CN109423524A - 一种特异性检出嗜酸乳杆菌的方法 - Google Patents

一种特异性检出嗜酸乳杆菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供一种基于ERIC‑PCR片段设计引物，特异性检出混合样品中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的方法。包括嗜酸乳杆菌基因组DNA的提取、ERIC‑PCR反应条件的优化、ERIC‑PCR片段的回收测序、特异性引物的设计，利用设计的特异性引物检出混合样品中微量嗜酸乳杆菌。所述特异性引物均基于ERIC‑PCR片段设计，并能特异性检出嗜酸乳杆菌，序列为MF30f，MF30r；MF31，MF31r；MF32f，MF32r。三对引物以嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板，分别扩增出520bp、354bp、208bp产物，特异性的检出混合样品中微量的嗜酸乳杆菌。

Description

一种特异性检出嗜酸乳杆菌的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种特异性检出嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)的方法。具体涉及利用ERIC-PCR方法，以嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板进行扩增反应，回收并得到三条DNA序列，依据回收的DNA序列设计引物，提供一种特异性检出嗜酸乳杆菌的方法。
背景技术：
嗜酸乳杆菌为乳杆菌属、革兰氏阳性菌，是人体小肠中主要益生菌，能产生多种有机酸和类细菌素等物质，而类细菌素等物质对动物肠道内革兰氏阳性和革兰氏阴性菌具有广谱抑制作用，其活菌已被广泛的添加在食品、保健品和药品中，因此从混合样品中特异性检出微量嗜酸乳杆菌具有重要实践意义。细菌基因组通常包含大量不同类型的重复序列，有些重复性序列在细菌基因组比例甚至可以超过10％。肠杆菌基因间重复一致序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus sequence，ERIC)广泛存在于肠杆菌科细菌基因组中，具有较强保守性，依据此重复性序列对细菌基因组进行扩增，可以产生DNA指纹图谱，并用于细菌分类鉴定。目前，对人体肠道中细菌的鉴别技术主要有随机扩增多态性DNA(random amplify polymorphic DNA,RAPD)技术和变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)技术，但二者均具有反应体系易污染、实验重复性差等缺点。ERIC-PCR技术本身具有操作简单、易重复等优势，ERIC-PCR在DNA指纹图谱技术中的广泛应用，使得细菌鉴别和分类有了更好依据。现有技术中，还没有使用ERIC-PCR特异性检出嗜酸乳杆菌的方法的相关报道。
发明内容：
本发明的目的在于：针对现有技术中，嗜酸乳杆菌在食品、保健品和药品中检出方法具有反应体系易污染、反应重复性差的缺点，提供一种简便、快捷、高灵敏的检出嗜酸乳杆菌的方法。
本发明提供的特异性检出嗜酸乳杆菌的方法，可通过如下的技术方案实现：
首先优化获得嗜酸乳杆菌ERIC-PCR反应条件，然后根据ERIC-PCR条件，以嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板，进行ERIC-PCR，回收DNA条带，连接T载体后进行测序分析，设计引物，用于嗜酸乳杆菌特异性检出。
具体步骤如下：
1)提取嗜酸乳杆菌基因组DNA，检测浓度，浓度为：900-1500ng/mL；
2)以嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板，优化ERIC-PCR反应条件，行嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板的ERIC-PCR反应；
3)将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将主条带进行琼脂糖凝胶DNA回收；
4)将琼脂糖凝胶DNA回收产物连接T载体后进行测序，利用BLAST分析工具进行测序结果分析；
5)基于测序结果进行引物设计，检测引物的特异性，检出嗜酸乳杆菌。
其中，
步骤1)中所述的嗜酸乳杆菌基因组DNA含量应占样品总DNA含量中的1％(绝对含量16ng/mL)以上。
步骤2)所述的ERIC-PCR反应条件，通过四因素三水平正交试验进行，筛选出了嗜酸乳杆菌最佳的ERIC-PCR体系：
所述的ERIC-PCR反应体系为：90-100℃预变性5-9min；90-98℃变性1-3min，40-50℃退火2-3min，61-68℃延伸5-10min，30个循环；72℃后延伸16min；DNA模板浓度100-400ng·mL-1，引物浓度20-50μmol·L-1，Mg2+浓度为2.0-5.0mmol·L-1。
步骤3)所述的琼脂糖凝胶电泳，方法是：采用0.8％琼脂糖凝胶进行分离，以Ethidium bromide(EB)进行染色，电泳缓冲液为1×TE，电压135V，时间23min。琼脂糖凝胶DNA回收采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行。
步骤4)所述的T载体为本领域技术领域常用的T载体，如T1载体或T5载体；
步骤4)连接T载体后所得的序列为SEQ ID No:1，SEQ ID No:2，SEQ ID No:3；
步骤5)中通过通用型引物扩增出的序列设计的引物为：
MF30f：5’-ATGGTCGTGTCAGTCTCCGA-3’)，
MF30r(5’-GTTCAACGGTCATCAAAGCAG-3’)；
MF31f(5’-GCCATTGATAAAGTTCCGCA-3’)，
MF31r(5’-GGATTCACGCCAACGGTAT-3’)；
MF32f(5’-AAACTGCGATAGACTTGGCG-3’)，
MF32r(5’-GGGATTCACGAACAATGGTG-3’)
所用的引物是通过通用型引物扩增出的序列，通用型引物为：
ERIC1r：5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’
ERIC2f：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’。
步骤5)中所述进行引物设计的软件为DNAMAN V6，以嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板，通过PCR反应检测引物设计结果；
所述的检测方法为：
将不同浓度的嗜酸乳杆菌基因组DNA与其他菌株基因组DNA混合，制成混合DNA模板，进行PCR反应，检测引物的特异性，用于嗜酸乳杆菌的特异性检出。
引物设计结果检验及引物特异性检验的PCR反应条件为：90-100℃预变性5-9min；90-98℃变性1-3min，40-50℃退火2-3min，61-68℃延伸5-10min，30个循环；72℃后延伸16min。
数次实验证明，优化后的ERIC-PCR条件，能以嗜酸乳杆菌基因组DNA稳定的进行ERIC-PCR反应，反应产物经过琼脂糖凝胶DNA回收后，可用作后续实验操作。设计的三对引物均可特异性的检出混合基因组DNA中微量的嗜酸乳杆菌基因组DNA。三条序列已经上传至GenBank数据库，接收序列号分别为MF503830、MF503831和MF503832。
目前，针对嗜酸乳杆菌，我们已完成三条ERIC-PCR DNA序列的测序，设计并合成了三对特异性引物，能在嗜酸乳杆菌基因组DNA浓度为16ng·mL-1以上时，通过PCR的方法，简单、快速检出嗜酸乳杆菌，缩短了检测周期、简化了操作步骤、提高了检测的重现性。优化后的ERIC-PCR反应条件，能以嗜酸乳杆菌基因组DNA稳定的进行ERIC-PCR反应。设计的三对引物，能在混合基因组中特异性检出嗜酸乳杆菌，简化了操作步骤，检测的灵敏度较高。因此，利用该方法进行嗜酸乳杆菌的检测具有重要的实践意义和广阔的市场前景。
附图说明：
图1正交试验优化ERIC-PCR反应条件，0.8％琼脂糖凝胶电泳图。
M：2K plusⅡDNA marker；CK：以等量ddH2O为模板的空白对照；1～9：对应正交表中实验组1～9实验组
图2以嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板，检验引物设计结果，0.8％琼脂糖凝胶电泳图。
M：2K plusⅡDNA marker；CK：MF30rf、MF31rf、MF32rf为引物，ddH2O为模板的空白对照；
1：MF30rf为引物、嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板PCR结果；2：MF31rf为引物、嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板PCR结果；3：MF32rf为引物、嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板PCR结果。
图3以混合基因组DNA为模板，检验设计引物的特异性，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。
M：2K plusⅡDNA marker；1,4,7,10,13；
以MF30rf为引物，嗜酸乳杆菌基因组DNA模板相对质量含量分别为相对质量含量为100％(绝对含量1.6μg·mL-1)，30％(绝对含量480ng·mL-1)，10％(绝对含量160ng·mL-1)，1％(绝对含量16ng·mL-1)，0％(绝对含量0ng·mL-1)；2,5,8,11,14；
以MF31rf为引物，嗜酸乳杆菌基因组DNA模板相对质量含量分别为相对质量含量为100％(绝对含量1.6μg·mL-1)，30％(绝对含量480ng·mL-1)，10％(绝对含量160ng·mL-1)，1％(绝对含量16ng·mL-1)，0％(绝对含量0ng·mL-1)；3,6,9,12,15；
以MF31rf为引物，嗜酸乳杆菌基因组DNA模板相对质量含量分别为相对质量含量为100％(绝对含量1.6μg·mL-1)，30％(绝对含量480ng·mL-1)，10％(绝对含量160ng·mL-1)，1％(绝对含量16ng·mL-1)，0％(绝对含量0ng·mL-1)。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限制。
如下实施例中：
T载体型号为T5Simple Cloning Vector(北京全式金生物技术有限公司)，
BLAST在线分析工具网址为：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。
实施例1嗜酸乳杆菌基因组DNA的提取和纯化
1)嗜酸乳杆菌基因组DNA的提取
挑取嗜酸乳杆菌单菌落接种于MRS平板上，37℃厌氧培养3天，刮取少量菌体于EP管中，加入480μL1×TE及20μL浓度为50mg·mL-1的溶菌酶，37℃振摇孵育14-16h；加入50μL20％SDS及5μL浓度为20mg·mL-1蛋白酶K，轻轻震匀1min，55℃水浴60min，每10min拿出轻轻震荡；加入550μL苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，混匀，12000r·min-1，离心10min，将上清转移到另一试管中，重复抽提一次；加入800μL无水乙醇，80μL 3mol·L-1乙酸钠，室温放置20min；12000r·min-1离心10min，弃上清，加入200μL70％无水乙醇，轻摇洗盐，12000r·min-1离心5min，弃乙醇；37℃干燥后加入50μL 1×TE溶解DNA，-20℃保存备用；
2)嗜酸乳杆菌基因组DNA的纯化
取200μL提取的DNA，用1×TE定容至500μL；加入15μL10mg·mL-1RNaseA，混匀，37℃振摇1h，等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提2次；等体积氯仿抽提1次；2倍体积乙醇沉淀基因组DNA，12000r·min-1离心5min弃乙醇；加入200μL70％乙醇，轻摇洗盐，离心弃乙醇，无菌ddH2O溶解，取少量纯化的嗜酸乳杆菌基因组DNA进行DNA浓度和质量检测，-20℃保存备用。
实施例2嗜酸乳杆菌ERIC-PCR反应条件的优化
1)ERIC-PCR引物合成
由金唯智公司合成ERIC-PCR引物。
ERIC1r：5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’
ERIC2f：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’
将合成的引物粉末短暂离心后，加入无菌ddH2O，配置成适当浓度的工作溶液。
2)ERIC-PCR反应条件的优化
对ERIC-PCR反应条件中退火温度，DNA模板浓度、引物浓度以及Mg2+的浓度进行优化，比较不同反应条件下的扩增结果，以确定嗜酸乳杆菌ERIC-PCR的最佳反应条件。
反应体系为95℃预变性7min；94℃变性1min，45℃退火1min，65℃延伸5-10min，30个循环；72℃后延伸16min。反应结束后取5μL PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，见图1，进行最有条件的筛选。
实施例3 ERIC-PCR片段回收
将ERIC-PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，对目标片段进行胶回收，将单一的DNA条带从琼脂糖凝胶上切下，放入干净EP管中，加入Buffer PG，50℃水浴使凝胶充分溶解；将凝胶的溶解液冷却至室温后，加入经过柱平衡的吸附柱中，13000rpm·min-1离心1min，弃废液；向吸附柱中加入450μL Buffer PW，13000rpm·min-1离心1min，弃废液；13000rpm·min-1离心1min，除去残留的乙醇，弃废液；将吸附柱放在一个新的1.5mL EP管中，悬空滴加50μL Buffer EB，室温放置2min，13000rpm·min-1离心1min，收集溶液，即为回收的ERIC-PCR片段。取5μL胶回收产物，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳验证。
实施例4 ERIC-PCR片段连接T5载体测序
取4μL回收的胶回收产物于1.5mL无菌EP管中，加入1μL T5载体，16℃连接14h；向EP管中加入50μL感受态细胞，轻混，冰浴30min，42℃热击90s，冰置2min；向EP管中加入250μL液体LB培养基，37℃，200rpm·min-1复活60min；取100μL复活菌液涂布于抗性LB平板(含卡那霉素，30μg·mL-1)上，37℃倒置培养14h；挑取平板上的单菌落于抗性液体LB培养基(含卡那霉素，30μg·mL-1)中，37℃，200rpm·min-1培养6h；以M13RF引物进行普通PCR验证；将阳性克隆提取质粒送金唯智公司测序。现已将3条片段的测序结果已经上传到GenBank数据库，GenBank序列号分别是：847bp片段MF503830，459bp片段MF503831，310bp片段MF503832。
实施例5针对测序结果设计特异性引物
根据测序结果，利用DNAMAN V6软件(http://www.lynnon.com/)设计对应片段的特异性引物，针对三条片段设计的特异性引物分别为：
MF30f(5’-ATGGTCGTGTCAGTCTCCGA-3’)，
MF30r(5’-GTTCAACGGTCATCAAAGCAG-3’)；
MF31f(5’-GCCATTGATAAAGTTCCGCA-3’)，
MF31r(5’-GGATTCACGCCAACGGTAT-3’)；
MF32f(5’-AAACTGCGATAGACTTGGCG-3’)，
MF32f(5’-GGGATTCACGAACAATGGTG-3’)。
由软件预测可知，由三对特异性引物进行PCR后，序列长度分别为520bp、354bp、208bp。
实施例6引物设计检验
以嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板，分别以实施例5中三对引物进行PCR反应，反应条件为反应过程为94℃预变性10min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，30个循环；72℃后延伸10min。将PCR反应产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。
实施例7引物特异性检验
选取七株细菌：婴儿双歧杆菌，鼠李糖乳杆菌，短乳杆菌，戊糖乳杆菌，植物乳杆菌，类布氏乳杆菌以及大肠杆菌作为阴性对照。按照实施例1中步骤(1)的方法分别提取基因组DNA。取上述七株细菌等浓度的基因组DNA溶液，等量混合，制得七株细菌的混合DNA溶液，并使混合基因组DNA浓度与嗜酸乳杆菌SYP-B2340基因组DNA浓度相等。将嗜酸乳杆菌基因组DNA添加至混合基因组DNA中，配制嗜酸乳杆菌基因组DNA相对质量含量为100％(绝对含量1.6μg·mL-1)，30％(绝对含量480ng·mL-1)，10％(绝对含量160ng·mL-1)，1％(绝对含量16ng·mL-1)，0％(绝对含量0ng·mL-1)的混合DNA模板，以设计的特异引物，进行PCR反应，检验引物的特异性。反应过程为94℃预变性10min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，30个循环；72℃后延伸10min。反应结束后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。
序列表
<110> 沈阳药科大学
<120> 一种特异性检出嗜酸乳杆菌的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 847
<212> DNA
<213> Lactobacillus acidophilus
<400> 1
aagtaagtga ctggggtgag cgcttggcaa ttgttgccaa ggtgatcgtg gatgtgccca 60
cgatgcaaac agatcgaccg tttgattatc ttgtacctgc gcgcttagaa ggcgctttgc 120
aggcgggaat gcgggtctgg gtccagtttg gcaaaggcgc gcgaaaagta agcggcatgg 180
tcgtgtcagt ctccgaccaa agcgactatg acggtcaatt gaaacccttg ctagatgtcc 240
ttgatccggc ccccgttttg gaccacgaat tattaaagct atcgaagtgg ttggcgcaaa 300
caacgtattc tttttggatt gcgtgcatgc agacgatgtt gccaactatg ttgaaaatcg 360
atgcggtaaa agttgctgaa ccggttaagc tgtcggctga tgagcaacaa aaatactttg 420
ggacggctga cagtctggcg atcggtagcc tgaacgctga acagcaagtt gcagtgatga 480
aattggcgca agcaggtaaa gttgctattt catatttaaa aaaggatcgt gctcgggtta 540
aaaaagtctt ttacttgatc ccgcaattat catcggagca agcggctgct gagcgtgaac 600
acgtgcgtaa aaacgccgcc aagcaactta aactgttaac tttaattggt gaatggactg 660
ctaacaatca gcatcctgct ttgatgaccg ttgaacatca atatggcctg acaaagccgg 720
tgattaatca ggcagtcgaa aaaggctggc tgaagcttga aggccacgag acttaccgcg 780
atccttatcc ggaactgcaa catcaaccgt tgacgaagcc gttgccgctc accccagtca 840
cttactt 847
<210> 2
<211> 459
<212> DNA
<213> Lactobacillus acidophilus
<400> 2
aagtaagtga ctggggtgag cgtgccgaag tgattgttga ttttggccaa taccatgaag 60
gcgacgaggt caccttatat acggatgatg tgccattgat aaagttccgc attcatgcgt 120
tcaaaccgga tcagacaact ttgcctgata agttgttcga cgtgaaggcg cctgtggttg 180
atccggcttt gccagttcgc catgttgtga tgcaggggat ggacgaaggt gttgcgattg 240
acggtaaaaa gttcgccatg cagcggattg atgccacgca gccaattggc aaagcccagt 300
actgggatgt taccaatagc aatgatgcgc ctggaatggt tcatccattc catgtgcatg 360
gaacccaatt cttagtcttg tcgcggaatg ggcatgcgcc gtatccaaat gaacatggtt 420
tcaaagatac cgttggcgtg aatccccagg agcttacat 459
<210> 3
<211> 310
<212> DNA
<213> Lactobacillus acidophilus
<400> 3
aagtaagtga ctggggtgag cgggctgaaa agccgtcaat cagctttgga attgccgcaa 60
taatcaagac tgcagctacg atccagagaa aactgcgata gacttggcgc ggtgcgatta 120
aaatccaggc accgattaaa atcatcagca aaccgcgcag ccatgaccaa cgttgaagac 180
gatcaaacat tgtttgcatt ttttaggctc ctttgttttg ctaacttaac catagcatac 240
ggtgagttat ttcccctccg tcgtcagact gaactttcac cattgttcgt gaatccccag 300
gagcttacat 310

Claims (10)

1.如SEQ ID：1-3所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的SEQ ID：1-3的核苷酸序列的引物，其特征在于，所述的引物为：
MF30f：5’-ATGGTCGTGTCAGTCTCCGA-3’)，
MF30r(5’-GTTCAACGGTCATCAAAGCAG-3’)；
MF31f(5’-GCCATTGATAAAGTTCCGCA-3’)，
MF31r(5’-GGATTCACGCCAACGGTAT-3’)；
MF32f(5’-AAACTGCGATAGACTTGGCG-3’)，
MF32r(5’-GGGATTCACGAACAATGGTG-3’)。
3.一种特异性检出嗜酸乳杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)提取嗜酸乳杆菌基因组DNA，检测浓度，浓度为：900-1500ng/mL；
2)以嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板，优化ERIC-PCR反应体系，行嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板的ERIC-PCR反应；
3)将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，将主条带进行琼脂糖凝胶DNA回收；
4)将琼脂糖凝胶DNA回收产物连接T载体后进行测序，利用BLAST分析工具进行测序结果分析；
5)基于测序结果进行引物设计，检测引物的特异性，检出嗜酸乳杆菌。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中ERIC-PCR反应体系为：90-100℃预变性5-9min；90-98℃变性1-3min，40-50℃退火2-3min，61-68℃延伸5-10min，30个循环；72℃后延伸16min；DNA模板浓度100-400ng·mL-1，引物浓度20-50μmol·L-1，Mg2+浓度为2.0-5.0mmol·L-1。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述琼脂糖凝胶电泳的方法是：采用0.8％琼脂糖凝胶进行分离，染色剂为Ethidium bromide，电泳缓冲液采用1×TE，电压135V，时间23min。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的T载体型号为T5载体。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4)中连接T载体后获得的序列如SEQ ID：1-3所示。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤5)中的引物为：
MF30f(5’-ATGGTCGTGTCAGTCTCCGA-3’)，
MF30r(5’-GTTCAACGGTCATCAAAGCAG-3’)；
MF31f(5’-GCCATTGATAAAGTTCCGCA-3’)，
MF31r(5’-GGATTCACGCCAACGGTAT-3’)；
MF32f(5’-AAACTGCGATAGACTTGGCG-3’)，
MF32r(5’-GGGATTCACGAACAATGGTG-3’)。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤5)的方法为：将不同浓度的嗜酸乳杆菌基因组DNA与其他菌株基因组DNA混合，制成混合DNA模板，进行PCR反应，检测引物的特异性，所述PCR反应条件为：以嗜酸乳杆菌基因组DNA为模板，反应条件为94-98℃预变性10-15min；94-98℃变性40-60s，55-60℃退火40-60s，72-76℃延伸90-100s，30个循环；72℃后延伸10min。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤5)中检出嗜酸乳杆菌基因组DNA的检测限为16ng·mL-1。
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