体公开EGCG在制备改善血糖波动导致的内皮细胞损伤药物中的应用。
背景技术
糖尿病是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病。持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致全身组织器官，特别是眼、肾、心血管及神经系统的损害及其功能障碍和衰竭。血管性疾病是糖尿病病人最主要的慢性并发症，包括大血管病变及微血管病变。
大量研究证明，糖尿病并发症不仅与血糖整体控制水平有关，而且与血糖波动有着密切的关系。血糖波动是大血管并发症的独立危险因子。血管内皮细胞不仅仅是血管腔的一层防护细胞，内皮细胞具有内分泌功能，参与多种生理及病理过程。血管疾病是一种慢性炎症性疾病，炎症在血管性疾病病因学中扮演着关键角色，内皮细胞损伤是血管性疾病发生发展的起始环节。研究发现，反应性充血指数(反应血管内皮功能的指标)与平均血糖波动幅度及平均餐后血糖波动幅度呈负相关，与糖化血红蛋白不相关，且血糖波动激活氧化应激，加剧内皮细胞的损害。因此，很有必要深入探究血糖波动对内皮细胞的影响机制及其防治因素。
研究发现，血糖波动可明显激活炎症信号通路。TLR是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁，是模式识别受体家族的成员之一，TLR的分布十分广泛，主要表达于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、多形核细胞、淋巴细胞及自然杀伤细胞等表面，通过激活促炎性信号通路对微生物病原体起反应。髓样分化因子(MyD88)与Toll相互作用蛋白(Tollip)是TLR信号途径中重要的调节蛋白，TLR4活化后主要激活下游两条通路：MyD88依赖性通路和MyD88非依赖性通路，前者为主要途径。Tollip是是保护性因子，该保守性蛋白能抑制MyD88激活的NF-κb信号转导。糖尿病病人，尤其是2型糖尿病病人，TLR4及TLR2的水平升高加重炎性状态，参与糖尿病血管炎的发生，因而调控TLRs能够预防糖尿病大血管及微血管并发症的发生。TLR可通过NF-κb调控炎症反应，在高血糖环境下活性氧可诱导内皮细胞TLR2及TLR4的高表达，且抗氧化剂的治疗减少了TLR2及TLR4的表达及下游炎症因子的释放，显示出TLR通路与氧化应激相关。丝裂原活化的蛋白激酶信号转导通路存在于大多数细胞内，将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应，不同的细胞外刺激可激活不同的信号通路，通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应。p38MAPK是丝裂原活化的蛋白激酶家族控制炎症反应最重要的成员，主要参与细胞应激反应和炎症反应。血糖升高可引起p38MAPK通路激活。而波动性高血糖比持续性高糖对内皮细胞的损伤更大，在持续性高血糖中，TLR2与TLR4共同作用，血糖波动中TLR4作用明显高于TLR2，活化NF-κb进入细胞核，引起ICAM-1的明显升高，波动血糖同样可导致内皮细胞中TNF-α明显升高。VCAM-1、ICAM-1是介导免疫粘附反应的重要致病因子，参与动脉硬化的发生发展，其水平可看作内皮细胞损伤的标志，是导致糖尿病并发症的重要致病因素。MCP-1是重要的趋化因子，可招募单核细胞引起炎症反应，促进动脉粥样斑块的形成，其水平可用于预测冠心病患者的心血管疾病的死亡率，在糖尿病视网膜病变中同样升高。FGF-21与细胞摄入血糖相关，是新发现的FGF超家族的一员，在伴有颈动脉粥样硬化斑块患者血清FGF-21水平明显升高，FGF-21独立于已知的心血管危险因素，其血清水平与颈动脉硬化呈正相关]。综上所述，探索血糖波动中炎症因子水平的变化及作用机制并发现一种药物作用于血糖波动炎症信号通路改善内皮细胞功能，进而改善血管性疾病，成为新的研究热点。
目前研究已证实绿茶的摄入可预防多种疾病的发生，例如心血管疾病、糖尿病及其并发症、高血压、肝脏疾病以及某些癌症。日本一项18.7年的随访研究，发现每天绿茶的摄入并不能降低癌症的死亡率，但是其摄入量与心脑血管疾病等的死亡率有明显的相关性，且能降低死亡率。
绿茶活性成分主要是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，约占绿茶儿茶素的60％)，是目前已知的抗氧化作用最强的自由基清除剂之一。EGCG已经被证实能与细胞多种蛋白反应。绿茶在内皮细胞中的研究众多，也能作用于细胞核中的核转录因子，减弱NF-κb引起的内皮损伤，同时也能减弱单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)等分子的表达。且研究发现内皮细胞存在EGCG受体，即67层粘连蛋白受体，EGCG可以通过该受体诱导Tollip上调，进而抑制LPS刺激的内皮细胞中TLR4下游的信号转导。但EGCG能否改善血糖波动环境中内皮细胞的损伤，目前尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种EGCG在制备改善血糖波动导致的内皮细胞损伤药物中的应用。
优选地，所述EGCG来源于绿茶。
优选地，所述药物可制备成药学上可接受的药物剂型，所述药物剂型为固体制剂或液体制剂。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明为目前改善血糖波动导致的内皮细胞损伤药物提供了一种全新的选择和思路，拓宽了改善血糖波动导致的内皮细胞损伤药物的选择领域，也为该技术领域的发展作出了贡献。
2、本发明首次证实绿茶中的成分EGCG可显著改善血糖波动对内皮细胞的损害，进而改善糖尿病血管并发症。
3、本发明提供的EGCG在制备改善血糖波动导致的内皮细胞损伤药物中的应用，方法简单，安全无毒副作用。
附图说明
图1为EGCG对血糖波动环境下细胞炎性因子mRNA的影响结果图，其中图1(A)、图1(B)及图1(C)分别表示MCP-1、VCAM-1、ICAM-1水平；
图2为EGCG对血糖波动环境下细胞炎性指标蛋白的影响结果图，其中图2(A)及图2(B)分别表示TLR4、p-p38蛋白磷酸化水平，图2(C)、图2(D)、图2(E)及图2(F)分别表示VCAM-1、TNF-α、MCP-1、FGF-21水平；
图3为不同浓度p38MAPK通路抑制剂对高糖HUVEC中VCAM-1的影响结果图，其中图3(A)及图3(B)分别表示不同浓度SB203580对p-p38、VCAM-1的影响结果；
图4为SB203580(5μM)对不同血糖浓度HUVEC炎性因子的影响结果图，其中图4(A)、图4(B)、图4(C)分别表示予以SB203580干预后各组HUVEC中TNF-α、VCAM-1、MCP-1蛋白的水平；
图5为EGCG对HUVEC中Tollip的蛋白及mRNA的影响结果图，其中图5(A)、图5(B)分别表示给予EGCG干预后HUVEC中Tollip蛋白及mRNA的表达水平；
图6为Tollip沉默效果验证图，其中图6(A)为细胞转染之后的荧光效果，图6(B)为Western blotting验证的Tollip沉默水平；
图7为沉默IHG组HUVEC中Tollip后炎性指标mRNA的变化结果图，其中图7(A)、图7(B)分别表示沉默Tollip后VCAM-1、TNF-αmRNA的变化。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例
本发明提供一种EGCG在制备改善血糖波动导致的内皮细胞损伤药物中的应用，所述EGCG来源于绿茶。
需要说明的是，所述药物可制备成药学上可接受的药物剂型，所述药物剂型为固体制剂或液体制剂。
需要说明的是，所述EGCG可以使用绿茶直接应用，具体方法为称取绿茶2g，加入200ml沸水冲泡，每天饮用10杯。
利用HUVEC建立血糖波动模型，探讨EGCG干预前后，波动性高血糖环境下TLR4信号通路及炎症因子的变化，评价EGCG在改善血糖波动导致的皮细胞损伤中的效果。
1主要试剂和仪器
1.1主要试剂
氯仿、异丙醇(上海生工)；
DEPC水(北京solarbio公司)；
SYBR Select Master Mix、cDNAReverse Transcription、Trizol(美国Invitrogen公司)；
Primes(大连宝生物工程有限公司)；
APS、TEMED、Tween-20、SDS、N，N＇-亚甲双丙烯酰胺、丙烯酰胺、EGCG(美国Sigma公司)；
甘氨酸、Tris(香港Life science company)；
全蛋白提取试剂盒(南京凯基公司)；
PVDF膜(美国Amersham公司)；
TLR4一抗(美国CST公司)；
BCA试剂盒(碧云天生物技术公司)；
ECM培养基(美国Sciencecell公司)；
TNF-α一抗(美国Santa Cruz公司)；
ICAM-1一抗、VCAM-一抗、p-p38一抗、Tollip一抗(美国CST公司)；
FGF-21一抗、MCP-1一抗(美国Abcam公司)；
β-actin一抗、辣根过氧化物酶二抗(北京中杉生物技术有限公司)；
化学发光显影液、蛋白Marker(美国Thermo Fisher公司)；
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)、MTT试剂盒(碧云天生物技术公司)；
shRNA(南京凯基生物科技发展有限公司)；
jetPRIME(法国Polyplus Transfection公司)；
SB203580(美国Selleck公司)。
1.2主要仪器
微量加样枪(德国Eppendorf公司)；
电子天平(美国Denver公司)；
精密PH计(美国Beckman公司)；
Milli-Q超纯水制备系统(美国Millipore公司)；
恒温摇床(美国)；
低温高速台式离心机(日本Tomy Seiko公司)；
恒温水浴箱(上海仪器总厂)；
-20℃冰箱(青岛海尔公司)；
-80℃冰箱(日本Sanyo公司)；
ECL Doc1000凝胶成像系统、蛋白电泳仪、电转膜装置、细胞计数仪(美国Bio-Rad公司)；
酶标仪(瑞士TECAN公司)；
Real Time PCR System(LightCycler480，瑞士Roche公司)；
CO2恒温细胞培养箱(德国Thermo公司)；
超净工作台(日本Airtech公司)；
倒置相差显微镜(德国Leica公司)；
荧光显微镜(DP70，日本Olympus公司)；
各种培养板、培养瓶(美国Corning公司)；
高压蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；
液氮罐(美国Thermolyne公司)。
1.3主要试剂配制方法
分离胶缓冲液(Tris base/HCL(PH 8.8)1.5mmol/L)：
Tris base 18.16g溶解于80ml ddH2O中，待溶液冷却至室温，随后加入浓盐酸调节PH至8.8，加ddH2O定容至100ml，备用；
浓缩胶缓冲液(Tris base/HCL(PH 6.8)0.5mmol/L)：
Tris base 3.03g溶解于40ml ddH2O中，待溶液冷却至室温，随后加入浓盐酸调节PH至6.8，加ddH2O定容至50ml，备用；
电泳缓冲液(PH8.8)(1x)：
电转移缓冲液(现用现配)(1x)：
洗涤缓冲液(TBST)(1x)：
加水至900ml，用HCL调整PH为7.4，再加ddH2O至1L；
5％封闭缓冲液：将1g脱脂奶粉或者BSA溶于20ml洗涤缓冲液，即得；
30％丙烯酰胺储备液：丙烯酰胺29g+N,N’-亚甲双丙烯酰胺1g+60ml ddH2O，加热至37℃，等待固体溶解，溶解后加入ddH2O至100ml，4℃避光保存；
10％SDS：SDS 10g溶于90ml ddH2O中，充分溶解后，加ddH2O定容至100ml；
10％APS：APS20mg溶解于200μl ddH2O中，现用现配；
0.01M磷酸盐缓冲液：称取NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO40.24g，混合，加入800ml ddH2O使溶解，用1M的HCl或NaOH调节PH为7.4，加水定容至1L，然后高压蒸汽灭菌，室温保存；
胰蛋白酶消化液：称取胰蛋白酶125mg，EDTA10mg溶于50mlPBS中，充分溶解后用0.22μM微孔滤膜过滤，4℃保存；
5.5mM的ECM培养液：50mlECM培养基中加入2.5mlFBS、0.5mlECGs及0.5ml青链霉素双抗；
细胞冻存液：10％DMSO与90％FBS混合；
细胞裂解液：1ml Lysis Buffer中加入1μL蛋白酶抑制剂、5μL磷酸酶抑制剂及5μL的100mM PMSF。
2实验方法
2.1细胞复苏、培养、传代、冻存
准备复苏前准备好实验所需物品，配制ECM培养基，从液氮中取出装有二代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的冻存管装入自封袋中，立即置于37℃水浴锅中摇晃，使细胞在1分钟内快速融化，之后在超净台将融化的冻存液移至15ml无菌离心管中，加入7ml培养液，轻柔吹打后，1200r/min离心3min，吸净上清，用5ml培养液重悬细胞，取10μl细胞悬液细胞计数仪计数，以1.25*105细胞数接种于25ml细胞培养瓶。37℃5％CO2细胞培养箱中培养，24h后换液，之后每48h换液一次，同时观察细胞生长状态。细胞融合度达到80％时进行细胞传代。弃去细胞培养液，以0.01mM灭菌处理的PBS冲洗细胞，弃去PBS后加入0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶溶液1ml，均匀覆盖瓶底，室温下静置1min后，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉消化液，加入适量含血清之新鲜培养基，以吸管吹打细胞，待细胞吹打至混和均匀后，1200r/min离心3min，吸净上清，以新鲜培养基重悬细胞后，将细胞以1:3转移至新的培养瓶中。将多余的细胞进行细胞冻存，选取对数生长期的细胞，按照上述步骤消化离心后，吸净培养液，加入细胞冻存液并吹打均匀，以每管5*105/ml进行细胞冻存，在1.5ml规格的冻存管中加入1ml冻存液，做好标记，先置于4℃冰箱20分钟，然后转移至-20℃，2h后转移至-80℃过夜。次日将细胞转移至液氮中保存。
2.2确定合适的EGCG浓度
利用二代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)建立血糖波动模型：
5.5/22mmoL/L，即转换5.5mmoL/L与22mmoL/L培养液，每天高糖时间大约为9:00-11:30、15:30-18:00，干预三天。
细胞分组为：
(1)正常血糖组(NG)：正常血糖5.5mmoL/L；
(2)持续高糖组(HG)：持续高糖22mmoL/L；
(3)波动性高糖组(IHG)：波动性高糖5.5/22mmoL/L；
(4)HG+EGCG组；
(5)IHG+EGCG组。
MTT比色法测得EGCG的适宜浓度。
步骤：将HUVEC种于96孔板，每孔3000-5000个细胞，设定EGCG浓度(0μM/L、12.5μM/L、25μM/L、50μM/L、100μM/L、200μM/L)并进行上述分组，每组设3个副孔，干预3天后每孔加入1*MTT50μl，继续培养4小时后吸去培养液，加入150μl DMSO，平板摇床摇匀10min，在酶标仪540nm处测定光吸收值。观测每组细胞吸光度。
2.3细胞分组及给药方法
2.3.1检测EGCG对血糖波动致内皮细胞损害的保护作用
如上所述将HUVEC细胞接种至六孔板中，每孔细胞数大约为1*105，16h后将细胞分组为(1)NG；(2)HG；(3)IHG；(4)HG+EGCG(25μM/L)；(5)IHG+EGCG(25μM/L)，3天后WesternBlot以及RT-PCR检测各项炎性因子的蛋白以及mRNA水平。
2.3.2检测EGCG是否是通过p38MAPK通路作用于炎症因子
将p38MAPK通路抑制剂SB203580溶解于DMSO中，分别在HG及IHG中加入不同终浓度的SB203580(0μM/L、10μM/L、20μM/L、40μM/L)。另选取浓度为5μM/L的SB203580分别加入NG、HG、IHG三组中。Western Blot以及RT-PCR检测各项炎性因子的蛋白以及mRNA水平。
2.3.3检测EGCG是否是通过升高Tollip降低炎症因子水平
利用shRNA建立Tollip沉默后的细胞，进而将细胞重新进行分组(1)NG；(2)HG；(3)IHG；(4)HG+EGCG(25μM/L)；(5)IHG+EGCG(μM/L)，Western Blot以及RT-PCR检测各项指标的变化情况。
2.4质粒沉默Tollip
构建靶向Tollip基因的短发夹环RNA(shRNA)真核质粒沉默载体，选取jetPRIME脂质转染试剂进行HUVEC质粒(shRNA)的转染。细胞接种于24孔板，加入24板专用细胞爬片，培养至细胞融合度大于80％后，进行细胞的转染，于无菌EP管中加入50μljetPRIME buffer，继续加入0.5ug的质粒，低速离心10s后，以1:3的比例加入转染试剂reagent 1μl，震荡离心，室温下孵育10min，加入该转染混合物于24孔板培养液中，密切观察细胞状态，4h后转换为正常的培养基，继续于细胞培养箱中培养24h。观察荧光的表达情况，检测Tollip mRNA及蛋白的沉默情况。
2.5RT-PCR检测TLR4信号通路相关指标mRNA水平
用TRIzol提取细胞总RNA，方法如下：
细胞六孔板置于冰上，吸去细胞培养基，PBS清洗2遍，在六孔板中加入500μl的TRIzol，静置10min，加入100ul体积的氯仿(TRIzol的1/5)，振荡混匀，放在冰上静置5min。4℃离心机离心15min(转速：12000rpm)。离心后上清液移到新的RNase-free 1.5ml EP管中，加入与上清液等体积异丙醇后，冰上静置15min。之后4℃离心机离心10min(转速：12000rpm)，去掉上清液，向沉淀中加入1ml预冷75％的乙醇溶液(DEPC水配制)，洗涤沉淀后放入4℃离心机离心5min(转速：7500rpm)，弃上清液，保留沉淀，高压后的滤纸条擦干多余的液体，加入一定量的(10～20μl)的DEPC水，溶解沉淀物，轻柔吹打混匀，取RNA溶液1μl，以DEPC水作为空白对照，用紫外分光光度计测定RNA浓度以及OD260/OD280比值。
根据液体量及测定的浓度将每个标本的浓度调整为500ng/μl。
合成cDNA及Real-Time PCR：应用RNA反转录试剂盒，将RNA反转录为cDNA，反应体系为20μl，见表1。
表1反转录体系(20μl)
组分 用量(μl)
总RNA(浓度500ng/μl) 1000/浓度
DEPC水 16-RNA体积
5*PrimeScript Master Mix 4
反应条件：
37℃—15min(反转录)，85℃—5s(热灭活)，4℃—∞
引物设计与合成见表2：
表2引物序列
基因名称 上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’)
TLR4 CTGGAAATATGACCACAGTCAGAA TCAATCACCCTAGACCTGCTCAA
CCL2 AGCAGCAAGTGTCCCAAAGA GGTGGTCCATGGAATCCTGA
VCAM-1 CCCTGGAAACCAAGAGTTTGGA TCTTGCAGCTTTGTGGATGGA
TOLLIP TGCCCACAAGTGGGTCTTC GCCACCACACACTTCAAGTTTACA
FGF-21 GTTTCTGTGCTGGCTGGTCTT CAGGTGGGCTTCTGTCTGCT
TNF-α TGCTTGTTCCTCAGCCTCTT CAGAGGGCTGATTAGAGAGAGAGAGG
GAPDH TGTTGCCATCAATGACCCCTT CTCCACGACGTACTCAGCG
反应体系组成(SYBR Green法，表3)
表3Real-Time PCR反应体系(20μl)
反应条件(LightCycler480System)：
预变性
95℃ 30sec(升降温度速度4.4℃/sec)
PCR循环(50Cycle)
95℃ 5sec(升降温度速度4.4℃/sec)
60℃ 30sec(升降温度速度2.2℃/sec，采集模式：单一)
融解
分析模式：融解曲线
95℃ 5sec(升降温度速度4.4℃/sec)
60℃ 60sec(升降温度速度2.2℃/sec)
95℃ (升降温度速度0.11℃/sec，采集模式：持续)1cycle
冷却
50℃ (升降温度速度2.2℃/sec)1cycle
PCR反应结束后采用LightCycler480Software 1.5分析目的基因与内参基因GAPDH相对表达量。
2.6Western Blot检测分子蛋白的水平
细胞蛋白提取：弃去六孔板中培养液，置于冰上，预冷的蒸馏水清洗细胞2次，滤纸吸干残余液体，加入60μl已配制的细胞裂解液，均匀覆盖，将6孔板置于4℃摇床平台，剧烈震荡30min，细胞刮刮取细胞至EP管中。然后在离心机中离心15min(4℃，12000rpm)，离心后取上清液，移至预冷的离心管中，置于-80℃冰箱中保存。标准曲线制备，BSA蛋白浓度梯度，如表4。
表4标准曲线制备
组分 1 2 3 4 5 6 7 8
蒸馏水(μl) 20 19 18 16 12 8 4 0
BSA蛋白标准液(25ug/ml)(μl) 0 1 2 4 8 12 16 20
蛋白终浓度(ug/ml) 0 0.025 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
待测样品蛋白定量：取样品原液2μl加48μl ddH2O，相当于原液稀释25倍。标准品与样品各取20μl加入96孔板(加样2次)，每孔中加入200μl BCA工作液(A液/B液＝50)，充分混匀，37℃水浴锅上静置30min。将96孔板上机读数(波长595nm)，计算时取平均值。
计算浓度：将标准品OD值与对应蛋白浓度代入Excel表格中，制作散点图，添加趋势线并得到线性方程：y＝kx+b(y：OD值，x：浓度)。标准曲线计算出后，根据测定出的样品的OD值，计算出所测样品的蛋白浓度。
蛋白煮样：根据计算出的蛋白浓度，调整电泳时的上样量(相同的质量/蛋白浓度)，控制蛋白上样量在20μl以下，20μl体系中包含蛋白体积+4μl Loading buffer，余下的以Lysis Buffer补足。根据蛋白的体积调整蛋白煮样的次数，配制多次上样量，混匀，低速短暂离心，于蛋白煮样器中100℃加热8min。冰上冷却，-20℃保存备用。
跑胶聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：
凝胶装置准备：将两块干净的玻璃板插入固定架上，置于注胶架上固定，构成一个凝胶腔，准备灌注分离胶。制备分离胶，常选用10％分离胶(配置10ml)，配制比例如下所示：
注入分离胶：于振荡器上混匀分离胶，沿玻璃板长的一侧将分离胶溶液加入到玻璃板夹层中，凝胶加入的高度为6cm左右时，预留出1.5cm高度，随后加入异丙醇压胶。静置40min至60min等待凝胶完全聚合。
配置浓缩胶(pH6.8，浓度4％)，配制比例如下所示：
倒掉异丙醇，ddH2O冲洗干净，滤纸吸干水分，振荡器上混匀浓缩胶后，立即加入到夹层中分离胶上面，加到顶端后停止，立即插入梳子，不要留下气泡，如果有气泡，轻轻晃动梳子赶出气泡。凝胶聚合需要30～40min。
加入样品：胶凝固后，将玻璃板夹到电泳架上并放入电泳槽中，电泳槽中加入的是提前放置在4℃预冷过的电泳缓冲液，确保电泳架内侧液体平面要比外侧液体平面高。取下齿梳，加入样品之前，最好用注射器将电玻璃板之间的空隙中存在的气泡排除。事先取出需要上样的蛋白样品，放置在冰上融化，混匀后低速离心机上离心。加样时采用微量加样器，于每孔加入10μl样品，还要在侧面的上样孔中加入5μl蛋白Marker，两边皆用1x的loadingbuffer补齐。
进行电泳：凝胶电泳实验中采用的是Bio-Rad电泳装置。正确连接电泳装置，打开电源，首先以80V电压电泳30min左右，然后调整电压至100V，溴酚蓝染料逐渐向下移动，待其接近分离胶底部时，停止电泳。
蛋白质转膜：准备好PVDF膜，将其放入无水甲醇中活化，时间约为1min，之后放入1×转膜液中。准备Bio-Rad蛋白转移装置夹板，取出玻璃板以及凝胶，按照蛋白Marker分子量提示切下目的条带，胶的尺寸要略小于PVDF膜，将凝胶放入转膜缓冲液中。将滤纸，海绵提前用转膜液浸润，按照海绵→滤纸→凝胶→PVDF膜→滤纸→海绵的顺序排列，放置在转移装置上，保证转移装置上红色与红色相对，黑色与黑色相对。依据根据目的蛋白不同的分子量，在50V～70V条件下，转膜1～3个小时，期间注意在转移槽内加入冰袋降温，还要将转移槽外置在碎冰中。接下来进行封闭及抗体孵育。
封闭：转膜完成后，取下PVDF膜，放入封闭液中，室温封闭2小时。用TBST(含0.05％Tween-20)洗膜3次，每次5min。封闭过的PVDF膜加入一抗2ml，4℃摇床，过夜封闭。(孵育比例TNF-α1：200；其他1：1000)。用TBST(含0.05％Tween-20)洗膜3次，每次5min。加入HRP标记的二抗(稀释度1：7500)，于室温条件下，孵育2h。取出PVDF膜，用TBST(含0.05％Tween-20)洗膜3次，每次10min。
显影及灰度分析结果：放置PVDF膜于ECL化学发光仪中，正面朝上，按照1：1的比例配置化学发光显影液，应用成像系统拍照保存图像，保存图片，并用Image J软件分析样本中目的蛋白的含量，以目的蛋白灰度值/β-actin条带灰度值反映最终结果。
3结果
3.1血糖波动导致内皮细胞损伤明显增加，激活内皮细胞炎性信号通路，EGCG能降低血糖波动导致的细胞损伤
3.1.1EGCG提高细胞活性
MTT试验显示：在高糖及血糖波动环境下给予EGCG浓度干预，EGCG浓度<25μM/L时，呈药物浓度依赖性的提高细胞活性，EGCG为25μM/L时，细胞存活率最高，当EGCG浓度再度升高时，细胞活性逐渐下降。结果见表5。
表5IHG组不同EGCG浓度时细胞吸光度(均数±标准差)
EGCG(μM/L) 0 12.5 25 50 100 200
IHG 0.42±0.14 0.43±0.19 0.48±0.19* 0.43±0.18* 0.39±0.23 0.22±0.14
IHG：血糖波动组；与EGCG浓度200μmol/L比较，*P<0.05。
3.1.2TLR4信号通路中炎性指标mRNA水平
血糖波动三天后测定细胞中mRNA水平，结果如图1所示，其中，NG表示正常血糖组，HG表示高糖组，IHG表示波动性高糖组，IHG+EGCG表示波动性高糖组+不同浓度EGCG干预组，*p<0.05表示各干预组与NG组之间比较。对细胞进行波动性高血糖干预后，VCAM-1(图1-B)、ICAM-1(图1-C)等水平较HG组升高，与NG组相比炎性因子的升高有明显的差异(p<0.05)，MCP-1(图1-A)只有在IHG组明显升高，较NG组相比有明显的差异，在不同EGCG浓度(6μM、25μM)干预后，皆能明显降低血糖波动环境下炎性因子的mRNA水平。
3.1.3TLR4信号通路炎性指标蛋白的水平
血糖波动三天后检测各组TLR4、p-p38蛋白磷酸化水平以及VCAM-1、FGF-21、TNF-α、MCP-1蛋白水平，结果如图2所示，其中NG表示正常血糖组，HG表示高糖组，IHG表示波动性高糖组，HG+EGCG表示持续高糖组+EGCG(25μM)干预组，IHG+EGCG表示波动高糖组+EGCG(25μM)干预组，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001均为各干预组与NG组之间比较。与NG组比较，HG组p-p38(图2-B)、VCAM-1(图2-C)、FGF-21(图2-F)及IHG组炎症代谢因子水平显著升高(P<0.05)，而IHG组比HG组升高更明显。TLR4(图2-A)、MCP-1(图2-E)及TNF-α(图2-D)均在IHG组中明显升高，表明相对于持续性高糖，血糖波动可明显导致HUVEC的损伤。加入EGCG干预后，IHG组各指标明显降低，与NG组无明显差异，表明EGCG可明显抑制血糖波动对内皮细胞的损伤。
3.2EGCG通过p38MAPK通路抑制血糖波动引起的炎症因子的升高
3.2.1不同浓度p38MAPK抑制剂对VCAM-1的影响
给予HG组HUVEC不同浓度p38MAPK抑制剂SB203580(0、2.5μM、10μM、40μM)干预3天后，收集细胞沉淀，探讨p-p38、VCAM-1蛋白水平的表达，结果如图3所示，其中*表示同对照组比较p<0.05。结果显示，p-p38、VCAM-1蛋白水平随SB203580浓度的升高而下降，即VCAM-1水平随p-p38水平的下降而下降，差异有统计学差异(p<0.05)，VCAM-1为p38MAPK通路的下游因子。
3.2.2p38MAPK通路抑制剂对血糖波动细胞中炎性因子的影响
对NG、HG、IHG三组HUVEC分别予以p38MAPK通路抑制剂SB203580(5μM)干预后，培养三天，提取细胞总蛋白进行Western blotting检测炎性因子的蛋白水平，结果如图4所示，其中**表示同NG组比较p<0.01，***表示同NG组比较p<0.001。结果显示：p38MAPK通路抑制剂SB203580可以抑制IHG组HUVEC中VCAM-1、MCP-1、p-p38的表达，但该抑制剂并未明显抑制HG及IHG中TNF-α的表达，表明高糖及血糖波动可激活HUVEC中p38MAPK通路，进而促进下游VCAM-1、MCP-1的合成和分泌，EGCG可通过抑制该通路进而抑制VCAM-1、MCP-1的合成和分泌。
3.3Tollip在EGCG保护HUVEC中的作用
3.3.1EGCG对IHG组HUVEC中Tollip的mRNA及蛋白的影响
NG、HG、IHG三组细胞及予以IHG组EGCG(12μM、25μM)干预三天后检测HUVEC中TollipmRNA水平(图5-B)，结果如图5所示，其中*p<0.05，***p<0.001均为EGCG干预与NG组相比较。结果显示：浓度为25μM的EGCG可以显著升高IHG组细胞中Tollip水平，Westernblotting检测HG组及IHG组中予以EGCG(25μM)干预后Tollip水平(图5-A)发现IHG组Tollip水平明显升高，即EGCG可升高血糖波动环境中HUVEC中Tollip的水平，提示EGCG可能是通过升高Tollip水平进而降低下游炎症因子的释放。
3.3.2Tollip转染效果
为进一步验证Tollip的作用，shRNA转染细胞，沉默Tollip蛋白，继续培养1天后荧光显微镜可见荧光效果(图6-A)，细胞转染3天后蛋白水平采用Western blotting检测(图6-B)，结果如图6所示，其中*表示与阴性对照组相比P<0.05，可见沉默组均较阴性对照组明显降低，且有显著差异(P<0.05)，提示质粒转染成功。
3.3.3Tollip转染对IHG组HUVEC炎性指标mRNA的影响
HUVEC沉默Tollip基因后，重新分组为NG、HG、IHG、HG+EGCG(25μM)、IHG+EGCG(25μM)，干预三天后的炎性因子水平如图7，其中*表示与NG组相比P<0.05。图中可见IHG组VCAM-1(图7-A)、TNF-α(图7-B)水平明显升高，可见Tollip在血糖波动组起着重要的作用，然而在EGCG干预组，EGCG仍可明显降低炎性因子的水平，该结果提示Tollip可能并非是EGCG降低炎性因子的唯一通路。
综上所述，EGCG对血糖波动导致内皮细胞的损伤有明显的保护作用。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (2)

1.EGCG在制备改善血糖波动导致的内皮细胞损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的EGCG在制备改善血糖波动导致的内皮细胞损伤药物中的应用，其特征在于，所述EGCG来源于绿茶。
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