CN109415698A - 工程化Treg细胞 - Google Patents
工程化Treg细胞 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109415698A CN109415698A CN201780037655.8A CN201780037655A CN109415698A CN 109415698 A CN109415698 A CN 109415698A CN 201780037655 A CN201780037655 A CN 201780037655A CN 109415698 A CN109415698 A CN 109415698A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- regulatory
- treg
- foxp3
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 348
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 67
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims abstract description 51
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 283
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 102
- 108010029477 STAT5 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 96
- 102000001712 STAT5 Transcription Factor Human genes 0.000 claims description 96
- 102000000887 Transcription factor STAT Human genes 0.000 claims description 48
- 108050007918 Transcription factor STAT Proteins 0.000 claims description 48
- 230000037011 constitutive activity Effects 0.000 claims description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 46
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 25
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 25
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 21
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 19
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 17
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 16
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 claims description 6
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 claims description 3
- 101000617830 Homo sapiens Sterol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 claims 6
- 102100021993 Sterol O-acyltransferase 1 Human genes 0.000 claims 6
- 101000697584 Streptomyces lavendulae Streptothricin acetyltransferase Proteins 0.000 claims 6
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 claims 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 59
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 57
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 45
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 32
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 abstract description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 165
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 129
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 99
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 99
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 98
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 93
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 93
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 62
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 60
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 60
- 230000006870 function Effects 0.000 description 49
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 48
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 44
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 43
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 42
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 41
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 39
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 37
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 36
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 36
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 35
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 28
- 230000004044 response Effects 0.000 description 28
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 26
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 25
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 25
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 22
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 21
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 21
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 20
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 19
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 19
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 18
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 17
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 17
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 17
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 16
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 15
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 15
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 14
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 13
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 12
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 11
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 description 11
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 11
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 10
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 10
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 9
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 9
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 9
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 9
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 8
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 8
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 7
- 101150055020 Il2rb gene Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 7
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 7
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 6
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 6
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 6
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 6
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 6
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 6
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 6
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 6
- 210000001986 peyer's patch Anatomy 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 6
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 101001046687 Homo sapiens Integrin alpha-E Proteins 0.000 description 5
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 102100022341 Integrin alpha-E Human genes 0.000 description 5
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 5
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 5
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 description 5
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 4
- 102000015617 Janus Kinases Human genes 0.000 description 4
- 108010024121 Janus Kinases Proteins 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 4
- 150000002338 glycosides Chemical group 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 101000971533 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 3
- 101150029684 IL2RA gene Proteins 0.000 description 3
- 102100021457 Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Human genes 0.000 description 3
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 201000001322 T cell deficiency Diseases 0.000 description 3
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 3
- JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N brefeldin-A Natural products CC1CCCC=CC2(C)CC(O)CC2(C)C(O)C=CC(=O)O1 JUMGSHROWPPKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- ZDTFMPXQUSBYRL-UUOKFMHZSA-N 2-Aminoadenosine Chemical compound C12=NC(N)=NC(N)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O ZDTFMPXQUSBYRL-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000033399 Anaphylactic responses Diseases 0.000 description 2
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 2
- 101150017888 Bcl2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150086017 Bcl2l11 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 201000004029 Immune dysregulation-polyendocrinopathy-enteropathy-X-linked syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010017535 Interleukin-15 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000004556 Interleukin-15 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 101150058731 STAT5A gene Proteins 0.000 description 2
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 2
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 2
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 2
- 230000004736 colon carcinogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- -1 desoxyadenossine Chemical compound 0.000 description 2
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 2
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 2
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000003012 network analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- RIFDKYBNWNPCQK-IOSLPCCCSA-N (2r,3s,4r,5r)-2-(hydroxymethyl)-5-(6-imino-3-methylpurin-9-yl)oxolane-3,4-diol Chemical compound C1=2N(C)C=NC(=N)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O RIFDKYBNWNPCQK-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- PISWNSOQFZRVJK-XLPZGREQSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methyl-2-sulfanylidenepyrimidin-4-one Chemical compound S=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 PISWNSOQFZRVJK-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEHOMUNTZPIBIL-UUOKFMHZSA-N 6-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-7h-purin-8-one Chemical compound O=C1NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O UEHOMUNTZPIBIL-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- HCAJQHYUCKICQH-VPENINKCSA-N 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2NC(=O)N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HCAJQHYUCKICQH-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical group CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004804 Adenomatous Polyps Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 1
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 210000005236 CD8+ effector T cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- NYNKCGWJPNZJMI-UHFFFAOYSA-N Clebopride malate Chemical compound [O-]C(=O)C(O)CC(O)=O.COC1=CC(N)=C(Cl)C=C1C(=O)NC1CC[NH+](CC=2C=CC=CC=2)CC1 NYNKCGWJPNZJMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 1
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 1
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 description 1
- 208000001034 Frostbite Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 208000007465 Giant cell arteritis Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 108010066719 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000018682 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Human genes 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 244000134336 Malus baccata Species 0.000 description 1
- 235000005079 Malus baccata Nutrition 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100120552 Mus musculus Foxp3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023302 Myelin-oligodendrocyte glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000002481 Myositis Diseases 0.000 description 1
- KCTZOTUQSGYWLV-UHFFFAOYSA-N N1C=NC=C2N=CC=C21 Chemical compound N1C=NC=C2N=CC=C21 KCTZOTUQSGYWLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 244000131316 Panax pseudoginseng Species 0.000 description 1
- 208000007048 Polymyalgia Rheumatica Diseases 0.000 description 1
- 208000007541 Preleukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010081691 STAT2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004265 STAT2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010019992 STAT4 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000005886 STAT4 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 101150063267 STAT5B gene Proteins 0.000 description 1
- 102000013968 STAT6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010011005 STAT6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100029904 Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta Human genes 0.000 description 1
- 102100024040 Signal transducer and activator of transcription 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100024481 Signal transducer and activator of transcription 5A Human genes 0.000 description 1
- 102100024474 Signal transducer and activator of transcription 5B Human genes 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000020385 T cell costimulation Effects 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000068 Th17 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 208000004631 alopecia areata Diseases 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000739 chaotic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002561 chemical irritant Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 201000003146 cystitis Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 125000002897 diene group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009274 differential gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000000375 direct analysis in real time Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000005315 distribution function Methods 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012063 dual-affinity re-targeting Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003372 endocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000010201 enrichment analysis Methods 0.000 description 1
- 208000037902 enteropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010856 establishment of protein localization Effects 0.000 description 1
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000009432 framing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010199 gene set enrichment analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000037219 healthy weight Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000034435 immune system development Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000006759 inflammatory activation Effects 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008944 intestinal immunity Effects 0.000 description 1
- 210000005206 intestinal lamina propria Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 201000001268 lymphoproliferative syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004879 molecular function Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000021368 organ growth Effects 0.000 description 1
- 238000009400 out breeding Methods 0.000 description 1
- 230000015031 pancreas development Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- GJVFBWCTGUSGDD-UHFFFAOYSA-L pentamethonium bromide Chemical compound [Br-].[Br-].C[N+](C)(C)CCCCC[N+](C)(C)C GJVFBWCTGUSGDD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000001297 phlebitis Diseases 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Chemical group 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- XOIQMTLWECTKJL-HXPDMXKUSA-M sodium;(3r,4s)-4-[(2s,5r,7s,8r,9s)-2-[(2r,5s)-5-ethyl-5-[(2r,3s,5r)-5-[(2s,3s,5r,6r)-6-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-3,5-dimethyloxan-2-yl]-3-methyloxolan-2-yl]oxolan-2-yl]-7-hydroxy-2,8-dimethyl-1,10-dioxaspiro[4.5]decan-9-yl]-3-methoxy-2-methylpentanoate Chemical compound [Na+].C([C@@](O1)(C)[C@H]2CC[C@@](O2)(CC)[C@H]2[C@H](C[C@@H](O2)[C@@H]2[C@H](C[C@@H](C)[C@](O)(CO)O2)C)C)C[C@@]21C[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H]([C@@H](C)[C@@H](OC)C(C)C([O-])=O)O2 XOIQMTLWECTKJL-HXPDMXKUSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N sulfluramid Chemical group CCNS(=O)(=O)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010043207 temporal arteritis Diseases 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 206010044008 tonsillitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000012762 unpaired Student’s t-test Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明尤其提供了用于调控或治疗炎性和自身免疫性疾病、病症和病状的方法和组合物。本发明部分地基于令人惊讶的发现,即特征在于组成型STAT活性的工程化调节性T细胞在治疗疾病方面是有效的。
Description
政府支持
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的CA008748、AI034206和GM07739下由政府支持进行的。美国政府享有本发明的一定权利。
背景技术
随着在免疫系统理解上的进步,出现了用于治疗学的另外途径。存在对鉴定新颖的使用免疫系统治疗疾病的组合物和治疗方法的需求。
发明内容
本披露涵盖如下认识:可以开发新颖的疗法以通过将免疫系统的细胞工程化来治疗疾病、病症或病状。在一些实施例中,本披露认识到一些疾病、病症或病状,例如,炎性和自身免疫性疾病,可能是过度活跃的或自身反应性免疫系统的结果。在一些实施例中,本披露认识到调节性T细胞(Treg)可以是调节过度活跃的和/或自身反应性免疫系统的有用工具。在一些实施例中,本披露涉及将Treg细胞工程化以治疗疾病、病症或病状,例如炎性和自身免疫性疾病。在一些实施例中,本披露认识到将Treg细胞工程化为不依赖于对用于刺激的IL-2信号传导的需要可以提供用于治疗炎性和自身免疫性疾病的新颖治疗剂。
在一些实施例中,本披露涉及工程化调节性T细胞,其特征在于组成型STAT活性。在一些实施例中,本披露提供了表达组成型活性STAT蛋白的工程化Treg细胞。在一些实施例中,组成型活性STAT蛋白是磷酸化蛋白质(例如,组成型磷酸化蛋白质)。在一些实施例中,如本文所述的Treg细胞被工程化以组成型地表达STAT蛋白。在一些实施例中,如本文所述的Treg细胞被工程化以组成型地活化STAT蛋白(例如,通过将STAT蛋白从非活性形式组成型地转变为活性形式,例如,通过磷酸化作用)。在一些实施例中,在相当的条件下与适当的参考Treg细胞(例如,其他相当的缺少相关工程化的Treg细胞)相比,特征在于组成型STAT活性的工程化Treg细胞含有更高和/或时间上更一致的水平和/或活性的特定STAT蛋白,或其活性形式。
在一些实施例中,如本文所述的特征在于组成型STAT活性的工程化Treg细胞还表达嵌合抗原受体。可替代地或另外地,在一些实施例中,如本文所述的特征在于组成型STAT活性的工程化Treg细胞还表达内源性T细胞受体。
在一些实施例中,本披露提供了用于治疗一种或多种疾病、病症或病状的技术。在一些具体的实施例中,本披露涉及炎性或自身免疫性疾病的治疗。
在一些实施例中,本披露提供了包括以下步骤的方法,将从患者样品获得的一个或多个Treg细胞工程化以在工程化Treg细胞中实现组成型STAT活性(例如,如与其他相当的缺少工程化的Treg细胞相比)。在一些实施例中,如本文所述的治疗方法可以是或包括给予如本文所述的工程化Treg细胞(即,特征在于组成型STAT活性的工程化Treg细胞)。
附图说明
图1,包括图片(a)到(j),证明IL-2Rβ对于Treg细胞功能是不可缺少的。图片(a)示出了5周龄Foxp3CreIl2rbfl/wt和Foxp3CreIl2rbfl/fl小鼠的所示器官的组织病理学。比例尺,100μm。示出了分析的5只相对于5只小鼠的代表性图像。图片(b)示出了5周龄Foxp3CreIl2rbfl/wt和Foxp3CreIl2rbfl/fl小鼠的淋巴结(LN)细胞性。图片(c)示出了对用抗CD3/CD28刺激5小时的5周龄Foxp3CreIl2rbfl/wt和Foxp3CreIl2rbfl/fl小鼠的脾CD4+Foxp3-细胞的细胞因子产生的流式细胞术分析。图片(d)示出了对来自Foxp3CreIl2rbfl/wt(蓝色)和Foxp3CreIl2rbfl/fl(红色)小鼠的CD4+Foxp3+细胞的所示IL-2R亚基的细胞表面表达的流式细胞术分析。示出了分析的5只相对于5只小鼠的代表性图像。图片(e)示出了对IL-2Rβ缺陷型Treg细胞中STAT5磷酸化的流式细胞术分析。将来自Foxp3CreIl2rbfl/wt(蓝色)和Foxp3CreIl2rbfl/fl(红色)小鼠的脾细胞在重组鼠类IL-2(rmIL-2;1,000U/ml)存在或不存在下培养20min,并且通过流式细胞术分析CD4+YFP+(Foxp3+)细胞中酪氨酸磷酸化的STAT5的细胞内水平。示出了分析的5只相对于5只小鼠的代表性图像。图片(f)示出了对5周龄Foxp3CreIl2rbfl/wt和Foxp3CreIl2rbfl/fl小鼠LN中CD3+CD4+细胞中Treg细胞的频率(左图)和Foxp3表达水平(MFI:平均荧光强度)(右图)的流式细胞术分析。图片(g)示出了对健康的杂合雌性Foxp3Cre/wtIl2rbfl/wt和Foxp3Cre/wtIl2rbfl/fl小鼠中Treg细胞的代表性流式细胞术分析。分析从所示器官分离的细胞的Foxp3和YFP表达。YFP(Cre)表达和细胞内Foxp3染色鉴定出具有或不具有YFP-Cre表达的Treg细胞。示出了对于CD3+CD4+细胞的门控。图片(h)示出了在3周龄杂合雌性Foxp3Cre/wtIl2rbfl/wt(黑色)和Foxp3Cre/wtIl2rbfl/fl(红色)小鼠的所示器官中CD3+CD4+细胞中Foxp3+细胞的频率(上方图片)和Foxp3+细胞中Cre表达细胞的频率(下方图片)。图片(i)示出了在3周龄Foxp3Cre/wtIl2rbfl/wt(黑色)和Foxp3Cre/wtIl2rbfl/fl(红色)小鼠的所示器官中YFP-Foxp3+(上方图片)和YFP+Foxp3+(下方图片)细胞中的Foxp3表达水平(MFI)。图片(j)示出了在3周龄Foxp3Cre/wtIl2rbfl/wt(黑色)和Foxp3Cre/wtIl2rbfl/fl(红色)小鼠的所示器官中所示标志物的表达水平(MFI)和YFP+Foxp3+细胞中CD103+细胞的频率。
图2,包括图片(a)到(k),证明在STAT5的组成型活性形式存在下IL-2R缺陷型Treg细胞的抑制活性恢复。图片(a)示出了靶向构建体的示意图。图片(b)示出了在条件型ROSA26Stat5bCA转基因表达后,对Foxp3CreIl2rbfl/fl小鼠的消耗性疾病的挽救。在4周龄时分析小鼠。示出了分析的多于10只Foxp3CreIl2rbfl/fl相对于10只Foxp3CreIl2rbfl/flROSA26Stat5bCA小鼠的代表性照片。图片(c)示出了CD3+CD4+细胞中Foxp3+细胞的频率和在CD3+CD4+Foxp3+细胞上CD122和CD25的表达水平。数据代表两次独立的实验。图片(d)示出了对Treg细胞中STAT5磷酸化的流式细胞术分析。将从所示小鼠中分离的LN细胞未用rmIL-2刺激(unstim)或用rmIL-2(1,000U/ml)刺激20min,并且分析CD4+YFP+(Foxp3+)细胞中酪氨酸磷酸化STAT5的细胞内水平。数据代表两次独立的实验。图片(e)示出了在ROSA26Stat5bCA转基因存在下,对Foxp3CreIl2rafl/fl小鼠的消耗性疾病的挽救。在4周龄时分析小鼠。示出了分析的多于10只Foxp3CreIl2rafl/fl相对于10只Foxp3CreIl2rafl/fl ROSA26Stat5bCA小鼠的代表性照片。图片(f)示出了体外IL-2捕获测定。将来自所示小鼠的GFP(YFP)+Treg细胞和GFP(YFP)-非Treg细胞分选,并与重组人类IL-2(hIL-2)一起培养2小时。使用基于流式细胞术的珠粒阵列分析测量2小时后培养基中残余hIL-2的量,并以百分值显示出。示出了两次独立的实验的代表性数据。图片(g)示出了如通过流式细胞术测定的2周龄小鼠LN中的CD3+CD4+Foxp3-CD44hi,、CD44hi、CD3+CD8+CD62LloCD44hi和CD3+CD8+CD62LhiCD44hi细胞的细胞数目。Foxp3CreIl2rbwt//wt(黑色)、Foxp3CreIl2rbfl/fl(红色)和Foxp3CreIl2rbfl/ flROSA26Stat5bCA(蓝色)。数据代表两次独立的实验。图片(h)示出了如通过流式细胞术测定的在所示小鼠LN中CD3+CD4+Foxp3-和CD3+CD8+Foxp3-细胞中初始(CD62LhiCD44lo)细胞的频率(左侧两个图片)以及CD44hi活化的CD3+CD4+Foxp3-和CD3+CD8+Foxp3-细胞的细胞数目(右侧两个图片)。从出生后7天开始,用抗IL-2中和抗体或对照IgG治疗小鼠2周。示出了两次独立的实验的代表性数据。图片(i)示出了对IL-2R充足型Treg细胞和IL-2R缺陷型Treg细胞抑制初始的和活化的/记忆CD4+和CD8+T细胞扩增的能力的分析。从野生型(Foxp3Cre)小鼠中分选CD4+Foxp3-CD62LhiCD44lo(CD4初始)、CD8+Foxp3-CD62LhiCD44lo(CD8初始)和CD8+Foxp3-CD62LhiCD44hi(CD8记忆)T细胞,并将这些T细胞连同从所示小鼠中单独分选的Treg细胞(2×105个细胞)过继转移(各自1×106个细胞)到T细胞缺陷型(Tcrb-/-Tcrd-/-)小鼠中。示出了转移后3周受体中的CD4+Foxp3-和CD8+Foxp3-T细胞数目。图片(j)示出了对表达STAT5的组成型活性形式的CD4+和CD8+T细胞对Treg介导的抑制的易感性的分析。从Foxp3CreROSA26Stat5bCA小鼠中分选CD4+Foxp3-和CD8+Foxp3-T细胞,并用TAT-Cre重组酶体外处理以诱导非Treg CD4+和CD8+T细胞中的STAT5bCA表达。对于两种细胞亚群重组效率是大约30%。在不伴有Treg细胞(红色条)或伴有2×105个分别从Foxp3Cre或Foxp3CreROSA26Stat5bCA小鼠中分选的对照(黑色条)或表达STAT5bCA的Treg细胞(蓝色条)的情况下,将处理的CD4+Foxp3-和CD8+Foxp3-T细胞(各自1×106个细胞)一起转移至T细胞缺陷型(Tcrb-/-Tcrd-/-)受体中。转移后3周分析这些受体。示出了在总CD4+和CD8+效应T细胞亚群内表达STAT5bCA的CD4+和CD8+Teff细胞的频率。图片(k)示出了在(j)中所描述的受体小鼠中产生IFNγ的CD4+和CD8+T细胞的数目。作为对照,将从Foxp3CreROSA26WT(WT)小鼠中分选的CD4+Foxp3-和CD8+Foxp3T细胞类似地用膜可渗透性TAT-Cre蛋白处理,并在伴有或不伴有Treg细胞下转移以评估非表达STAT5bCA的效应T细胞对Treg介导的抑制的易感性(空心条)。下方两个图是以根据相同数据集计算的%示出的。数据代表两次独立的实验。每个点代表单只小鼠。误差条指示平均值+/-S.E.M(c、d、g、h、i、j、k)。
图3,包括图片(a)到(g),表达STAT5的组成型活性形式的证明Treg细胞的增殖和抑制活性增加。图片(a)显示,通过流式细胞术测定在所示器官中CD3+CD4+细胞中Foxp3+细胞的频率(上图)和CD3+CD4+Foxp3+细胞中Foxp3的表达水平(下图)。Sp:脾,SILPL:小肠固有层淋巴细胞。示出了两次独立的实验的代表性数据。图片(b)示出了对脾细胞的代表性流式细胞术分析,显示出Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠的CD4+T细胞中CD25hiFoxp3hi群体的增加。图片(c)示出了对Foxp3Cre-ERT2和Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠中脾Treg细胞的代表性流式细胞术分析。针对CD62L、CD44、KLRG-1、ICOS、CTLA-4和GITR将细胞染色。图片(d)示出了针对所示小鼠中所示标志物的表达水平对脾Treg细胞的流式细胞术分析。示出了两次独立的实验的代表性数据。图片(e)示出了对Foxp3Cre-ERT2和Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠中脾CD3+CD4+Foxp3-(上方图片)和CD3+CD8+Foxp3-(下方图片)细胞的代表性流式细胞术分析。图片(f)示出了对所示小鼠的LN中CD80和CD86在DC(CD11c+MHC IIhi类)和B细胞(B220+CD11c-)上的表达的流式细胞术分析。示出了两次独立的实验的代表性数据。图片(g)示出了如通过ELISA测定的所示小鼠中血清和粪便IgA水平。单一他莫昔芬(tamoxifen)治疗三个月后分析Foxp3Cre-ERT2(黑色点)和Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA(蓝色点)小鼠。每个点代表单只小鼠。误差条指示平均值+/-S.E.M(a、d、f、g)。
图4,包括图片a到e,展示了表达STAT5的组成型活性形式的Treg细胞的有效抑制功能。图片(a)示出了在Foxp3Cre-ERT2(黑色)和Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA(蓝色)小鼠中在表达STAT5bCA的Treg细胞和对照Treg细胞存在下对EAE的分析。用CFA中的MOG肽免疫后诱导EAE。所示小鼠的平均疾病得分(对于每个组,n=10)。误差条指示+/-S.E.M。示出了两次独立的实验的代表性数据。图片(b)示出了如通过流式细胞术测定的在(a)中所示出小鼠中脑浸润CD3+CD4+细胞(左图)中和CD3+CD8+细胞(右图)中Foxp3+细胞的频率。图片(c)示出了如通过流式细胞术测定的在(a)中所示出小鼠中所示脑浸润细胞亚群的数目。图片(d)示出了对所示小鼠中针对单核细胞增生李斯特氏菌的T细胞应答的分析。在李斯特氏菌感染后第8天分析脾T细胞应答。在CD3+CD4+细胞中Foxp3+Treg细胞的频率(左图)。在DC存在下用热灭活的李斯特氏菌体外再刺激5小时后分析产生IFNγ(中间图)和TNFα(右图)的CD4+TCRβ+Foxp3-细胞的频率。示出了来自四个独立的实验的合并数据。图片(e)示出了对感染非复制型牛痘病毒的所示小鼠中抗病毒性T细胞应答的分析。在感染后第8天分析脾T细胞应答。使用H-2Kb-B8R四聚体染色,通过流式细胞术检测牛痘B8R肽特异性CD8+T细胞(左图)。用B8R肽或三种牛痘病毒特异性肽(ISK、A33R和B5R)的混合物体外刺激5小时后,通过流式细胞术测定CD8+Foxp3-(中间图)和CD4+Foxp3-(右图)细胞的IFNγ产生。示出了两次独立的实验的代表性数据。单一他莫昔芬治疗两至三个月后,用所示炎性药剂激发Foxp3Cre-ERT2(黑色)和Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA(蓝色)小鼠。每个点代表各个小鼠(b、c、d、e)。误差条指示平均值+/-S.E.M。
图5,包括图片(a)到(f),展示了对表达STAT5的组成型活性形式的Treg细胞的RNA序列分析。图片(a)示出了对RNA序列数据集的主成分分析,使用了具有最高变异性的前15%的基因。每个点对应于来自单只小鼠的RNA样品。图片(b)示出了在对照Treg细胞相对于表达STAT5bCA的Treg细胞中基因表达(作为log2标准化的读取计数)的绘图。对角线指示至少1.5×或0.67×倍的倍数变化。分别将显著地上调和下调的基因(定义为具有至少1.5×或0.67×倍数变化,经调整的P值≤0.05,且表达高于基于所有基因的分布的最小阈值的基因)着色为红色或蓝色,并且示出它们的数目。图片(c)示出了所选基因的热图。对于每个条件,按顺序示出了3个重复。.这些值指示对照Treg细胞与表达STAT5bCA的Treg细胞之间的FDR调整的P值。图片(d)示出了针对相对于对照Treg STAT5bCA Treg中所有表达的基因的log2倍数变化的经验累积性分布函数(ECDF)连同针对在Treg细胞中通过炎性活化上调或下调的基因亚群33(上图),或在CD44hi Treg细胞中以TCR依赖性方式上调或下调的基因亚群34(下图)的ECDF一起的绘图。使用双侧科-斯二氏检验来计算FDR调整的P值。图片(e)示出了KEGG途径的信号传导通路影响分析(SPIA)。示出了相对于对照Treg细胞STAT5bCATreg细胞中差异性表达(DE)的基因中显示出富集的6种统计学上最显著的通路。基于通路内DE基因的活化或抑制关系,净通路扰动指示通路的状态(正数=被活化的;负数=受抑制的)。红色圆圈的大小与富集程度成比例,并且示出了反映富集和扰动的FDR调整的全局P值。图片(f)示出了对相对于对照Treg细胞STAT5bCA Treg细胞中显著上调的基因中进行的GO词条富集的网络分析。使用Cytoscape中的BiNGO分析上调基因中的过表达的GO词条,并且使用EnrichmentMap计算并可视化所得网络。将相似的GO词条的组手动圈起来。边缘厚度和颜色与连接节点之间的相似系数成比例。节点颜色与富集的FDR调整的P值成比例。节点大小与基因集大小成比例。对于RNA序列分析,从他莫昔芬治疗4个月后的Foxp3Cre- ERT2ROSA26Stat5bCA(STAT5bCA)和Foxp3Cre-ERT2(对照)小鼠中FACS纯化脾CD4+Foxp3+Treg细胞和CD4+Foxp3-CD62LhiCD44lo T初始细胞。
图6,包括图片(a)、(b)和(c),证明Treg细胞中增强的STAT5信号传导增加Treg细胞与DC之间的缀合物形成,并且以TCR独立性方式加强抑制功能。图片(a)示出了对T细胞与DC之间体外缀合物形成的分析。对于缀合物形成评估,在存在或不存在rmIL-2(100IU/ml)下,将来自所示小鼠的FACS分选的、CFSE标记的T细胞(Treg和非Treg细胞)与分级数目的来自C57BL/6J小鼠的MACS分选的、CellTrace紫标记的CD11c+DC共培养150至720min。每个点代表单个孔中缀合物形成的流式细胞术分析。使用Prism软件包通过改进型协方差分析(ANCOVA)进行统计数据分析。**,P<0.01;***,P<0.001;NS,不显著。示出了三次独立的实验的代表性数据。图片(b)显示在不存在TCR信号传导下,STAT5的组成型活性形式的表达加强Treg细胞抑制功能。将Foxp3Cre-ERT2(实心圆形)、Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA(加边圆形)、Foxp3Cre-ERT2Tcrafl/fl(实心三角)和Foxp3Cre-ERT2Tcrafl/flROSA26Stat5bCA小鼠(加边三角形)用他莫昔芬治疗2周,并且通过流式细胞术评估T细胞活化、增殖活性和促炎细胞因子产生。示出了LN细胞性(左),以及CD4+Foxp3-细胞中CD44hi(左中)、Ki-67+细胞(右中)、产生IFNγ+的细胞(右)的频率。图中的每个点代表单只小鼠。误差条指示平均值+/-S.E.M。示出了三次独立的实验的代表性数据。图片(c)示出了Treg细胞的频率和某些分子的表达。将WT CD4+Foxp3-和CD8+Foxp3-T细胞(各自5×105个细胞)连同从已用他莫昔芬治疗2周的所示小鼠中分选的Treg细胞(3×105个细胞)转移至Tcrb-/-Tcrd-/-受体中。基于TCR的表达,FACS纯化TCR消融的Treg细胞。TCR充足型Treg细胞分选自对照(Foxp3Cre-ERT2)小鼠。转移后3周分析这些受体。受体中Treg细胞的频率和Treg细胞中所示分子的表达示出在前五个图片(从左到右)中。右侧两个图片示出了CD4+Foxp3-和CD8+Foxp3-T细胞的数目。示出了两次独立的实验的代表性数据。
图7,包括图片(a)到(c),证明IL-2维持了CD62LhiCD44lo和CD62LloCD44hiTreg细胞亚群两者。图片(a)示出了通过在CD62LhiCD44lo(上方图片)和CD62LloCD44hi(下方图片)YFP+Foxp3+Treg细胞亚群上进行门控来进行对图1j中所示小鼠的流式细胞术分析。示出了两次独立的实验的代表性数据。图片(b)示出了对5周龄Foxp3CreIl2rbfl/wt和Foxp3CreIl2rbfl/fl小鼠的脾和小肠固有层淋巴细胞(SILPL)中在CD3+CD4+Foxp3+中CD62L和CD44的表达(上方图片)以及CD3+CD4+细胞中Foxp3+细胞的频率(下方图片)的代表性流式细胞术分析。右图示出了流式细胞术图的汇总数据。图片(c)示出了对针对5周龄Foxp3CreIl2rbfl/wt和Foxp3CreIl2rbfl/fl小鼠的脾CD3+CD4+Foxp3+细胞的所示标志物的流式细胞术分析。示出了三次独立的实验的代表性数据。图中的每个点代表单只小鼠。误差条指示平均值+/-S.E.M(a、b、c)。
图8,包括图片(a)到(h),证明IL-2Rα和STAT5对于Treg细胞功能是不可缺少的。图片(a)示出了Foxp3CreIl2rafl/fl(实线;n=25)和对照Foxp3CreIl2rafl/wt(点线;n=20)小鼠的寿命。图片(b)示出了对4周龄Foxp3CreIl2rawt/wt和Foxp3CreIl2rafl/fl小鼠中LN细胞性、Foxp3表达水平(MFI)和CD3+CD4+细胞中Foxp3+Treg细胞的频率(上图)以及CD4+Foxp3-和CD8+Foxp3-细胞的促炎细胞因子产生(下图)的分析。每个点代表单只小鼠。误差条指示平均值+/-S.E.M。示出了两次独立的实验的代表性数据。图片(c)示出了对Foxp3CreIl2rafl/fl小鼠的组织病理学分析。对4周龄小鼠的所示器官的福尔马林固定的组织切片H&E染色。比例尺,100μm。示出了分析的3只小鼠的代表性图像。图片(d)示出了对6周龄Foxp3CreStat5a/bwt/wt和Foxp3CreStat5a/bfl/fl小鼠LN中CD4T细胞亚群中的Foxp3和CD25表达的代表性流式细胞术分析。下方的直方图代表在上方图片中显示的Foxp3+细胞中的CD25的表达水平。图片(e)示出了对LN中CD3+CD4+Foxp3-(上方图片)和CD3+CD8+Foxp3-(下方图片)细胞中的T细胞活化标志物CD62L和CD44的流式细胞术分析。图片(f)示出了由从所示小鼠分离并且用抗CD3/CD28体外刺激5小时的脾CD4+Foxp3-细胞的细胞因子产生的流式细胞术分析。图片(g)示出了对用抗CD3/CD28刺激5小时的脾CD8+Foxp3-细胞的IFNγ产生的流式细胞术分析。数据是分析的5只相对于5只小鼠的代表性数据(d-g)。图片(h)示出了对Foxp3CreStat5a/bfl/fl小鼠的组织病理分析。对4周龄小鼠的所示器官的福尔马林固定的组织切片H&E染色。比例尺,100μm。示出了分析的5只小鼠的代表性图像。
图9,包括图片(a)到(e),展示了在STAT5的组成型活性形式表达后对IL-2Rα-缺陷型Treg细胞的抑制活性的挽救。图片(a)示出了对所示小鼠(4周龄)的LN和脾中CD3+CD4+细胞中Foxp3和CD25表达的流式细胞术分析。图片(b)示出了对Treg细胞中STAT5磷酸化的流式细胞术分析。将从所示小鼠中分离的脾细胞用rmIL-2(1,000U/ml)刺激20min,并且分析CD4+YFP+(Foxp3+)细胞中酪氨酸磷酸化STAT5的细胞内水平。图片(c)示出了对所示小鼠LN中CD3+CD4+Foxp3-和CD3+CD8+Foxp3-细胞中的T细胞活化标志物CD62L和CD44的流式细胞术分析。图片(d)示出了用抗CD3/CD28刺激5小时的脾CD4+Foxp3-细胞的细胞因子产生。示出了三次独立的实验的代表性数据(a-d)。图片(e)示出了在所示小鼠LN中CD3+CD4+Foxp3-(左图)和CD3+CD8+Foxp3-(右图)细胞中CD44hi细胞的频率。每个点代表单只小鼠。误差条指示平均值+/-S.E.M。数据代表两次独立的实验。
图10,包括图片(a)和(b),展示了体内IL-2中和对CD4+和CD8+细胞的活化的影响。图片(a)示出了对用IL-2中和抗体或对照IgG治疗的所示小鼠的LN细胞的代表性流式细胞术分析。从出生后7天开始,将小鼠治疗2周。用抗CD3/CD28体外刺激5小时后分析CD4+Foxp3-和CD8+Foxp3-细胞的细胞因子产生。数据代表分析的三只小鼠/组。图片(b)显示,将Foxp3Cre(上方6个图片)和Foxp3CreIl2rbfl//fl(下方8个图片)小鼠的LN细胞未用rmIL-2刺激或用rmIL-2(1,000U/ml或10U/ml)刺激20min,并且通过流式细胞术分析Treg(CD4+YFP+CD25hi)、T初始(YFP-CD44loCD25lo;CD4+和CD8+)、和Teff(YFP-CD44hi;CD25lo和CD25hi;CD4+和CD8+)细胞中的酪氨酸磷酸化STAT5的细胞内水平。数据代表两次独立的实验。
图11,包括图片(a)到(i),展示了对携带表达STAT5的组成型活性形式的Treg细胞的小鼠的表征。图片(a)示出了他莫昔芬灌胃后STAT5bCA+Treg细胞的增殖。将三只小鼠处死并在每个时间点处进行分析。通过流式细胞术测定在脾中总Treg细胞中STAT5bCA+Treg细胞的频率。误差条指示+/-S.E.M。图片(b)显示,单一他莫昔芬治疗三个月后通过流式细胞术测定在Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠的所示器官中总Treg细胞中STAT5bCA+Treg细胞的频率。图片(c)示出了他莫昔芬灌胃后体重的变化。将4月龄Foxp3Cre-ERT2(黑色,n=7)和Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA(蓝色,n=7)小鼠用他莫昔芬灌胃,并且在之后的4个月监测体重。误差条指示+/-S.E.M。图片(d)示出了他莫昔芬灌胃4.5个月后Foxp3Cre-ERT2(黑色)和Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA(蓝色)小鼠的血清化学分布。每个点代表单只小鼠。误差条指示平均值+/-S.E.M。图片(e)示出了他莫昔芬灌胃2个月后,针对Foxp3Cre-ERT2(对照)和Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA(CA)小鼠通过流式细胞术分析的在不同组织中Treg细胞的TCR Vβ使用。MLN,肠系膜淋巴结;PP,派尔集合淋巴结(Peyer’s patch)。示出了两次独立的实验的代表性数据。图片(f-h)示出了对单一他莫昔芬治疗三个月后Foxp3Cre-ERT2(黑色)和Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA(蓝色)小鼠的Treg细胞的一般表征。图片(f)示出了在所示器官的Treg细胞上所示分子的表达水平。图片(g)示出了在所示器官中CD3+CD4+细胞中Foxp3+细胞的频率(上图)和CD3+CD4+Foxp3+细胞中Foxp3的表达水平(下图)。图片(h)示出了在所示器官中CD3+CD8+细胞中Foxp3+细胞的频率。每个点代表单只小鼠。误差条指示平均值+/-S.E.M(b、d、f、g、h)。数据代表两次独立的实验(f、g、h)。图片(i)示出了STAT5bCA Treg细胞的增加的抑制活性。将Treg细胞从Foxp3Cre-ERT2(对照)和Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA(Stat5bCA)小鼠中分离,并且与T初始细胞(应答细胞)共培养。基于CellTrace紫(CTV)荧光强度的稀释,通过流式细胞术测定Treg和应答细胞的增殖活性。在左侧两个图片中示出了按4:1应答细胞与Treg细胞比率的T初始细胞的典型染料稀释模式。显示共培养的应答T细胞和Treg细胞的增殖的汇总图示出在右侧两个图片中。注意细胞的CTV MFI与细胞分裂呈负相关。误差条指示一式三份的孔中+/-S.E.M。
图12,包括图片(a)到(e),展示了在STAT5bCA+Treg细胞存在下Teff细胞群的系统性减少。图片(a)和(b)显示,通过流式细胞术测定所示器官中CD4+Foxp3-(a)和CD8+Foxp3-(b)细胞中Ki-67+(上图)、CD62LhiCD44lo(中间图;%T初始)和CD62LloCD44hi(下图;%Teff)细胞的频率。图片(c)显示,将所示小鼠的脾细胞和肠系膜LN细胞用抗CD3/CD28刺激5小时,并且通过流式细胞术测定CD4+Foxp3-细胞中所示产生细胞因子的细胞的频率。图片(d)示出了通过ELISA测定的血清Ig水平。单一他莫昔芬治疗三个月后分析Foxp3Cre-ERT2(黑色点)和Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA(蓝色点)小鼠(a-d)。图片(e)示出了表达STAT5的组成型活性形式的Treg细胞对肠道癌发生的影响。在4周龄时用他莫昔芬治疗Foxp3Cre-ERT2ApcMin/+和Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCAApcMin/+小鼠,并且在4个月后使用立体显微术评估远端小肠中息肉的数目和大小。每个点代表单只小鼠。误差条指示平均值+/-S.E.M(a-e).
图13,包括图片(a)到(c),描述了用于获得图5中所示的数据进行的RNA序列分析。图片(a)示出了对照T初始细胞相对于STAT5bCA T初始细胞(即,来自Foxp3Cre- ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠的初始CD4+T细胞)中基因表达(作为log2标准化的读取计数)的绘图。对角线指示至少1.5×或0.67×倍的倍数变化。分别将显著地上调和下调的基因(定义为具有至少1.5×或0.67×倍数变化,经调整的P值≤0.05,且表达高于基于所有基因的分布的最小阈值的基因)着色为红色或蓝色,并且示出它们的数目。图片(b)示出了显示出STAT5bCA与对照Treg细胞之间的log10FDR调整的P值相对于log2倍数变化的火山图。落在该图的x轴或y轴范围之外的基因在轴线上显示为空心三角形。垂直和水平的灰色线分别指示1.5×或0.67×倍数变化(±log21.5=±0.58)和P=0.05(-log10 0.05=1.3)。图片(c)示出了对相对于对照Treg细胞在表达STAT5bCA的Treg细胞中显著下调的基因中进行的GO词条富集的网络分析。使用Cytoscape中的BiNGO分析下调基因中的过表达的GO词条,并且使用EnrichmentMap计算并可视化所得网络。将相似的GO词条的组手动圈起来。边缘厚度和颜色与连接基因集之间的相似系数成比例。节点颜色与富集的FDR调整的P值成比例。节点大小与基因集大小成比例。
图14示出了在STAT5bCA Treg相对于对照Treg细胞中上调或下调的基因中富集的基因本体词条。
图15展示了用于产生条件型IL2rb等位基因和IL2rb靶向的策略。构建靶向载体,使得在Cre介导的缺失时,启动子区和包含Il2rb的第一个ATG的外显子2缺失,同时活化eGFP表达。从上至下示出了:i)具有启动子区、外显子和外显子2(E2)中的翻译起始位点的Il2rb基因座;ii)靶向载体,包含eGFP、三联SV40poly A位点(tpA)、PGK neopA盒、外显子2下游的PGK启动子(Pr.)、TK基因,和loxP,以及frt位点;箭头表示取向;iii)靶向的Il2rb基因座。指出了限制性位点、用于检测的探针和通过DNA印迹分析检测的预期片段。通过对XbaI消化的DNA的DNA印迹分析鉴定正确靶向的胚胎干(ES)细胞系,这些细胞系显示出整合转基因的4.0kb条带以及14.0kb野生型条带。使用在跨越PGK启动子和3'frt位点的独特区域(正向引物)和Jl2rb的内含子3的上游区域(反向引物)中杂交的引物,通过PCR分析验证3'loxP位点的共整合。
图16示出了ROSA26Stat5bCA等位基因的示意图和ROSA26Stat5bCA等位基因的靶向策略。构建靶向载体,使得在Cre介导的STOP盒缺失时表达CAG启动子驱动的STAT5bCA。通过对EcoRl消化的DNA的DNA印迹分析鉴定正确靶向的ES细胞系,这些细胞系显示出整合转基因的5.9kb(探针A;5'侧)和11.6kb(探针F;3'侧)条带以及15.6kb野生型条带(探针A和F;双侧)。
定义
给予:如本文使用的,术语“给予”是指将组合物向受试者或系统给予。向动物受试者(例如,向人类)的给予可以通过任何适当的途径进行。例如,在一些实施例中,给予可以是支气管内(包括通过支气管滴注)、口腔内、肠内、真皮间(interdermal)、动脉内、真皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、特定器官内(例如,肝内)、粘膜、鼻腔、口服、直肠、皮下、舌下、局部、气管(包括通过气管内滴注)、经皮、阴道和玻璃体。在一些实施例中,给予可以是肿瘤内或肿瘤周围。在一些实施例中,给予可以涉及间歇给药。在一些实施例中,给予可以涉及连续给药(例如,灌注)持续至少选定的时间段。
过继性细胞疗法:如本文使用的,“过继性细胞疗法”或“ACT”涉及将免疫细胞(例如,Treg)转移到受试者中。在一些实施例中,ACT是一种治疗方法,该方法涉及使用具有调节性T细胞活性的淋巴细胞,将这些细胞体外扩增至大量并将它们输注到受试者中。
药剂:如本文使用的,术语“药剂”可以是指任何化学类别的化合物或实体,包括例如多肽、核酸、糖类、脂质、小分子、金属或其组合。如将从上下文清楚的,在一些实施例中,药剂可以是或包含细胞或生物体或其部分、提取物或组分。在一些实施例中,药剂是或包括天然产物,因为它存在于自然界中和/或从自然界获得。在一些实施例中,药剂是或包括一种或多种人造的实体,因为它是通过人工的行为设计、工程化和/或生产的,和/或不存在于自然界中。在一些实施例中,药剂可以呈分离的或纯的形式利用;在一些实施例中,药剂可以呈粗制的形式利用。在一些实施例中,潜在的药剂作为集合或文库提供,例如可以进行筛选以鉴定或表征它们中的活性剂的集合或文库。可以根据本发明利用的药剂的一些特定实施例包括小分子、抗体、抗体片段、适体、核酸(例如,siRNA、shRNA、DNA/RNA杂合体、反义寡核苷酸、核糖酶)、肽、肽模拟物等。在一些实施例中,药剂是或包括聚合物。在一些实施例中,药剂不是聚合物和/或基本上不含任何聚合物。在一些实施例中,药剂含有至少一个聚合物部分。在一些实施例中,药剂缺乏或基本上不含任何聚合物部分。
改善:如本文使用的,“改善”是指预防、减轻和/或缓解受试者的状态或者改进受试者的状态。改善包括但不要求疾病、病症或病状的完全恢复或完全预防。
氨基酸:如本文使用的,术语“氨基酸”在其最广泛的意义上是指可以并入到多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中,氨基酸具有通式结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施例中,氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施例中,氨基酸是合成的氨基酸;在一些实施例中,氨基酸是d-氨基酸;在一些实施例中,氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常存在于天然存在的肽中的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除了标准氨基酸以外的任何氨基酸,无论它是合成制备的还是从天然来源获得的。如本文使用的,“合成氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸,包括但不限于盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)和/或取代物。可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基团和/或用可以改变肽的循环半衰期而对其活性没有不利影响的其他化学基团的取代来修饰氨基酸,包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可包含一种或翻译后修饰,诸如与一种或多种化学实体(例如,甲基基团、乙酸酯基团、乙酰基基团、磷酸酯基团、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸酯基团、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)缔合。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用,并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用该术语的上下文中将明显看出该术语是指游离氨基酸或者肽的残基。
抗体:如本文使用的,术语“抗体”是指包含足以赋予与特定靶抗原的特异性结合的规范免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域中已知的,天然产生的完整抗体是由两个相同的重链多肽(各自约50kD)和两个相同的轻链多肽(各自约25kD)组成的大约150kD的四聚体药剂,这些多肽彼此缔合成通常被称为“Y形”的结构。每条重链由以下组成:至少四个结构域(每个长约110个氨基酸)-氨基末端可变(VH)结构域(位于Y结构的尖端处),接着是三个恒定结构域:CH1、CH2和羧基末端CH3(位于Y的茎的基部处)。称为“开关”的短区域连接重链可变区和恒定区。“铰链”将CH2和CH3结构域连接到抗体的其余部分。在该铰链区中的两个二硫键将两个重链多肽在完整抗体中彼此连接。每条轻链由两个结构域组成,即一个氨基末端可变(VL)结构域,接着是一个羧基末端恒定(CL)结构域,由另一个“开关”彼此分开。完整的抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体组成,在这些二聚体中重链和轻链通过单个二硫键彼此连接;另外两个二硫键将重链铰链区彼此连接,这样使得二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体也典型地在CH2结构域上被糖基化。天然抗体中的每个结构域具有特征在于“免疫球蛋白折叠”的结构,该免疫球蛋白折叠由在压缩的反平行β桶中彼此封装的两个β折叠片(例如,3股、4股或5股折叠片)形成。每个可变结构域含有称为“互补决定区”的三个高变环(CDR1、CDR2和CDR3)和四个稍微不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时,FR区形成为结构域提供结构框架的β折叠片,并且来自重链和轻链两者的CDR环区在三维空间中聚集在一起,这样使得它们产生位于Y结构的尖端处的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区结合到补体系统的元件,并且还结合到效应细胞(包括例如介导细胞毒性的效应细胞)上的受体。如本领域中已知的,Fc区对Fc受体的亲和力和/或其他结合属性可以通过糖基化或其他修饰来调控。在一些实施例中,根据本披露产生和/或利用的抗体包含糖基化Fc结构域,包括具有修饰或工程化的这种糖基化的Fc结构域。出于本披露的目的,在某些实施例中,包含如存在于天然抗体中的足够免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物可以被称为和/或用作“抗体”,无论这种多肽是天然产生的(例如,由对抗原反应的生物体生成的)还是通过重组工程、化学合成或其他人工系统或方法学产生的。在一些实施例中,抗体是多克隆的;在一些实施例中,抗体是单克隆的。在一些实施例中,抗体具有是小鼠、兔、灵长类动物或人类抗体的特征的恒定区序列。在一些实施例中,如本领域中已知的,抗体序列元件是完全人的或人源化的、灵长类化的、嵌合的等。此外,如本文使用的,术语“抗体”可以在适当的实施例中(除非另有说明或从上下文清楚看出)指本领域已知的或开发的构建体或者用于在替代性呈现中利用抗体结构和功能特征的形式中的任一种。例如,在一些实施例中,根据本披露利用的抗体呈选自但不限于以下的形式:完整IgG、IgE和IgM,双特异性或多特异性抗体(例如,等),单链Fv,多肽-Fc融合物,Fab,骆驼科动物抗体,掩蔽抗体(例如,),小模块免疫药物(“SMIPsTM”),单链或串联双抗体VHH, 迷你抗体,锚蛋白重复序列蛋白或DART,TCR样抗体,微量蛋白,和在一些实施例中,抗体可能缺乏如果天然产生将会具有的共价修饰(例如,聚糖的附接)。在一些实施例中,抗体可以含有共价修饰(例如,聚糖、有效载荷(例如,可检测部分、治疗性部分、催化部分等)或其他侧基(例如,聚乙二醇等)的附接)。
抗原:如本文使用的,术语“抗原”是指引发免疫应答的药剂;和/或结合到T细胞受体(例如,当由MHC分子呈递时)或者抗体或抗体片段的药剂。在一些实施例中,抗原引发体液应答(例如,包括产生抗原特异性抗体);在一些实施例中,抗原引发细胞应答(例如,涉及其受体与抗原特异性相互作用的T细胞)。在一些实施例中,抗原结合到抗体并且可能或可能不在生物体中诱导特定的生理应答。一般来讲,抗原可以是或包括任何化学实体,例如像小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂质、聚合物(在一些实施例中除了生物聚合物以外(例如,除了核酸或氨基酸聚合物以外))等。在一些实施例中,抗原是或包括多肽。在一些实施例中,抗原是或包括聚糖。本领域的普通技术人员将理解,一般来讲,抗原可以呈分离的或纯的形式提供,或者可替代地可以呈粗制形式提供(例如,与其他物质一起,例如在诸如细胞提取物等提取物中或其他相对较粗的含抗原来源的制品中),或者可替代地可以存在于细胞上或细胞中。在一些实施例中,抗原是重组抗原。
抗原呈递细胞:如本文使用的,短语“抗原呈递细胞”或“APC”具有其领域理解的含义,是指将抗原加工并呈递给T细胞的细胞。示例性APC包括树突细胞、巨噬细胞、B细胞、某些被活化的上皮细胞以及能够进行TCR刺激和适当的T细胞共刺激的其他细胞类型。
大约或约:如本文使用的,术语“大约”或“约”在应用于一个或多个所感兴趣的值时,是指与所陈述的参考值类似的值。在某些实施例中,术语“大约”或“约”是指落在所陈述的参考值的任一方向上(大于或小于)的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小的值的范围,除非另有说明或从上下文中另外明显看出(除这种数字超过可能值的100%的情况)。
结合:应当理解,如本文使用的,术语“结合”典型地是指两个或更多个实体之间或之中的非共价缔合。“直接”结合涉及实体或部分之间的物理接触;间接结合涉及通过与一个或多个中间实体进行物理接触的物理相互作用。两个或更多个实体之间的结合典型地可以在多种情况中的任一种下进行评定,这些情况包括在分离中或在更复杂的系统的情况(例如,当与载体实体共价或以其他方式缔合时和/或在生物系统或细胞中)下研究相互作用的实体或部分的情况。
嵌合抗原受体:如本文使用的,“嵌合抗原受体”或“一个或多个CAR(CAR或CARs)”是指工程化受体,这些受体将抗原特异性移植到细胞上(例如T细胞,诸如初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、调控性T细胞或其组合)。CAR也被称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。在一些实施例中,CAR包含抗原特异性靶向区、胞外结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和胞内信号传导结构域。
相当的:如本文使用的,术语“相当的”是指两种或更多种药剂、实体、情形、条件组等,这些可以彼此不相同但足够相似以允许它们之间进行比较,使得本领域技术人员将理解可以基于观察到的差异或相似合理地得出结论。在一些实施例中,相当的条件组、情形、个体或群体特征在于多个基本相同的特征和一个或少数的变化特征。在上下文中,本领域的普通技术人员将理解,在任何给定环境下对于将两种或更多种这类药剂、实体、情形、条件组等认为是相当的所需的同一性程度。例如,本领域的普通技术人员将理解,当情形组、个体或群体的特征在于足够数量和类型的基本相同特征以保证合理的结论:即在不同环境组、个体或群体下或用不同环境组、个体或群体获得的结果或观察到的现象的差异是由那些不同的特征的变化引起的或是指示那些不同的特征的变化的时,则这些环境组、个体或群体是彼此相当的。
组成型活性:如本文使用的,术语“组成型活性”是指在相当的条件下与适当的参考物相比升高的和/或时间上更一致的活性的状态。在具体实施例中,“组成型活性”状态的特征在于例如高于特定阈值水平的始终可检测的活性水平。在一些实施例中,“组成型活性”状态的特征在于所感兴趣的药剂(例如,所感兴趣的蛋白质,和/或编码所感兴趣的蛋白质的核酸)的活性形式的存在。在一些实施例中,“组成型活性”状态可以通过升高的和/或一致的产生水平、抑制的和/或不一致的破坏(例如,降解)水平、改变的修饰水平和/或时序(例如,以生成或破坏所感兴趣的药剂的活性形式)等中的一种或多种来实现。
剂型:如本文使用的,术语“剂型”和“单位剂型”是指用于有待治疗患者的治疗剂的物理离散单位。每个单位含有经计算产生所希望的治疗效果的预先确定量的活性物质。然而,应当理解,组合物的总剂量将由主治医生在正确医学判断的范围内决定。
给药方案:如本文使用的,术语“给药方案”是指单独向受试者给予的一组单位剂量(典型地多于一个),典型地按时间段分开。在一些实施例中,给定的治疗剂具有推荐的给药方案,该给药方案可以涉及一个或多个剂量。在一些实施例中,给药方案包括多个剂量,每个剂量按相同长度的时间段彼此分开;在一些实施例中,给药方案包括多个剂量和将单独剂量分开的至少两个不同时间段。在一些实施例中,给药方案内的所有剂量具有相同的单位剂量量。在一些实施例中,给药方案内的不同剂量具有不同的量。在一些实施例中,给药方案包括第一剂量量的第一剂量,接着是不同于第一剂量量的第二剂量量的一个或多个另外剂量。在一些实施例中,给药方案包括第一剂量量的第一剂量,接着是与第一剂量量相同的第二剂量量的一个或多个另外剂量。在一些实施例中,当在整个相关群体中给予时,给药方案与所希望的或有益的结果相关(即,是治疗性给药方案)。
工程化:阅读本披露的本领域的普通技术人员将理解,如本文使用的术语“工程化”是指已由人工操纵和改变的方面。具体地,术语“工程化细胞”是指这样的细胞,该细胞已经历操纵,使得其遗传、表观遗传和/或表型同一性相对于适当的参考细胞(诸如没有被如此操纵的原本相同的细胞)改变。在一些实施例中,操纵是或包括基因操纵。在一些实施例中,基因操纵是或包括以下项中的一种或多种:(i)引入在操纵之前不存在于细胞中的核酸(即,异源核酸的引入);(ii)去除在操纵之前存在于细胞中的核酸或其部分;和/或(iii)改变(例如,通过序列取代)在操纵之前存在于细胞中的核酸或其部分。在一些实施例中,工程化细胞是这样的细胞,该细胞已被操纵,使得它相对于这种适当的参考细胞含有和/或表达改变量和/或根据改变时序的特定所感兴趣药剂(例如,蛋白质、核酸、和/或其特定形式)。本领域普通技术人员将理解,在一些实施例中,本文提及的“工程化细胞”涵盖施用操纵的特定细胞并且还涵盖这种细胞的任何子代。
表达:如本文使用的,核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或多个:(1)由DNA序列产生RNA模板(例如,通过转录);(2)加工RNA转录物(例如,通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端形成);(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质;和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
融合蛋白:如本文使用的,术语“融合蛋白”通常是指包含至少两个区段的多肽,每个区段与(1)天然存在的和/或(2)代表多肽的功能结构域的肽部分显示出高度氨基酸同一性。典型地,如果两个区段是(1)在自然界中不包含在同一肽中,和/或(2)先前在单个多肽中未彼此连接,和/或(3)通过人工的行为已经彼此连接的部分,则认为含有至少两个这类区段的多肽是融合蛋白。
基因:如本文使用的,术语“基因”具有其在本领域中所理解的含义。本领域的普通技术人员将理解,术语“基因”可以包括基因调节序列(例如,启动子、增强子等)和/或内含子序列。应当进一步理解,基因的定义包括对不编码蛋白质,而是编码诸如tRNA、RNAi诱导剂等功能性RNA分子的核酸的参考。出于清楚的目的,我们注意到,如在本申请中使用的,术语“基因”通常是指编码蛋白质的核酸的一部分;该术语可以任选地涵盖调节序列,如本领域的普通技术人员从上下文将清楚的。该定义并非旨在排除术语“基因”对于非蛋白质编码的表达单元的应用,而是为了阐明在大多数情况下,本文件中使用的术语是指编码蛋白质的核酸。
基因产物或表达产物:如本文使用的,术语“基因产物”或“表达产物”通常是指由基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由该基因转录的RNA编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。
异源的:如本文使用的,术语“异源的”是指由于如本文所述的工程化(即,通过将操纵应用至特定环境)而存在于该环境中的药剂(例如,核酸、蛋白质、细胞、组织等)。仅给出一些实例,在第一细胞类型中而不在第二细胞类型中(例如,在细菌细胞中而不在哺乳动物细胞中、在来自第一组织的细胞中而不在来自第二组织的细胞中、在第一微生物物种的细胞中但不在第二微生物物种的细胞中等)通常或天然存在的核酸或蛋白质对于第二细胞类型可以是“异源的”。类似地,在第一生物体中而不在第二生物体中(例如,在啮齿动物中而不在哺乳动物中等)通常或天然存在的细胞或组织对于第二生物可以是“异源的”。本领域的普通技术人员将理解如本文使用的术语“异源的”的范围和环境。
免疫应答:如本文使用的,术语“免疫应答”是指在动物中引发的应答。在一些实施例中,免疫应答可以是指细胞免疫、体液免疫或者可以涉及两者。在一些实施例中,免疫应答可能局限于免疫系统的一部分。例如,在某些实施例中,免疫应答可以是或包括增加的IFNγ应答。在某些实施例中,免疫应答可以是或包括粘膜IgA应答(例如,如在鼻和/或直肠洗涤物中测量的)。在某些实施例中,免疫应答可以是或包括系统性IgG应答(例如,如在血清中测量的)。在某些实施例中,免疫应答可以是或包括中和抗体应答。在某些实施例中,免疫应答可以是或包括T细胞的细胞溶解(CTL)应答。在某些实施例中,免疫应答可以是或包括免疫细胞活性的降低。
改进、增加或减轻:如本文使用的,术语“改进”“增加”或“减轻”或语法等同物指示相对于适当的参考测量值的值,如将由本领域的普通技术人员理解的。仅给出一些实例,在一些实施例中,关于已接受特定治疗的个体应用这样的术语可以指示相对于未接受治疗的相当个体,和/或相对于在给予治疗之前的相关个体他/她自己等的变化。
个体、受试者:如本文使用的,术语“受试者”或“个体”是指特定人类或非人类的哺乳动物生物体;在许多实施例中,这些术语是指人类。在一些实施例中,“个体”或“受试者”可以是特定年龄组的成员(例如,可以是胎儿、婴儿、儿童、青少年、成人或老年人)。在一些实施例中,“个体”或“受试者”可能罹患或易患有特定的疾病、病症或病状(即,可以是“患者”)。
核酸:如本文使用的,“核酸”在其最广泛的意义上是指作为寡核苷酸链或者可以并入到寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中,核酸是作为寡核苷酸链或者经由磷酸二酯键可以并入到寡核苷酸链中的化合物和/或物质。如将从上下文清楚看出的,在一些实施例中,“核酸”是指单个核酸残基(例如,核苷酸和/或核苷);在一些实施例中,“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施例中,“核酸”是或包括RNA;在一些实施例中,“核酸”是或包括DNA。在一些实施例中,核酸是一个或多个天然核酸残基、包含一个或多个天然核酸残基或者由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施例中,核酸是一个或多个核酸类似物、包含一个或多个核酸类似物或者由一个或多个核酸类似物组成。在一些实施例中,核酸类似物与核酸的不同之处在于核酸类似物不使用磷酸二酯骨架。例如,在一些实施例中,核酸是一个或多个“肽核酸”、包含一个或多个“肽核酸”或由一个或多个“肽核酸”组成,这些肽核酸在本领域中是已知的并且在骨架中具有肽键而不是磷酸二酯键,被认为在本发明的范围内。可替代地或另外,在一些实施例中,核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键而不是磷酸二酯键。在一些实施例中,核酸是一种或多种天然核苷、包含一种或多种天然核苷或由一种或多种天然核苷组成(该一种或多种天然核苷例如,腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)。在一些实施例中,核酸是一种或多种核苷类似物、包含一种或多种核苷类似物或由一种或多种核苷类似物组成(该一种或多种核苷类似物例如,2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴代尿苷、C5-氟代尿苷、C5-碘代尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入碱基及其组合)。在一些实施例中,核酸包含一种或多种与天然核酸中的糖相比修饰的糖(例如,2'-氟代核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施例中,核酸具有编码功能性基因产物诸如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施例中,核酸包含一个或多个内含子。在一些实施例中,核酸通过以下方法中的一种或多种来制备:从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合进行酶促合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中进行繁殖以及化学合成。在一些实施例中,核酸长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施例中,“核酸”是单链的;在一些实施例中,“核酸”是双链的。在一些实施例中,核酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列,该元件编码多肽或者是编码多肽的序列的互补序列。在一些实施例中,核酸具有酶活性。
可操作地连接:如本文使用的,“可操作地连接”是指并置,其中所描述的部件处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。“可操作地连接”到编码序列的控制序列以这样一种方式连接,该方式使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操作地连接的”序列包括与所感兴趣的基因邻接的表达控制序列,和以反式或在远处起作用以控制所感兴趣的基因的表达控制序列。如本文使用的,术语“表达控制序列”是指实现表达和加工与它们连接的编码序列所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列;有效的RNA加工信号,诸如剪接和聚腺苷酸化信号;稳定胞质mRNA的序列;增强翻译效率的序列(即,Kozak共有序列);增强蛋白稳定性的序列;以及当需要时,增强蛋白质分泌的序列。这类控制序列的性质根据宿主生物体而不同。例如,在原核生物中,这类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列,而在真核生物中,典型地,这类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括其存在对于表达和加工至关重要的部件,并且还可以包括其存在有利的另外部件,例如前导序列和融合配偶体序列。
患者:如本文使用的,术语“患者”是指罹患或易患有疾病、病症或病状和/或将接受诊断、预防和/或治疗方案的给予的生物。在许多实施例中,患者显示出疾病、病症或病状的一种或多种症状。在一些实施例中,患者已被诊断患有一种或多种疾病、病症或病状。在一些实施例中,病症或病状是或包括癌症或者一种或多种肿瘤的存在。在一些实施例中,患者正在接受或已接受某种疗法来诊断、预防(即,延缓疾病、病症或病状的一种或多种症状的发作和/或频率)和/或治疗疾病、病症或病状。
肽:如本文使用的,术语“肽”是指典型地相对较短的多肽,例如长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸、或小于10个氨基酸。
药学上可接受的:如本文使用的,术语“药学上可接受的”是指在正确医学判断的范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过多毒性、刺激、过敏应答或其他问题或并发症、与合理益处/风险比相称的物质。
蛋白质:如本文使用的,术语“蛋白质”是指多肽(即,通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸的串)。蛋白质可以包括除了氨基酸以外的部分(例如,可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)并且/或者可以其他方式加工或修饰。本领域的普通技术人员将理解,“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列),或者可以是其一部分。本领域的普通技术人员将理解,蛋白质有时可以包括例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式缔合的多于一个的多肽链。多肽可以含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者,并且可以含有本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。可用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施例中,蛋白质可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。
参考物:如本文使用的,“参考物”描述了相对于其进行比较的标准或对照。例如,在一些实施例中,将药剂、动物、个体、群体、样品、序列或所感兴趣的值与参考或对照药剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施例中,参考物或对照的测试和/或确定基本上与所感兴趣的测试或确定同时进行。在一些实施例中,参考物或对照是历史参考物或对照,任选地体现在有形介质中。典型地,如本领域的技术人员将理解的,参考物或对照在与正在评估的那些相当的条件或环境下进行确定或表征。本领域的技术人员将理解,当存在足够的相似性时才能证明能够依赖特定可能的参考物或对照和/或与其进行比较。
罹患:“罹患”疾病、病症或病状(例如,癌症)的个体已被诊断患有和/或表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状。
症状减轻:根据本发明,当特定疾病、病症或病状的一种或多种症状的量级(例如,强度、严重性等)或频率减小时,“症状减轻”。出于清楚的目的,特定症状发作的延迟被认为是减少该症状频率的一种形式。并不旨在将本发明仅限于症状消除的情况。本发明特别设想了使得一种或多种症状得到减轻(并且因此“改进”受试者的状况)的治疗,尽管没有完全消除。
T细胞受体:术语“T细胞受体”或“TCR”在本文中根据本领域的典型理解用于指存在于T细胞表面上的抗原-识别分子。在正常T细胞发育期间,四种TCR基因α、β、γ和δ中的每一种都可以重排,使得特定个体的T细胞典型地表达高度多样化的TCR蛋白群体。
治疗剂:如本文使用的,短语“治疗剂”一般来讲是指当向生物体给予时引发所希望的药理学效果的任何药剂。在一些实施例中,如果药剂在适当的群体中展示出统计学显著的效果,则该药剂被认为是治疗剂。在一些实施例中,适当的群体可以是模型生物体的群体。在一些实施例中,可以通过各种准则来定义适当的群体,这些准则诸如某一年龄组、性别、遗传背景、预先存在的临床状况等。在一些实施例中,治疗剂是可以用于对疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征而言缓和、改善、解除、抑制、预防、延缓发作、降低严重性和/或降低发病率的物质。在一些实施例中,“治疗剂”是已经或需要由政府机构批准才可以销售以向人类给予的药剂。在一些实施例中,“治疗剂”是需要医学处方以向人类给予的药剂。
治疗有效量:如本文使用的,术语“治疗有效量”意指当根据治疗性给药方案向罹患或易患有疾病、病症和/或病状的群体给予时,足以治疗该疾病、病症和/或病状的量。在一些实施例中,治疗有效量是对疾病、病症和/或病状的一种或多种症状而言降低发病率和/或严重性、稳定一种或多种特征和/或延迟发作的量。本领域的普通技术人员将理解,术语“治疗有效量”实际上不需要在特定个体中实现成功的治疗。相反,治疗有效量可以是在向需要这种治疗的患者给予时,在显著数量的受试者中提供特定的所希望的药理学应答的量。例如,在一些实施例中,“治疗有效量”是指当在发明性疗法的情况下向对其有需要的个体给予时,将阻断、稳定、减弱或逆转发生在所述个体中的癌症支持性过程,或者将增强或增加所述个体中的癌症抑制过程的量。在癌症治疗的情况下,“治疗有效量”是当向诊断患有癌症的个体给予时,将预防、稳定、抑制或减少个体中癌症的进一步发展的量。本文所述的组合物的特别优选的“治疗有效量”(在治疗性治疗中)逆转恶性肿瘤诸如胰腺癌的发展或帮助实现或延长恶性肿瘤的缓解。向个体给予以在该个体中治疗癌症的治疗有效量可以与给予以促进缓解或抑制转移的治疗有效量相同或不同。如同大多数癌症疗法一样,本文所述的治疗方法不应被解释为、限制于或以其他方式局限于癌症的“治愈”;相反,治疗方法涉及使用所述的组合物来“治疗”癌症,即实现患有癌症的个体的合乎需要的或有益的健康变化。这类益处被肿瘤学领域中技术熟练的医疗保健提供者所认可,并且包括但不限于患者状况的稳定、肿瘤大小的减小(肿瘤消退)、生命功能的改进(例如,癌性组织或器官的改进的功能)、进一步转移的降低或抑制、机会性感染的减少、增加的存活能力、疼痛的减轻、改进的运动功能、改进的认知功能、改进的能量感觉(活力、不适感减少)、改进的健康感、正常食欲的恢复、健康体重增加的恢复及其组合。另外,个体中特定肿瘤的消退(例如,作为本文所述的治疗的结果)还可以通过以下方式来评估:从肿瘤部位诸如胰腺癌取癌细胞样品(例如,在整个治疗过程中),并测试癌细胞的代谢和信号传导标志物的水平来监测癌细胞的状态,以便在分子水平下验证癌细胞消退至较小恶性的表型。例如,通过采用本发明的方法诱导的肿瘤消退将通过以下来指示:发现一种或多种促血管生成标志物的减少,抗血管生成标志物的增加,在诊断患有癌症的个体中表现出异常活性的代谢通路、细胞间信号传导通路或胞内信号传导通路的正常化(即,向不罹患癌症的正常个体中发现的状态的改变)。本领域的普通技术人员将理解,在一些实施例中,治疗有效量可以单个剂量配制和/或给予。在一些实施例中,治疗有效量可以多个剂量(例如,作为给药方案的一部分)配制和/或给予。
转化:如本文使用的,“转化”是指将外源DNA引入到宿主细胞中的任何过程。转化可以使用本领域中众所周知的各种方法在自然或人工条件下发生。转化可以依赖于用于将外来核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的任何已知方法。在一些实施例中,特定的转化方法基于所转化的宿主细胞来选择,并且可以包括但不限于病毒感染、电穿孔、配合、脂质转染。在一些实施例中,“转化的”细胞被稳定转化,因为插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分进行复制。在一些实施例中,转化的细胞在有限的时间段内瞬时表达引入的核酸。
治疗:如本文使用的,术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指对特定疾病、病症和/或病状(例如,癌症)的一种或多种症状、特征和/或病因而言部分或完全缓和、改善、解除、抑制、延缓发作、降低严重性和/或降低发病率的物质的任何给予。这种治疗可以关于未表现出相关疾病、病症和/或病状的体征的受试者,并且/或者关于仅表现出该疾病、病症和/或病状的早期体征的受试者。可替代地或另外,这种治疗可以关于表现出相关疾病、病症和/或病状的一个或多个确立体征的受试者。在一些实施例中,治疗可以关于已被诊断为罹患相关疾病、病症和/或病状的受试者。在一些实施例中,治疗可以关于已知具有与相关疾病、病症和/或病状的增加的发展风险统计相关的一个或多个易感性因素的受试者。
具体实施方式
本发明尤其提供了与修饰的调节性T细胞(Treg)有关的组合物和方法,以及它们在治疗不同疾病、病症和病状中的用途。具体地,本发明设想使用工程化Treg来治疗自身免疫性和/或炎性疾病。
调节性T细胞
调节性T细胞(Treg)在维持稳态、控制炎性应答的程度和持续时间以及在预防自身免疫应答和过敏应答中是重要的。
叉头框P3转录因子(Foxp3)已经显示是Treg分化和活性中的关键调节因子。事实上,Foxp3基因中的功能缺失突变已经显示导致致死性IPEX综合征(免疫失调、多内分泌腺病、肠病、X-连锁病)。IPEX患者罹患严重的自身免疫应答、持续性湿疹和结肠炎。表达转录因子Foxp3的调节性T(Treg)细胞在限制肠中的炎性应答中起关键作用(Josefowicz,S.Z.等人.Nature[自然],2012,482,395-U1510)。
一般来讲,Treg被认为是主要参与抑制免疫应答,其功能部分地是作为对免疫系统的“自我检查”以防止过度应答。特别是,Treg参与维持对自身抗原、无害剂(诸如花粉或食物)的耐受性,和消除自身免疫疾病。
Treg存在于整个身体中,包括但不限于肠、皮肤、肺和肝。另外,Treg细胞还可以存在于身体的不直接暴露于外部环境的某些区室,诸如脾、淋巴结,以及甚至脂肪组织中。这些Treg细胞群中的每一个都是已知的或被怀疑具有一种或多种独特的特征,并且另外的信息可以见于Lehtimaki和Lahesmaa,Regulatory T cells control immune responsesthrough their non-redundant tissue specific features[调节性T细胞通过其非冗余组织特异性特征来控制免疫应答],2013,FRONTIERS IN IMMUNOL.[免疫学前沿],4(294):1-10中,该文献的披露内容以其全文并入本文中。
典型地,已知Treg需要TGF-β和IL-2用于适当的活化和发育。表达大量IL-2受体(IL-2R)的Treg依赖于由活化的T细胞产生的IL-2。已知Treg产生IL-10和TGF-β,这两者都是有效的免疫抑制性细胞因子。另外,已知Treg抑制抗原呈递细胞(APC)刺激T细胞的能力。一种针对APC抑制的提出机制是经由CTLA-4,该CTLA-4由Foxp3+Treg表达。据认为CTLA-4可以结合APC上的B7分子,并且通过引起导致B7的可用性降低的内化和无法提供足够的共刺激用于免疫应答来阻断这些分子或去除这些分子。关于Treg的起源、分化和功能的另外的讨论可以见于Dhamne等人.,Peripheral and thymic Foxp3+regulatory T cells insearch of origin,distinction,and function[探寻外周和胸腺Foxp3+调节性T细胞的起源、区别和功能],2013,Frontiers in Immunol.[免疫学前沿],4(253):1-11中,该文献的披露内容以其全文并入本文中。
STAT
信号转导及转录活化(STAT)蛋白家族的成员是介导细胞免疫、增殖、凋亡和分化的许多方面的细胞内转录因子。它们主要由膜受体相关的两面神激酶(JAK)活化。在原发性肿瘤中经常观察到该通路的失调,并导致血管生成增加,肿瘤存活率提高和免疫抑制增强。基因敲除研究已经提供了STAT蛋白参与免疫系统的发育和功能并且在维持免疫耐受性和肿瘤监视中发挥作用的证据。
已经鉴定出七个哺乳动物STAT家族成员:STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5(包括STAT5A和STAT5B)和STAT6。
细胞因子或生长因子的细胞外结合诱导受体相关的两面神激酶的活化,该两面神激酶使STAT蛋白内的特定的酪氨酸残基磷酸化,从而通过经由SH2结构域促进二聚化。然后磷酸化二聚体经由输入蛋白α/β三元复合物主动转运至细胞核。最初,因为磷酸化被认为对于核滞留是必需的,所以STAT蛋白被描述为潜在的细胞质转录因子。然而,未磷酸化STAT蛋白也在细胞质与细胞核之间穿梭,并在基因表达中发挥作用。一旦STAT到达细胞核,它就与细胞因子诱导性基因的启动子区中被称为γ活化位点(GAS)的共有区DNA识别基序结合,并活化转录。STAT蛋白可以被核磷酸酶去磷酸化,这导致STAT失活并随后通过输出蛋白-RanGTP复合物转运出细胞核。
在一些实施例中,本披露的STAT蛋白可以是包含调控其表达水平或活性的修饰的STAT蛋白。在一些实施例中,这类修饰尤其包括影响STAT二聚化、STAT蛋白与信号传导伴侣的结合、STAT蛋白定位或STAT蛋白降解的突变。在一些实施例中,本披露的STAT蛋白具有组成型活性。在一些实施例中,本披露的STAT蛋白是由于组成型二聚化而具有组成型活性的。在一些实施例中,本披露的STAT蛋白是由于组成型磷酸化而具有组成型活性的,如Onishi,M.等人.Mol.Cell.Biol[分子细胞生物学].1998年7月第18卷第7期3871-3879中所述,该文献的全部内容通过引用并入本文中。
细胞工程
本领域技术人员知道可用于细胞(例如,哺乳动物细胞、且特别是哺乳动物Treg细胞)工程化的多种多样的技术。例如,用于引入核酸以在这类细胞中表达和/或整合到这类细胞中的各种系统是本领域熟知的,用于实现细胞的表观遗传修饰的各种策略也是如此。
在一些实施例中,适合根据本披露使用的细胞工程技术可以是或包括将一种或多种异源核酸引入到细胞中。在一些实施例中,用于将异源核酸引入到细胞中的技术尤其包括转染、电穿孔(包括核转染),和转导。用于引入异源核酸的各种载体系统是本领域已知的,包括但不限于质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体和病毒系统(例如,腺病毒和慢病毒)。
在一些实施例中,适合根据本披露使用的细胞工程技术可以是或包括将一种或多种异源蛋白质引入到细胞中。在一些实施例中,用于将异源蛋白质引入到细胞中的技术尤其包括转染、用细胞渗透性肽(例如TAT)的转导,和纳米颗粒递送。
一般来讲,可以将细胞如本文所述那样工程化,使得它们表达组成型活性STAT蛋白(即,使得STAT蛋白的活性形式的水平和/或活性组成型地存在于细胞中)。本领域的普通技术人员将理解多种工程策略可以实现这种组成型活性表达。例如,仅举几个例子,在一些实施例中,可以引入STAT蛋白变体;可以引入诱导STAT表达的蛋白质,可以引入增加STAT蛋白稳定性的蛋白质,或可以引入减少STAT降解的蛋白质。
在一些实施例中,引入的核酸可以是或包括这样的序列,该序列编码STAT蛋白的部分或全部,或与编码STAT蛋白的部分或全部的核酸互补。在一些实施例中,引入的核酸可以是或包括这样的序列,该序列编码组成型地表达的STAT蛋白的部分或全部,或与编码组成型地表达的STAT蛋白的部分或全部的核酸互补。
在一些实施例中,引入的核酸可以是或包括在细胞中有功能的调节序列以调控核酸的表达,该核酸编码STAT蛋白的部分或全部,或与编码STAT蛋白的部分或全部的核酸互补。
在一些实施例中,引入的核酸可以是或包括这样的序列,该序列编码组成型活性的STAT蛋白,或与编码组成型活性的STAT蛋白的核酸互补。在一些实施例中,引入的蛋白质可以是或包括组成型活性的STAT蛋白。
在一些实施例中,本披露的方法和组合物涉及使用受试者自身的或自体的细胞。在一些实施例中,本披露的方法和组合物涉及使用异源细胞。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)是在使用被开发的工程化T细胞的治疗方法之中。CART细胞是被工程化以表达外源性抗原受体的T细胞。这类抗原受体被称为嵌合体,因为它们由来自不同蛋白质的结构域组成。在一些实施例中,CAR的部分尤其可以包括抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。
因为疾病定向的细胞工程和CAR-T细胞开发中的许多努力集中于破坏肿瘤或感染细胞,所以本领域的主要焦点一直是在对细胞溶解性T细胞(CD8+)的修饰上。本领域技术人员知道目前用CAR-T细胞的过继性细胞疗法方案包括CAR-T细胞和IL-2的共给予。
相比之下,本披露的方法和组合物设想了过继性细胞疗法方案,而不需要与IL-2共给予。可替代地,本披露的方法和组合物设想了利用与IL-2共给予的过继性细胞疗法方案。本披露的方法和组合物涉及用于治疗各种疾病、病症和病状的工程化Treg细胞。
疾病、病症和病状
在一些实施例中,本披露的方法和组合物尤其涉及对特征在于炎症的疾病、病症或病状的治疗。在一些实施例中,本披露的方法和组合物尤其涉及对特征在于自身免疫性的疾病、病症或病状的治疗。在一些实施例中,本披露的方法和组合物涉及对影响胃肠道的炎症和/或自身免疫病症的治疗。在一些实施例中,本披露的方法和组合物涉及对影响神经系统的炎症和/或自身免疫病症的治疗。
炎症
如本文所用,炎症是指血管组织对损伤、刺激或感染的局部保护性应答。炎性病状的特征在于以下症状中的一种或多种:发红、肿胀、疼痛和功能缺失。炎症是由生物体做出的去除有害刺激并开始愈合过程的保护性尝试。尽管感染是由微生物引起的,但炎症是生物体对病原体的应答之一。
炎症可被分为急性或慢性。急性炎症是身体对有害刺激的初始应答,并且通过增加血浆和白细胞(尤其是粒细胞)从血液到损伤组织中的移动来实现。一连串的生化事件传播炎症应答并使炎症应答成熟,涉及了局部血管系统、免疫系统以及损伤组织内的各种细胞。称为“慢性炎症”的长期炎症导致存在于炎症位点处的细胞类型的渐进性迁移,并且其特征在于来自炎性过程的组织的同时损坏和愈合。
炎症可能由多种药剂引起,包括感染性病原体、毒素、化学刺激物、物理伤害、过敏性免疫反应、辐射、外来刺激物(污垢、碎屑等)、冻伤和烧伤。除其他之外,移植或灌输的组织、器官或血液制品还可包括在外来刺激物的广泛分类中。移植物抗宿主病是由来自移植或灌注的组织、器官或血液制品的炎症引起的疾病、病症或病状的一个实例。炎症的类型包括结肠炎、滑囊炎、阑尾炎、皮炎、膀胱炎、鼻炎、肌腱炎、扁桃体炎、血管炎和静脉炎。
自身免疫性
自身免疫性是指自身反应性免疫应答(例如,自身抗体、自身反应性T细胞)的存在。自身免疫性疾病、病症或病状起因于通过由身体对通常存在于身体内的物质和组织的异常免疫应答引起损害或病理状态进行的自身免疫性。作为自身免疫性结果的损害或病理学可以尤其表现为组织损害或破坏、器官生长改变、和/或器官功能改变等。
自身免疫性疾病、病症或病状的类型包括I型糖尿病、斑秃、血管炎、颞动脉炎、类风湿性关节炎、狼疮、乳糜泻、舍格伦综合征(Sjogrens syndrome)、风湿性多肌痛和多发性硬化。
给予
本披露的某些实施例包括向受试者给予工程化调节性T细胞;或包含工程化调节性T细胞的组合物。在一些实施例中,从受试者获得调节性T细胞,并且如本文所述那样对该调节性T细胞进行修饰以获得工程化调节性T细胞。因此,在一些实施例中,工程化调节性T细胞包括给予到获得免疫细胞的相同受试者中的自体细胞。可替代地,从受试者获得免疫细胞,并如本文所述那样对该免疫细胞进行转化(例如转导),以获得同种异体转移到另一名受试者中的工程化调节性T细胞。
在一些实施例中,通过从含有免疫细胞的受试者中采集样品并从该样品中分离调节性T细胞来获得根据本披露使用的调节性T细胞。在一些实施例中,通过从含有免疫细胞的受试者中采集样品并分离免疫细胞亚群(例如,CD4+细胞、CD8+细胞等)以用于在体外产生调节性T细胞来获得根据本披露使用的调节性T细胞。在一些实施例中,通过从含有免疫细胞的受试者中采集样品并分离初始CD4+T细胞以用于在体外产生调节性T细胞来获得根据本披露使用的调节性T细胞。在一些实施例中,通过从含有免疫细胞的受试者中采集样品并分离初始CD8+T细胞以用于在体外产生调节性T细胞来获得根据本披露使用的调节性T细胞。
本领域技术人员知道可用于体外产生调节性T细胞的多种多样的技术。例如,在TGF-β存在下用板结合的抗CD3和可溶性抗CD28活化分离的免疫细胞。
在一些实施例中,工程化调节性T细胞是受试者自体的,并且在从受试者中分离免疫细胞之前,受试者可以是未经免疫的、免疫的、患病的或处于另一种病状中。
在一些实施例中,可以在向受试者给予工程化调节性T细胞之前进行附加步骤。例如,可以在修饰(例如,引入嵌合抗原受体和/或修饰的STAT蛋白)后但在给予受试者之前对工程化调节性T细胞进行体外扩增。体外扩增可以在向受试者给予之前进行1天或更长,例如2天或更长、3天或更长、4天或更长、6天或更长或8天或更长。可替代地或除此之外,体外扩增可以在向受试者给予之前进行21天或更短,例如18天或更短、16天或更短、14天或更短、10天或更短、7天或更短或5天或更短。例如,体外扩增可以在向受试者给予之前进行1-7天、2-10天、3-5天或8-14天。
在一些实施例中,在体外扩增期间,可以用抗原(例如,TCR抗原)刺激工程化调节性T细胞。抗原特异性扩增可以任选地用在非特异性刺激淋巴细胞增殖(例如像抗CD3抗体、抗Tac抗体、抗CD28抗体或植物凝集素(PHA))的条件下的扩增补充。扩增的工程化调节性T细胞可以直接给予到受试者中或可以冷冻以供将来使用,即用于随后向受试者给予。
在某些实施例中,工程化调节性T细胞在给予另一种治疗剂之前、基本上同时或之后给予。本文所述的工程化调节性T细胞可以形成为组合物,例如工程化调节性T细胞和药学上可接受的载剂。在某些实施例中,组合物是药物组合物,该药物组合物包含本文所述的至少一种工程化调节性T细胞和药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。本文所述的药学上可接受的载剂(例如,媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂)是本领域技术人员熟知的且易于获得的。优选地,药学上可接受的载剂对一种或多种活性剂(例如,工程化调节性T细胞)是化学惰性的,并且在使用条件下不引发任何有害的副作用或毒性。
可以将组合物配制用于通过任何适合的途径给予,该适合途径例如像静脉内、瘤内、动脉内、肌内、腹膜内、鞘内、硬膜外和/或皮下给予途径。优选地,将该组合物配制用于肠胃外给予途径。
适用于肠胃外给予的组合物可以是水性或非水性的等渗无菌注射溶液,该注射溶液可以含有例如使得组合物与预定接收者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质。水性或非水性无菌悬浮液可以含有一种或多种助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
向受试者(特别是人类)给予的剂量将随着特定实施例、所采用的组合物、给予方法和被治疗的特定部位和受试者而变化。然而,剂量应当足以提供治疗应答。本领域中技术熟练的临床医生可以确定有待向人类或其他受试者给予的组合物的治疗有效量,以便治疗或预防特定的医学病状。治疗有效所需的组合物的精确量将取决于除在本领域技术人员范围内的许多受试者特异性的考虑之外的多种因素,例如像工程化调节性T细胞的特异性活性和给予途径。
可以将任何合适数量的工程化调节性T细胞给予至受试者。虽然本文所述的单一工程化调节性T细胞能够扩增并提供治疗益处,但在一些实施例中,给予102或更多个,例如103或更多个、104或更多个、105或更多个、或108或更多个的工程化调节性T细胞。可替代地或另外地,将1012或更少个,例如1011或更少个、109或更少个、107或更少个或105或更少个的本文所述的工程化调节性T细胞给予至受试者。在一些实施例中,给予了本文所述的102-105个、104-107个、103-109个或105-1010个工程化调节性T细胞。
根据需要,本文所述的工程化调节性T细胞的剂量可以一次性地或以一系列亚剂量给予至哺乳动物,在适合的时间段内,例如,在每天、每半周、每周、每两周、每半月、每两月、每半年或每年基础上进行给予。根据需要,包含有效量的工程化调节性T细胞的剂量单位可以以单一日剂量给予,或者总日剂量可以以每天给予二、三、四或更多个分剂量进行给予。
给予途径可以是肠胃外给予,例如通过注射给予、经鼻给予、经肺给予或经皮给予。给予可以是全身性的或局部的,通过静脉注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射进行。
实例
实例1:材料与方法
本实例描述了在实例2中使用的材料与方法。
小鼠。
先前描述了Foxp3Cre和Foxp3Cre-ERT2小鼠16,43。Il2rafl小鼠是由百健公司(Biogen)惠赠。Stat5a/b fl小鼠由Lothar Henninghausen(NIH)提供。ApcMin小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)。Il2rbfl(由Ulf Klein生成)和ROSA26Stat5bCA等位基因的靶向策略示出在图15和16中。针对ROSA26基因座的靶向载体的主链由Klaus Rajewsky博士(哈佛医学院(Harvard Medical School))友好提供。编码鼠类STAT5bCA的载体由Toshio Kitamura博士(东京大学(University of Tokyo))友好提供。先前描述了Tcra fl小鼠34。将实验小鼠在C57BL/6(B6)背景上生成或回交到C57BL/6(B6)背景上,繁殖并饲养于纪念斯隆-凯特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)中的无特定病原体的动物设施中,并根据机构指南使用。为进行存活分析,每天监测小鼠,并且一旦发现它们昏睡就将不健康小鼠安乐死并且计数为非存活者。对于他莫昔芬治疗,将他莫昔芬(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))按40mg/ml的浓度溶解于橄榄油中。每次治疗小鼠被给予口服灌胃100μl他莫昔芬乳剂。在EAE和感染实验中,单一他莫昔芬灌胃2至3个月后激发小鼠并如先前所述那样进行评估37。
流式细胞术和细胞分选。
用购买自eBioscience公司、BD生物科学公司(BD Biosciences)、TonboBioscience或R&DSystems公司的荧光标记抗体对细胞染色,并使用BD LSR II流式细胞仪进行分析。使用FlowJo软件(TreeStar)对流式细胞术数据进行分析。对于细胞内细胞因子染色,在布雷菲德菌素A或莫能菌素存在下用CD3和CD28抗体(各自5μg/ml)将细胞刺激5小时,收获细胞并用eBioscience固定透化试剂盒染色。对于细胞内酪氨酸-磷酸化STAT5染色,将细胞在存在或不存在rmIL-2下刺激20min,用4%PFA、随后用90%甲醇固定和透化,并且用抗PY-STAT5抗体(BD生物科学公司)染色。使用BD FACSAria II细胞分选仪基于YFP或GFP表达进行对Foxp3+和Foxp3-细胞的细胞分选。将以下单克隆抗体用于流式细胞术:B220(RA3-6B2)、CD103(2E7)、CD11b(M1/70)、CD11c(N418)、CD122(5H4)、CD127(A7R34)、CD132(TUGm2)、CD25(PC61)、CD3(17A2)、CD4(RM4-5)、CD44(IM7)、CD45(30-F11)、CD62L(MEL-14)、CD69(H1.2F3)、CD8(5H10)、CD80(16-10A1)、CD86(GL1)、CTLA-4(UC10-4B9)、Foxp3(FJK-16s)、GITR(DTA-1)、Gr-1(RB6-8C5)、IFNγ(XMG1.2)、IL-13(eBio13A)、IL-17(eBio17B7)、IL-4(11B11)、Ki-67(B56)、KLRG1(2F1)、II类MHC(M5/114.15.2)、PY-STAT5(47/Stat5/pY694)、TCRβ(H57-597)、TNFα(MP6-XT22)、Vβ10b(B21.5)、Vβ11(RR3-15)、Vβ12(MR11-1)、Vβ13(MR12-3)、Vβ14(14-2)、Vβ2(B20.6)、Vβ3(KJ25)、Vβ4(KT4)、Vβ5.1/5.2(MR9-4)、Vβ6(RR4-7)、Vβ7(TR310)、Vβ8.1/8.2(MR5-2)、Vβ8.3(1B3.3)、Vβ9(MR10-2)。李斯特氏菌和牛痘感染。
在第0天用单核细胞增生李斯特氏菌(LM10403S;2000个细胞/小鼠)静脉注射到小鼠尾静脉中,并在第8天进行分析。为检测李斯特氏菌特异性免疫应答,将使用CD11c微珠(美天旎公司(Miltenyi))从未激发B6小鼠分选的脾DC在96孔U型底板(2×104个细胞/孔)的孔中与热灭活的单核细胞增生李斯特氏菌(2×107个细胞/孔)一起培养6小时,之后进行分析。然后在布雷菲德菌素A存在下将细胞与从李斯特氏菌感染的小鼠中获得的脾T细胞(1×105个细胞/孔)共培养5小时,并且通过流式细胞术检测产生细胞因子的T细胞。对于牛痘病毒感染,在第0天对小鼠腹膜内注射非复制型病毒(5×107个PFU/小鼠),并在第8天进行分析。在布雷菲德菌素A存在下,将脾细胞用若干种牛痘病毒衍生的抗原肽(1μg/ml)再刺激5小时,并通过流式细胞术检测产生细胞因子的T细胞。
体内IL-2中和。
从出生后7天开始,对小鼠腹膜内注射两种不同的抗IL-2单抗抗体JES6-1和S4B6-1(BioXcell公司)的混合物或同种型匹配的对照抗体(大鼠IgG2a,2A3;BioXcell公司),各自200μg,一周两次。
对T细胞的TAT-Cre蛋白处理。
为诱导非Treg细胞中的STAT5bCA表达,将从Foxp3CreROSA26Stat5bCA小鼠的LN和脾中分选的1×107个CD4+Foxp3-或CD8+Foxp3-T细胞重悬于2ml的含有TAT-Cre重组酶(密理博公司(Millipore);50μg/ml)的无血清RPMI培养基中并在37℃下孵育45min。将这些细胞用含有10%FCS的RPMI洗涤,重悬于PBS中,并且在与或不与单独分选的Treg细胞一起的情况下注射到T细胞缺陷型(Tcrb-/-Tcrd-/-)小鼠中以用于体内抑制测定。
体外IL-2捕获测定。
将来自LN和脾的合并细胞通过淘选消耗B细胞和附属细胞并富集T细胞。将这些细胞用抗CD8和抗B220Ab染色,并且在CD8-阴性群体中仅基于GFP(YFP)表达对CD4+Treg细胞进行分选。在具有或不具有增加剂量的重组人IL-2(0.016U/ml至12U/ml)的25μl RPMI培养基(10%FCS)中,将这些分选的细胞分在96孔V型底板的8个孔(2×105个细胞/孔)中,随后在37℃下孵育2小时。根据制造商的说明书(BD生物科学公司),用BD流式细胞术珠粒阵列和人IL-2增强的敏感性Flex Set评估从培养基对IL-2的消耗。
体外T-DC缀合测定。
以与IL-2捕获测定相同的方式分选Treg细胞和非Treg细胞。通过MACS从注射有分泌Flt3L的B16黑色素瘤细胞的B6小鼠中分离脾CD11c+DC。用CFSE对Treg细胞和非Treg细胞染色。用CellTrace紫(分子探针公司(Molecular Probes))对DC染色。在rmIL-2(100IU/ml)存在或不存在下,将1×104个Treg或非Treg细胞与分级数量的DC(1×104至1×105个)一起在96孔圆底板中培养720min。通过FACS分析与DC缀合的Treg细胞的频率(%CTV+CFSE+/CFSE+)。
体外抑制测定。
将初始CD4+T细胞(应答细胞)和Treg细胞FACS纯化,并用CellTrace紫(CTV)染色。在96孔圆底板中,在1×105个经辐射、T细胞消耗、CFSE染色的脾细胞和1μg/ml抗CD3抗体存在下将4×104个初始CD4+T细胞与分级数量的Treg细胞一起培养80小时。通过流式细胞术,基于对门控细胞的CTV荧光强度的稀释测定应答T细胞和Treg细胞(活的CFSE-CD4+Foxp3-和Foxp3+)的细胞增殖。
对血清和粪便免疫球蛋白水平的测量。
使用SBA Clonotyping系统(南方生物技术公司(Southern Biotech))通过ELISA测定血清IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3和IgA水平。使用生物素化的抗IgE抗体(BD生物科学公司)和HRP缀合的链霉亲和素进行IgE ELISA。为测量粪便IgA水平,收集新鲜粪粒的并将这些粪粒溶解于含有50mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.5%NP-40、1mM EDTA、1mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物(完全小量;罗氏公司(Roche))的提取缓冲液(7μl/mg粪粒)中。离心后收集上清液、进行滴定并且通过ELISA测量IgA水平。
对于动物实验的统计分析
使用Prism软件用双尾非配对学生t检验来进行统计分析。当F检验为正时应用韦尔奇校正(Welch’s correction)。P值<0.05被认为是显著的。*,P<0.05;**,P<0.01;***,P<0.001;NS,不显著。
RNA测序。
使雄性8周龄Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA(STAT5bCA)和Foxp3Cre-ERT2(对照)小鼠(每个实验组九只小鼠)通过口服灌胃接受单一剂量的(4mg)的他莫昔芬。使用BD FACSAria II细胞分选仪对脾CD4+Foxp3(YFP/GFP)+GITRhiCD25hi Treg细胞和CD4+Foxp3(YFP/GFP)-CD62LhiCD44lo初始T细胞进行双重分选,并且总共生成12个样本。将从同一实验组中的三只单独小鼠中分离的脾T细胞亚群合并成一次生物学重复;针对每个实验组对三个生物学重复进行RNA序列分析。遵循制造商的方案提取总RNA并用于poly(A)选择和IlluminaTruSeq配对末端文库制备。在Illumina HiSeq 2500上对样品测序至每个样品平均深度为27.5百万50-bp读取对。将所有样品同时处理并且在同一泳道上测序以避免批次效应。
遵循先前所述的方法进行读取比对和处理45。简言之,使用具有标准设置的Trimmomatic v0.32修剪原始读取以去除低质量的读取和适配器污染46。然后使用实施Bowtie2v2.2.2的TopHat2v2.0.11在默认设置下将修剪的读取与小鼠基因组(Ensembl组件GRCm 38)进行比对。在使用HTSeq v0.6.1p1计数到基因组特征之前,使用SAMtools v0.1.19对读取比对进行分类。关于所有样品的总读取比对率为74.5%。在R 3.1.0版本中使用DESeq2 1.6.3分析差别基因表达47。
对RNA序列的生物信息学分析
关于所有基因的读取计数分布是双峰的。通过检查已知在Treg和T初始细胞中表达或不表达的标志物基因来支持此分布对应于“表达的”和“非表达的”基因的假设。选择两个峰之间的局部最小值作为用于表达的阈值。使用约60个标准化读取的此阈值,39,179个基因中有10,589个基因被称为是存在的。在STAT5bCA与对照Treg细胞之间显著上调(342个基因)和下调(314个)的基因被分别定义为倍数变化为至少1.5×或0.67×、且FDR调整的P值≤0.05的表达基因。
与TCR充足型CD44hi Treg细胞相比,TCR-上调的(即,TCR依赖性)基因被定义为在TCR缺陷型细胞中是下调的(至少0.57×倍数变化)基因,但TCR-下调的基因在TCR缺陷型CD44hi Treg细胞(GSE61077)中是上调的(至少1.75×,Padj≤0.001)34。活化-上调的基因是在来自从准时调节性T细胞消耗(GSE55753)中复原的Foxp3DTR小鼠的Treg细胞中上调的(2×倍数变化,Padj≤0.01)基因33。
使用相同名称的R包进行信号传导通路影响分析(SPIA)48。针对在2015年10月5日访问的90只小家鼠KEGG通路的富集和扰动,将显著上调和下调的基因及其倍数变化作为一个集进行分析。使用观察到的净扰动累积以及净扰动累积的零分布的平均值和SD来计算净通路扰动Z得分。使用常规反演方法和Bonferroni校正计算全局P值。
使用Cytoscape v3.2.1中的BiNGO v3.0.3 49,采用超几何分布检验,并应用FDR调整的P值≤0.05的显著性截点来计算生物过程(BP)基因本体(GO)词条过表达。输入10,589个表达基因作为参考集,并且使用的GO本体和注释文件是在2015年10月25日下载的(图14)。将来自BiNGO的输出输入到Cytoscape中的EnrichmentMap v2.0.1 50中来群集冗余GO词条并将这些结果可视化。使用Jaccard相似系数截点0.2,P值截点0.001,FDR调整的截点0.005,并排除具有少于10个基因的基因集,生成了EnrichmentMap。利用使用默认设置和500次迭代的prefuse力导向布局法将网络可视化。将相似的GO词条的组手动圈起来。
实例2:IL-2受体和STAT在调节性T细胞功能中的作用
本实例证明IL-2捕获对于CD4T细胞的控制是非必要的,但对于限制CD8T细胞活化是重要的,并且证明IL-2R依赖性STAT5活化在可与TCR信号传导分开的Treg抑制功能中发挥至关重要作用。
表达转录因子Foxp3的调节性T(Treg)细胞限制对自身抗原和外源抗原的免疫应答1-3。Treg细胞表达大量的白介素2受体α链(IL-2Rα;CD25),但不能产生IL-2。IL-2以低亲和力结合IL-2Rα或常见的γ链(γc)/IL-2Rβ异二聚体,但当这三个亚基与IL-2一起形成复合物时,受体亲和力增加约1,000倍4。IL-2和STAT5(关键的IL-2R下游靶标)对于胸腺中的Foxp3诱导和Treg细胞分化是不可缺少的5-11。IL-2Rβ和γc共享IL-15受体,该IL-15受体的信号传导也可以促成Foxp3的诱导12。与TGF-β合作的IL-2也是胸腺外Treg细胞分化所必需的13。
尽管先前的研究已经很好地确立了IL-2R信号传导在胸腺中诱导Foxp3表达和Treg细胞分化中的作用,但是在成熟Treg细胞中IL-2R表达的重要性尚不充分了解。尽管STAT5的缺陷消除了Foxp3的表达,但可以通过增加抗凋亡分子Bcl2的量来挽救。这一发现提出了一种可能性,即IL-2的主要作用是在分化Treg细胞或其前体的存活中13。还据报道,Bim消融可以挽救Treg细胞或其前体免于与IL-2或IL-2R缺陷相关的细胞凋亡并恢复Treg细胞数目,但它不能防止致命的自身免疫性15。然而,IL-2、Bcl2和Bim的先天性缺陷对Treg自身反应性效应T细胞的分化和选择的深远影响使该观察结果的解释变得混乱。
在切除胸腺的小鼠中抗体介导的IL-2中和减少了Treg细胞数目和Treg细胞中的Foxp3表达16,17。因此,IL-2支持分化后的Treg细胞谱系稳定18,19。然而,据报道,编码IL-2Rβ链的转基因仅在胸腺细胞中的表达挽救了Il2rb-/-小鼠中的致死性自身免疫疾病,这表明IL-2R表达在外周Treg细胞中是非必要的7,11。因此,IL-2R表达和信号传导在外周Treg细胞中的作用仍然不确定。假设,IL-2R在外周Treg细胞中的作用可能是三重的:1)指导Treg细胞感知其靶标-充当IL-2来源的活化的自身反应性T细胞;2)Treg细胞介导的IL-2丧失以作为抑制机制,和3)在分化的Treg细胞中细胞内源性IL-2信号传导以支持其维持、增殖或功能,这归因于对JAK-STAT5、PI3K-Akt、或Ras-ERK信号传导通路的触发。以前的研究主要集中于Foxp3的诱导或维持,而由于前述限制,IL-2R功能的其他方面尚未牢固地确立。
尽管它们高度依赖IL-2用于维持Foxp3表达,但Treg细胞不能产生IL-2。抑制Treg细胞中STAT5的自体活化的原因,以及这种基于IL-2的Treg-Teff细胞调节环路的潜在生物学意义,也是未知的。已经表明,需要抑制IL-2以维持Treg细胞上高亲和力IL-2R的‘未结合’状态,并且未结合的IL-2R通过使Teff细胞丧失IL-2而在Treg细胞介导的抑制中起关键作用20-24,然而,在体内抑制中这种机制是否具有非冗余作用是未知的。
为了解决IL-2R和下游信号传导通路在分化的Treg细胞中的作用,我们在表达Foxp3的细胞中消融了IL-2Rα、IL-2Rβ和STAT5。通过同时诱导STAT5的组成型活性形式的表达,我们评估了IL-2R表达和IL-2信号传导对Treg细胞稳态相对于抑制活性的差异要求。我们发现,虽然IL-2R下游的连续STAT5信号传导维持高亲和力IL-2R的表达,但STAT5活化完全消除了为抑制CD4+T细胞而对IL-2R的需要。然而,由Treg细胞表达的IL-2R对IL-2的捕获对于抑制CD8+T细胞是不可缺少的。我们的研究表明,CD8+T细胞中IL-2信号传导下游的过量STAT5活化赋予对Treg细胞介导的抑制的耐性。STAT5活化不仅增加了Treg细胞中的Foxp3表达水平并促进了Treg细胞的扩增,而且还加强了它们的抑制活性。值得注意的是,即使不存在TCR信号传导,抑制活性也会增加。除了已经在先前的大量工作中显示的IL-2信号传导在Foxp3表达和Treg细胞数目的诱导和维持中的至关重要作用之外,我们的研究证明了IL-2R和STAT5活化在分化的Treg细胞的体内抑制功能中的重要且不同的作用。
结果
IL-2R对于Treg细胞功能是不可缺少的为了确立IL-2R在体内Treg细胞功能中的作用,我们生成了条件型Il2rb等位基因并在使用由内源性Foxp3基因座(Foxp3Cre)驱动的Cre重组酶表达Foxp3后诱导其消融。Il2rbfl/flFoxp3Cre小鼠发生系统性致命的自身免疫炎性病变和淋巴组织增殖,但是比Foxp3-小鼠中观察到的症状稍微温和(图1a-c)。在外周IL-2Rβ缺陷型Treg细胞中IL-2Rα表达减少(图1d),并且缺乏响应于IL-2的STAT5酪氨酸磷酸化(图1e)。CD4+T细胞中的Foxp3+细胞的频率和基于每个细胞的Foxp3表达水平均同时降低(图1f)。在健康的杂合Il2rbfl/flFoxp3Cre/WT雌性中,其中由于随机X-染色体失活,IL-2Rβ-充足型(YFP+)和-缺陷型(YFP-)Treg细胞同时共存,IL-2Rβ缺陷型Treg细胞未被充分表示(图1g,h)。已经表明IL-2对维持CD62LhiCD44lo Treg细胞亚群是选择性需要的,但对于CD62LloCD44hi Treg细胞是非必要的25。然而,我们发现在健康的杂合雌性中CD62LhiCD44lo和CD62LloCD44hi Treg细胞亚群两者在不存在IL-2Rβ下均显著减少。在这些小鼠中,不管CD62L和CD44表达如何,IL-2Rβ缺陷型Treg细胞表达减少量的Foxp3和Treg细胞“标签”分子IL-2Rα链(CD25)、CTLA-4、GITR和CD103(图1i,j和图7a)。尽管在患病Il2rbfl/flFoxp3Cre小鼠中,大多数Treg细胞是CD62LloCD44hi,这可能是严重炎症的结果,因为Treg细胞频率还在CD62LloCD44hi细胞普遍存在的位点(即,小肠和大肠)处显著降低(图7b)。因此,作为Il2rbfl/flFoxp3Cre小鼠中Treg细胞活化的结果,除了CD25和Foxp3,许多特征性Treg细胞标志物是上调的(图7c)。这些观察结果表明CD62LhiCD44lo和CD62LloCD44hiTreg细胞亚群两者,包括驻留在非淋巴组织中的那些,都依赖于IL-2,但是在炎性条件下后者可以通过IL-2R非依赖性信号在一定程度上维持。尽管CTLA-4、GITR、ICOS和CD103上调,但来自Il2rbfl/flFoxp3Cre小鼠的“活化的”IL-2Rβ缺陷型Treg细胞仍然无法控制患病小鼠中的炎症,并且当与Teff细胞共转移至淋巴细胞减少的受体中时不具有抑制性(数据未显示)。
我们的研究结果提出了一个问题,即与Foxp3CreIl2rbfl/fl小鼠相比,消融除了促进IL-2信号传导还使IL-2能够与Teff细胞隔离的IL-2Rα是否会导致相似的Treg细胞缺陷和疾病。因此,我们生成了条件型Il2ra等位基因并且类似地在Treg细胞中诱导其消融。我们发现Treg细胞特异性IL-2Rα缺陷导致具有与IL-2Rβ消融时观察到的结果相当的早期发作和严重性的疾病(图8a-c)。值得注意的是,在与我们的条件型敲除小鼠相同的C57BL/6背景的小鼠中,Il2ra或Il2rb种系缺陷导致发作延迟、侵袭性大大减小的疾病,这可能是由于IL-2R信号传导在Teff细胞中的作用(未示出数据)。我们的研究结果还表明IL-15不能有效地补偿分化的Treg细胞中的IL-2信号传导的缺失,因为在Foxp3CreIl2rafl/fl小鼠中,Treg细胞仅缺乏IL-2信号传导,然而在Foxp3CreIl2rbfl/fl小鼠中,它们缺乏IL-2和IL-15信号传导两者,但受到类似的影响。这与其中IL-15可部分地促成Foxp3诱导的胸腺中的Treg细胞分化形成对比12。由于IL-2R活化PI3K–Akt、MAPK和JAK–STAT5信号传导通路,我们接下来试图评估IL-2R信号传导下游的STAT5活化在Treg细胞中的作用。我们发现STAT5消融同样损害了Treg细胞功能,并且Foxp3CreStat5a/bfl/fl小鼠与携带IL-2R缺陷型Treg细胞的小鼠类似地受到致命的自身免疫性的影响(图8d-h)。
STAT5活化挽救了IL-2R-缺陷型Treg细胞抑制淋巴增殖性疾病和抑制CD4+T细胞活化而不是CD8+T细胞活化的能力
上述发现暗示IL-2R下游的STAT5活化是Treg细胞功能持续需要的。然而,在STAT5缺陷型Treg细胞中观察到的IL-2R的显著减少(图8d)使得不可能将STAT5的缺失与所有IL-2R功能的损伤分开,即IL-2的检测、STAT5依赖性和非依赖性信号的转导,和IL-2的消耗和丧失作为观察到的严重Treg细胞功能异常的关键根源。
为了解决这一重要警告,并了解STAT5与IL-2R的作用,我们想知道STAT5b的功能获得形式的表达在不存在IL-2R下是否可以挽救Treg细胞功能。在不存在IL-2Rβ下使用编码由近端lck启动子驱动的STAT5b(STAT5bCA)的组成型活性形式的转基因的先前研究显示出对胸腺中Treg细胞分化的挽救,但对淋巴增生综合征并非如此9。然而,在胸腺生成期间早期该转基因的表达导致白血病性淋巴细胞增殖,这使得对这些发现的解释变得复杂。此外,近端lck启动子的活性和转基因的表达在这些小鼠的外周T细胞中均减少9。因此,我们利用ROSA26“基因捕获”基因座26生成基因靶向小鼠品系,在该基因座中CAG启动子驱动的STAT5bCA27之前是loxP侧接的STOP盒(图2a)。在所得ROSA26Stat5bCA小鼠中,仅当loxP位点经历Cre介导的重组时才表达STAT5bCA。将ROSA26Stat5bCA等位基因引入到Foxp3CreIl2rbfl/fl小鼠中,并随后在IL-2Rβ缺陷型Treg细胞中STAT5bCA的表达挽救了系统性炎症和早期致命疾病(图2b)。在这些小鼠中,Treg细胞频率和数量相对于或甚至超过野生型(Foxp3Cre)小鼠中的水平(图2c)。值得注意的是,尽管不存在IL-2Rβ链,IL-2Rα链的表达仍增加(图2c),这表明IL-2Rα在Treg细胞上的表达主要受STAT5依赖性信号传导而不是STAT5非依赖性信号传导控制。重要的是,这些具有提高的IL-2Rα表达的IL-2Rβ缺陷型Treg细胞对IL-2仍无应答(图2d)。
观察到的IL-2Rβ缺陷型Treg细胞的抑制功能的恢复和STAT5bCA表达后对早期致命疾病的挽救提出了重新引入的高IL-2Rα水平负责这些效应的可能性。然而,STAT5bCA的表达类似地挽救了Foxp3CreIl2rafl/fl小鼠中的早期致命疾病(图2e和图9)。重要的是,尽管Foxp3CreIl2rbfl/fl和Foxp3CreIl2rafl/fl小鼠中Treg细胞捕获和消耗IL-2的受损能力在STAT5bCA表达后没有得到挽救(图2f),但是在这些小鼠中CD4+T细胞反应性得到了完全控制(图2g和图9c-e)。这些结果表明捕获和竞争IL-2的能力对于Treg细胞介导的CD4+T细胞应答抑制是非必要的。相比之下,然而,CD8+T细胞的扩增,特别是活化的CD62LhiCD44hiCD8+T细胞的扩增仅在这些小鼠中受到轻微限制(图2g和图9c,e)。
在新生小鼠中,尽管CD8+CD62LloCD44hi亚群的扩增虽不是完全但相对较好地受到控制(图2g和图9c),但该亚群在这些小鼠中也早在出生后2至3周逐渐开始扩增(未示出数据示)。尽管Foxp3CreIl2rbfl/f ROSA26Stat5bCA和Foxp3CreIl2rafl/flROSA26Stat5bCA小鼠均从过早死亡中得到挽救并显示出与健康对照相比显著改进的临床状态,但早在出生后12周它们就无法逐渐成长并开始死于伴有在LN和组织中大量扩增活化的CD62LhiCD44hi和CD62LloCD44hi CD8+T细胞亚群的疾病(未示出数据)。这些发现提出了由Treg细胞进行的IL-2消耗,虽然对于控制CD4+T细胞是非必要的,但对于限制CD8+T细胞是重要的可能性。
由Treg细胞进行的IL-2消耗对于Treg细胞体内抑制CD8+T细胞的能力是至关重要的为了测试对由Treg细胞进行的IL-2消耗的损伤是否可以解释Foxp3CreIl2rbfl/ flROSA26Stat5bCA小鼠中CD8+T细胞的扩增,我们在7日龄时开始向这些小鼠和对照小鼠给予IL-2中和抗体(图2h和图10a)。由于IL-2支持胸腺中Treg细胞的分化,所以IL-2中和降低了所有小鼠组中Treg细胞的频率,并诱导了对照Foxp3CreIl2rbfl/wt小鼠中的免疫活化。在自发地发展疾病的Foxp3CreIl2rbfl/fl小鼠中,CD4+T细胞对Th2细胞因子IL-4和IL-13的产生通过IL-2中和显著减少;然而,CD4+和CD8+T细胞的活化最多只是少量地减少或不受影响。相比之下,在Foxp3CreIl2rbfl/flROSA26Stat5bCA小鼠中观察到的CD8+T细胞的活化和扩增几乎完全受到该治疗的抑制。
在Foxp3CreIl2rbfl/f ROSA26Stat5bCA和Foxp3CreIl2rafl/flROSA26Stat5bCA小鼠中CD8+CD62LloCD44hi的相对减少和CD8+CD62LhiCD44hi T细胞亚群的更显著的扩增提出了由Treg细胞进行的IL-2消耗的丧失可能选择性地损伤Treg细胞对记忆CD8+T细胞扩增的抑制,而不损伤将初始CD8+T细胞向效应细胞池中募集的可能性。我们通过将CD4+和CD8+细胞亚群过继转移到淋巴细胞减少的受体中来测试这一想法(图2i)。与在Foxp3Cre小鼠中的观察结果一致,IL-2R-缺陷型Treg细胞对CD4+T细胞扩增和活化的受损抑制通过STAT5bCA得到完全挽救;相比之下,它们抑制记忆CD8+T细胞的能力没有恢复,而对初始CD8+T细胞扩增和活化的抑制仅部分恢复。因此,由Treg细胞进行的IL-2消耗似乎在抑制初始和记忆CD8+T细胞亚群两者的扩增和活化中具有非冗余作用,但是这种机制似乎在控制后一种亚群中特别突出。
尽管在Foxp3CreIl2rbfl/fl和Foxp3CreIl2rbfl/flROSA26Stat5bCA小鼠中的大多数活化的CD8+T细胞不表达可检测水平的IL-2Rα(图10a),但这些细胞可以响应于IL-2而活化STAT5,尽管程度与表达IL-2Rα的细胞中观察到的程度相比较小(图10b)。一部分具有不可检测的IL-2Rα表达的活化CD4+T细胞也对IL-2有应答,但它们中的大多数并没有。CD8+初始T(T初始)细胞也对IL-2有应答,而CD4+T初始细胞并没有。因此,初始和活化的CD8+T细胞两者似乎对IL-2比CD4+T细胞更敏感,并且由Treg细胞进行的IL-2消耗可显著影响它们的活化。这一观点的推论是CD8+T细胞中的STAT5活化,而不是CD4+T细胞中的STAT5活化可能使CD8+T细胞对Treg细胞介导的抑制具有耐性。因此,我们测试了在Treg细胞存在下STAT5活化对CD4+和CD8+T细胞的扩增的影响。为此,我们从Foxp3CreROSA26Stat5bCA小鼠中分选CD4+Foxp3-和CD8+Foxp3-T细胞,并通过用含有膜可透性TAT肽(TAT-Cre)的重组Cre蛋白处理细胞来诱导这些细胞中STAT5bCA的表达。我们将处理的细胞过继转移到具有或不具有Treg细胞的淋巴细胞减少的受体中。尽管TAT-Cre处理最初在大约30%的处理的CD4+和CD8+T细胞中诱导了STAT5bCA表达,但超过95%的CD8+T细胞在转移后三周表达了STAT5bCA;而表达STAT5bCA的CD4+T细胞扩增至40%-50%(图2j)。值得注意的是,STAT5bCA+CD8+T细胞在野生型(Foxp3Cre)或STAT5bCA+Treg细胞存在下稳健地扩增(图2j,k)。尽管仍然观察到Treg细胞对STAT5bCA+CD8+T细胞的一定程度的抑制,但与对STAT5bCA-CD8+T细胞的抑制相比,它非常温和(图2k)。相反,不管STAT5bCA的表达如何,活化的CD4+T细胞的增殖和细胞因子产生被Treg细胞很好地控制。这些观察结果表明CD8+T细胞中的STAT5活化,而不是CD4+T细胞中的STAT5活化促使细胞稳健扩增,并赋予对Treg细胞介导的抑制的明显耐性。与这些发现一致,其中以IL-2/抗IL-2免疫复合物的形式提供IL-2的功能获得实验显示出CD8+T和CD4+Treg的扩增,而不是CD4+T细胞的扩增28。因此,虽然捕获和竞争IL-2的能力对于Treg细胞介导的CD4+T细胞应答抑制是非必要的,但这种抑制模式似乎对于控制CD8+T细胞至关重要,该CD8+T细胞比CD4+T细胞更稳健地响应于过量的IL-2。
Treg细胞中STAT5的自主活化增强免疫抑制
在Foxp3CreIl2rbfl/flROSA26Stat5bCA和Foxp3CreIl2rafl/flROSA26Stat5bCA小鼠中,和从Cre-介导的重组中逃逸(反选择)的IL-2R充足型Treg细胞的响应于IL-2的可检测STAT5活化和STAT5bCA驱动的扩增的缺乏表明STAT5的组成型活性形式的表达解除了Treg细胞对IL-2信号传导的依赖。该发现提供了通过将Treg细胞功能与Teff细胞产生的IL-2解偶联来探究前述IL-2依赖性Treg-Teff细胞调节网络的生物学意义的独特机会。为了解决此问题,我们生成了ROSA26Stat5bCAFoxp3Cre-ERT2小鼠,该小鼠能够在分化的Treg细胞中实现他莫昔芬诱导的STAT5bCA表达16。单一他莫昔芬给予后,在约20%-30%的Treg细胞中诱导了STAT5bCA表达,随后它们的数量在牺牲具有非重组ROSA26Stat5bCA等位基因的Treg细胞的情况下快速增加(图11a,b)。实验Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠保持健康(图11c,d)。在这些小鼠中,扩增的STAT5bCA+Treg细胞群表现出增加量的Foxp3、CD25、CTLA4和GITR,以及CD62LhiCD44hi相对于CD62LhiCD44lo细胞的比例增加,这表明STAT5bCA对Treg细胞群外加向活化的或“记忆”细胞状态的偏倚(图3a-d,图11f)。与后一种可能性一致,IL-7R、KLRG1和CD103的表达水平增加(图3d)。值得注意的是,这些细胞表现出与对照小鼠类似的高度多样化的TCRVβ使用(图11e)。诱导STAT5bCA后CD8+Foxp3+细胞也是增加的(图11h)。表达活性STAT5的“自主”Treg细胞有效抑制CD4+和CD8+T细胞亚群的活化和增殖活性的基础状态,如由数量减少的Ki-67+细胞和CD62LloCD44hi Teff细胞和显著增加的CD62LhiCD44lo T初始细胞池所证明(图3e和图12a,b)。值得注意的是,在淋巴结(LN)和派尔集合淋巴结(PP)中,尽管STAT5bCA+Treg细胞占优势,但Treg细胞并未在数量上增加(图11b,g);然而,这些组织中的Teff细胞应答也减弱(图12a,b),这表明由STAT5的组成型活性形式赋予增加的抑制功能。体外抑制测定还揭示出STAT5bCA+Treg细胞的提高的抑制活性(图11i)。相应地,CD4+T细胞的促炎细胞因子产生(最突出地IL-4)和B细胞和树突细胞(DC)对CD80和CD86的表达是减少的(图12c和图3f)。先前,提出了Treg细胞在肠道中促进系统性Th17型应答和IgA类转换29,30。然而,我们发现在STAT5bCA+Treg细胞存在下,血清和粪便IgA以及次级淋巴器官中的Th17应答减少,而不是增加(图3g和图12c)。血清IgM和IgE也显示出降低的趋势,但这不是统计学上显著的(图12d)。这些结果与在急性Treg细胞消融后观察到的Th17应答增加以及Th2-和Th1-型Ig类别转换一致31。由于改变的肠道免疫应答与促进结肠癌发生有关,我们探究了在结肠直肠癌的ApcMin模型中由活化的STAT5提供的Treg细胞抑制功能的增加的效果。携带ApcMin突变的小鼠在小肠中形成多个腺瘤性息肉32。ApcMinFoxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠产生相当的或更少数量的息肉,但平均的息肉大小是增加的(图12e)。这些结果与以下观点一致:一旦形成肿瘤或癌前病变,肿瘤微环境中Treg细胞对炎症的抑制就促进肿瘤的生长。然而,结肠癌发生的早期阶段似乎没有得到促进,但可能受到具有增强的抑制活性的Treg细胞的潜在抑制。
除了限制生理环境中的基础免疫反应和调节结肠癌发展外,“自主”Treg细胞还提供了对抗自身抗原诱导的自身免疫性的优异保护作用。我们发现Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)具有高度抗性(图4a-c)。这些小鼠的脑和脊髓中CD4+Foxp3+细胞的频率显著增加(图4b),并且炎性细胞(包括中性粒细胞和产生IL-17的CD4+Th17细胞)向这些器官中的浸润显著减少(图4c)。Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠的病原体特异性应答也减弱。在STAT5bCA+Treg细胞存在下,虽然李斯特氏菌特异性Th1应答仅被适度抑制(图4d),但牛痘病毒特异性CD8+T细胞应答显著降低(图4e)。我们观察到的对感染因子的应答减弱和对癌症进展的调控可能提供了关于为什么Treg细胞缺乏IL-2产生和STAT5自主活化,而是依赖作为IL-2来源的活化的T细胞的目的论理论根据。
STAT5信号传导在Treg细胞基因表达和抑制功能中的TCR非依赖性作用。
接下来,我们力求解决持续的STAT5信号传导如何加强Treg细胞抑制能力的问题。在遗传功能缺失和获得的研究中,Treg细胞中STAT5活性与Treg细胞增殖能力和IL-2Rα和Foxp3的表达水平相关。然而,体外抑制测定的前述结果,以及Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠的LN和PP中的免疫活化减少(发现其中Treg细胞与对照小鼠中相比更少)表明在Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠中观察到的增强的免疫抑制不仅仅是由于Treg细胞的数量增加,而是它们的以每个细胞为基础的抑制活性也是增强的。在STAT5bCA存在下,Foxp3的轻度上调也不太可能解释Treg细胞抑制活性的增加,因为我们发现全基因组的Foxp3结合在Treg细胞活化后未改变,从而导致比由STAT5bCA导致的Foxp3表达更明显的Foxp3表达33。与对照相比,STAT5bCA+Treg细胞中Foxp3表达水平的增加在CD25lo Treg细胞亚群中特别明显(图3b),这与STAT5bCA+Treg细胞解除其对IL-2的依赖性的观察结果一致。然而,当与效应T细胞共转移至淋巴细胞减少的受体中时,STAT5bCA+Treg细胞表现出比来自对照小鼠的CD25hiFoxp3hi Treg细胞更有效的抑制功能,但与来自对照小鼠的CD25hiFoxp3hi Treg细胞相比,Foxp3的表达同等高(未示出数据)。因此,STAT5bCA+Treg细胞的抑制活性增加不能归因于Foxp3水平的增加。
为了深入了解由持续的STAT5活化所赋予的增强的抑制功能的潜在机制,我们从Foxp3Cre-ERT2和Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠中分选表达相当水平的Foxp3的成熟Treg细胞,并使用RNA序列分析这些细胞中的基因表达。虽然来自两个小鼠组的CD4+T初始细胞的基因表达谱几乎相同,但Treg细胞基因表达受STAT5的活性形式的显著影响(图5和图13a)。在所分析的Treg或CD4+T初始细胞群中的所有表达基因(约11,000个)中,与对照细胞相比,在STAT5bCA+Treg细胞中342个基因是上调的,并且314个基因是下调的(图5b和图13b)。在STAT5bCA+Treg细胞中上调的基因集编码参与细胞粘附、迁移和细胞骨架重组的各种细胞表面分子和受体(图5c)。与T初始细胞相比,在对照Treg细胞中上调或下调的若干个基因在STAT5bCA+Treg细胞中显示出相反的趋势,这表明STAT5bCA不仅仅强化Treg细胞标签。我们最近的研究显示,将Treg细胞暴露于短暂的Treg细胞消耗时诱导的炎症导致Treg细胞基因表达的显著变化和它们抑制功能的有效增加33。与STAT5bCA+Treg细胞的抑制功能提高一致,我们发现由STAT5的组成型活性形式赋予的这些细胞中的基因表达变化与炎性环境中高度活化的Treg细胞中发现的那些相关(图5d)。先前,我们发现TCR信号传导是Treg细胞发挥其抑制功能的能力是所需要的34,35。因此,Treg细胞中TCR和STAT5依赖性信号传导通路作用于大量重叠的基因集是可能的,它们共同调节该基因集的表达以加强Treg细胞抑制活性。然而,我们的分析揭示受STAT5的活性形式影响的基因集与Treg细胞中以TCR依赖性方式表达的基因组不同(图5d)。因此,通过控制很大程度上不同的基因基和Treg细胞抑制活性的可能不同方面,TCR和STAT5信号传导通路在体内Treg细胞抑制活性中发挥不可缺少的作用。
为了更好地了解STAT5活化加强的Treg细胞功能的方面,我们进行了信号传导通路和分子功能富集分析,其揭示了在STAT5bCA+Treg细胞中差异表达的基因中参与细胞-细胞和细胞外基质相互作用、细胞粘附和细胞行进的基因集的过度表达(图5e,f)。该结果表明,在Treg细胞中,STAT5活化可能加强它们与靶细胞的相互作用。由于体内Treg细胞的活体成像先前已揭示Treg细胞与DC的稳定相互作用36,我们评估了Treg细胞中组成型活性STAT5表达对其在体外与DC形成缀合物的能力的潜在影响。与基因集富集分析一致,我们发现Treg细胞中的表达促进Treg与DC之间的缀合物形成(图6a)。在体外,STAT5bCA+Treg细胞与DC的提高的相互作用与在他莫昔芬治疗的Foxp3Cre-ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠中观察到的DC对共刺激分子的表达降低一致。
这些发现提出了问题是STAT5活化是否能够以TCR非依赖性方式加强Treg细胞的抑制功能。为了测试这一观点,我们分析了表达条件型Tcra等位基因的Foxp3Cre- ERT2ROSA26Stat5bCA小鼠。正如我们先前的报道,他莫昔芬诱导的Cre介导的TCR消融导致由受损的抑制功能引起免疫活化34。有趣地是,在他莫昔芬治疗的Foxp3Cre-ERT2T Tcrafl/flROSA26Stat5bCA小鼠中,T细胞活化和促炎细胞因子产生的显著增加在STAT5的活性形式表达后得以部分缓解(图6b)。在TCR消融的Treg细胞中STAT5的活性形式对Treg细胞抑制功能的部分恢复也在实验中得到证实,在该实验中将FACS纯化的TCR缺陷型STAT5bCA+Treg细胞和效应T细胞过继转移到淋巴细胞减少的受体中(图6c)。尽管挽救是不完全的,但这些结果表明增强的STAT5信号传导可以在不存在同时期的TCR依赖性信号下加强Treg细胞抑制活性。实际上,已经在TCR充足型STAT5bCA+Treg细胞中观察到的Treg细胞的一些特征仍然存在于TCR消融的STAT5bCA+Treg细胞中(图6c)。然而,应该注意的是,STAT5bCA表达未能挽救其中在Foxp3诱导后立即发生TCR缺失的Foxp3Cre Tcra fl/fl ROSA26Stat5bCA小鼠中的抑制功能。我们先前已经表明,Treg细胞需要TCR信号以获得活化的、经历过抗原的表型和抑制功能34。因此,我们的结果表明STAT5的活化加强已经历TCR依赖性成熟的成熟Treg细胞中的TCR非依赖性抑制功能。该观察结果使人联想到在胸腺中的Treg细胞分化中相继需要这两种信号TCR和IL-2R,其中STAT5信号促进已经历许可的TCR信号传导的Treg前体的分化37。讨论
高细胞表面量的IL-2Rα作为具有抑制功能的CD4+T细胞亚群的显著特征的发现为过去二十年广泛研究IL-2和IL-2R信号传导在Treg细胞生物学中的作用奠定了基础。先前对IL-2和IL-2R亚基中具有种系缺陷的小鼠的分析证明,IL-2是胸腺中的Foxp3诱导和Treg细胞分化所需要的关键细胞因子5-11。此外,抗体介导的IL-2中和和对呈与稳定的IL-2抗体的免疫复合物形式的IL-2的提供,以及Foxp3基因座内调节元件的遗传解剖,揭示了IL-2在维持成熟Treg细胞和稳定其胸腺外分化期间的Foxp3表达中的重要作用16、28、37。这些发现提出了问题,即IL-2R信号传导是否也可以直接促进Treg细胞抑制能力,并且因此可以充当连接Treg细胞分化和维持与其抑制功能的关键连接点。早期的体外研究基于间接证据提出了IL-2信号传导的作用21。此外,由Treg细胞进行的IL-2消耗被认为通过由于IL-2丧失导致的活化的CD4+T细胞的死亡在Treg细胞抑制功能中发挥至关重要的作用20-24。另一方面,其他几个报道表明IL-2R对于Treg细胞抑制效应T细胞增殖的能力是不必要的8,39。此外,在过继转移野生型Treg细胞后观察到对Il2ra-/-和Il2rb-/-小鼠中疾病的挽救表明独立于IL-2丧失的Treg细胞介导的抑制的主要机制的存在6,7。然而,后一项研究留下了一个主要问题,即由Treg细胞进行的IL-2的消耗是否对抑制IL-2R充足型Teff细胞至关重要,因为IL-2可能是不存在功能性Treg细胞下自身免疫疾病的主要驱动因素。
实验上评估在体外功能中Treg细胞中的IL-2R信号传导和由Treg细胞进行的IL-2消耗的作用的主要限制因素一直是缺乏适当的遗传工具。在这些研究中对具有种系IL-2R缺陷的小鼠使用已经被Foxp3诱导损伤、包括T细胞和B细胞的造血细胞谱系的早期分化、Foxp3表达之前的Treg前体的存活以及Treg TCR全部组成的潜在扰动所混淆。我们通过产生条件型Il2ra和Il2rb等位基因,并将它们在Treg细胞中的消融与STAT5的组成型活性形式的诱导表达相组合来解决这些问题。这些新的遗传工具使我们能够明确证明IL-2R信号传导不仅在维持成熟的Treg细胞及其适应性方面,而且还在其抑制功能方面均具有细胞内在的非冗余作用。此外,我们发现Treg细胞中的STAT5缺陷导致类似的抑制功能缺失,并且STAT5的组成型活性形式的表达可以挽救由IL-2R缺乏导致的致命疾病。这些结果表明IL-2R-STAT5信号传导在连接Treg细胞的分化和维持与其功能中的关键作用。STAT5结合Foxp3启动子和内含子Foxp3调节元件CNS2并参与Foxp3的诱导和维持38。Runx-CBFβ复合物也结合CNS2和Foxp3启动子并影响Foxp3表达水平40。虽然CNS2-和CBFβ-缺陷型Treg细胞确实表现出类似STAT5-或IL-2R-缺陷型Treg细胞的降低的Foxp3表达,但后者中抑制功能的损伤更严重。因此,单独的Foxp3表达的降低不能解释在不存在STAT5或IL-2R下Treg细胞抑制功能的严重缺失。实际上,我们在STAT5的活性形式表达后所赋予的基因表达和功能特征的分析指出Treg细胞结合DC并抑制其活化的能力提高。此外,STAT5的组成型活性形式的表达在不存在TCR信号传导下部分地挽救了几乎完全缺失的Treg抑制功能34,35。这些结果可能看起来与先前发现矛盾,该先前发现为由近端lck启动子和Eμ增强子驱动的STAT5bCA转基因未能在减弱Il2rb-/-小鼠中的致命淋巴增生疾病,但恢复了胸腺中Foxp3的表达和Treg细胞分化9。然而,由于前白血病T细胞和B细胞的大量扩增以及外周Treg细胞中STAT5bCA转基因的表达降低,后一结果的解释是有问题的。
我们的研究清楚地证明虽然IL-2R信号传导是必需的,但由Treg细胞进行的IL-2丧失对于IL-2R充足型CD4+T细胞的抑制是完全非必要的。然而,由Treg细胞进行的IL-2R依赖性IL-2消耗对于抑制CD8+T细胞应答是不可缺少的。鉴于观察到的初始和活化的CD8+T细胞对IL-2诱导的刺激的异常敏感性,后者看似意外的发现是有意义的。此外,IL-2是在TCR接合后数小时内活化初始CD4+和CD8+T细胞后产生的,与效应细胞因子(例如IL-4和IFNγ)形成对比,效应细胞因子产生需要在更长的时间范围内使T初始细胞分化为Teff细胞41。这些区别性特征为对Treg细胞通过IL-2消耗控制CD8+T细胞应答的不同机制的需要提供了可能解释。
已经表明,Treg细胞对局部IL-2产生的感知能够使Treg细胞抑制功能“获得许可”21。然而,对表达STAT5的组成型活性形式的IL-2R缺陷型Treg细胞对CD4+T细胞应答的抑制的挽救表明活化的Treg细胞可以在不鉴定IL-2细胞来源的情况下抑制自身免疫性。因此,虽然IL-2是Treg细胞抑制功能的加强剂,但它可能不会作为特异性靶向线索而发挥不可缺少的作用。
基因修饰的T细胞正在成为某些癌症形式的有效治疗手段。观察到表达STAT5的组成型活性形式的Treg细胞的抑制活性增强和在这些Treg细胞存在下器官特异性自身免疫性的严重性显著降低表明了Treg细胞的这种修饰可能有望用于针对多种自身免疫性和炎性病症的以及器官移植中的基于Treg细胞的疗法的优化设计。
我们的研究表明IL-2R信号传导和STAT5活化在不同生物学环境中加强了对CD4+和CD8+T细胞应答两者的抑制,并指出它们对CD8+T细胞应答的控制对由Treg细胞进行的IL-2R介导的IL-2消耗的需要不同。我们的发现突出了IL-2受体信号传导驱动的STAT5活化在支持和增强分化的Treg细胞的抑制功能和充当连接Treg细胞分化和维持与其抑制功能的连接点中的核心作用。在这方面,值得注意的是,尽管在鸟类中尚未鉴定出Foxp3直系同源物,但表达大量IL-2Rα链的鸡和鸭CD4+T细胞亚群具有体外抑制活性,这表明了在抑制性T细胞中IL-2Rα功能进化保守性的重要性42,43。
实例3:STAT5-CA Treg的体外生成
从受试者获取含有免疫细胞的样本(例如,血液)。将免疫细胞与样品的其他成分(例如,红细胞和/或血清)分离。然后制备免疫细胞群以便例如,通过荧光活化细胞分选法、磁性分选或本领域中已知的其他方法将该细胞群分离成单独的表型组分(例如,初始、效应记忆、中央记忆、Treg等)。
将从受试者中分离的Treg细胞群工程化(例如通过引入异源核酸)以表达组成型活性STAT5蛋白。然后将表达组成型活性STAT5蛋白的Treg细胞给予至有需要的受试者。可替代地,在给予至有需要的受试者之前,将表达组成型活性STAT5蛋白的Treg细胞在培养物中进行扩增。
在用于体外生成Treg的条件(例如,在TGF-β存在下的板结合的抗CD3和可溶性抗CD28)下将从受试者中分离的初始CD4+T细胞群进行培养。可以将生成的Treg工程化(例如通过引入异源核酸)以表达组成型活性STAT5蛋白。在一些实施例中,可以将表达组成型活性STAT5蛋白的Treg细胞给予至有需要的受试者。可替代地或另外地,在一些实施例中,在给予至有需要的受试者之前,可以将表达组成型活性STAT5蛋白的Treg细胞在培养物中进行扩增。
实例4:STAT5-CA CAR-Treg的体外生成
将Treg细胞工程化(例如通过引入异源核酸)以表达组成型活性STAT5蛋白。将Treg细胞进一步工程化以表达嵌合抗原受体。在给予至有需要的受试者之前将CAR-Treg细胞在培养物中扩增。对于被给予CAR-Treg细胞的受试者,CAR-Treg细胞可以是自体细胞或异源细胞。
参考文献
1.Sakaguchi,S.,Sakaguchi,N.,Asano,M.,Itoh,M.&Toda,M.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes variousautoimmune diseases.J Immunol 155,1151-1164(1995).
2.Hori,S.,Nomura,T.&Sakaguchi,S.Control of regulatory T celldevelopment by the transcription factor Foxp3.Science 299,1057-1061(2003).
3.Fontenot,J.D.,Gavin,M.A.&Rudensky,A.Y.Foxp3programs the developmentand function of CD4+CD25+regulatory T cells.Nature immunology 4,330-336(2003).
4.Waldmann,T.A.The multi-subunit interleukin-2receptor.Annual reviewof biochemistry 58,875-911(1989).
5.Furtado,G.C.,Curotto de Lafaille,M.A.,Kutchukhidze,N.&Lafaille,J.J.Interleukin 2signaling is required for CD4(+)regulatory T cellfunction.The Journal of experimental medicine 196,851-857(2002).
6.Almeida,A.R.,Legrand,N.,Papiernik,M.&Freitas,A.A.Homeostasis ofperipheral CD4+T cells:IL-2R alpha and IL-2shape a population of regulatorycells that controls CD4+T cell numbers.J Immunol 169,4850-4860(2002).
7.Malek,T.R.,Yu,A.,Vincek,V.,Scibelli,P.&Kong,L.CD4regulatory T cellsprevent lethal autoimmunity in IL-2Rbeta-deficient mice.Implications for thenonredundant function of IL-2.Immunity 17,167-178(2002).
8.Fontenot,J.D.,Rasmussen,J.P.,Gavin,M.A.&Rudensky,A.Y.A function forinterleukin 2in Foxp3-expressing regulatory T cells.Nature immunology 6,1142-1151(2005).
9.Burchill,M.A.,Yang,J.,Vogtenhuber,C.,Blazar,B.R.&Farrar,M.A.IL-2receptor beta-dependent STAT5 activation is required for the development ofFoxp3+regulatory T cells.J Immunol 178,280-290(2007).
10.Yao,Z.et al.Nonredundant roles for Stat5a/b in directly regulatingFoxp3.Blood 109,4368-4375(2007).
11.Malek,T.R.&Bayer,A.L.Tolerance,not immunity,crucially depends onIL-2.Nature reviews.Immunology 4,665-674(2004).
12.Vang,K.B.et al.IL-2,-7,and-15,but not thymic stromallymphopoeitin,redundantly govern CD4+Foxp3+regulatory T cell development.JImmunol 181,3285-3290(2008).
13.Chen,W.et al.Conversion of peripheral CD4+CD25-naive T cells toCD4+CD25+regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factorFoxp3.The Journal of experimental medicine 198,1875-1886(2003).
14.Malin,S.et al.Role of STAT5 in controlling cell survival andimmunoglobulin gene recombination during pro-B cell development.Natureimmunology 11,171-179(2010).
15.Barron,L.et al.Cutting edge:mechanisms of IL-2-dependentmaintenance of functional regulatory T cells.J Immunol 185,6426-6430(2010).
16.Setoguchi,R.,Hori,S.,Takahashi,T.&Sakaguchi,S.Homeostaticmaintenance of natural Foxp3(+)CD25(+)CD4(+)regulatory T cells by interleukin(IL)-2 and induction of autoimmune disease by IL-2 neutralization.The Journalof experimental medicine 201,723-735(2005).
17.Rubtsov,Y.P.et al.Stability of the regulatory T cell lineage invivo.Science 329,1667-1671(2010).
18.Komatsu,N.et al.Heterogeneity of natural Foxp3+T cells:a committedregulatory T-cell lineage and an uncommitted minor population retainingplasticity.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 106,1903-1908(2009).
19.Hori,S.Lineage stability and phenotypic plasticity of Foxp3(+)regulatory Tcells.Immunological reviews 259,159-172(2014).
20.Pandiyan,P.,Zheng,L.,Ishihara,S.,Reed,J.&Lenardo,M.J.CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis ofeffector CD4+T cells.Nature immunology 8,1353-1362(2007).
21.Thornton,A.M.,Donovan,E.E.,Piccirillo,C.A.&Shevach,E.M.Cuttingedge:IL-2 is critically required for the in vitro activation of CD4+CD25+Tcell suppressor function.J Immunol 172,6519-6523(2004).
22.Barthlott,T.et al.CD25+CD4+T cells compete with naive CD4+T cellsfor IL-2 and exploit it for the induction of IL-10 production.Internationalimmunology 17,279-288(2005).
23.Busse,D.et al.Competing feedback loops shape IL-2 signalingbetween helper and regulatory T lymphocytes in cellularmicroenvironments.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 107,3058-3063(2010).
24.Yamaguchi,T.et al.Construction of self-recognizing regulatory Tcells from conventional T cells by controlling CTLA-4 and IL-2expression.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 110,E2116-2125(2013).
25.Smigiel,K.S.et al.CCR7 provides localized access to IL-2 anddefines homeostatically distinct regulatory T cell subsets.The Journal ofexperimental medicine 211,121-136(2014).
26.Zambrowicz,B.P.et al.Disruption of overlapping transcripts in theROSA beta geo26 gene trap strain leads to widespread expression of beta-galactosidase in mouse embryos and hematopoietic cells.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 94,3789-3794(1997).
27.Onishi,M.et al.Identification and characterization of aconstitutively active STAT5 mutant that promotes cell proliferation.Molecularand cellular biology 18,3871-3879(1998).
28.Boyman,O.,Kovar,M.,Rubinstein,M.P.,Surh,C.D.&Sprent,J.Selectivestimulation of T cell subsets with antibody-cytokine immune complexes.Science311,1924-1927(2006).
29.Chen,Y.et al.Foxp3(+)regulatory T cells promote T helper 17 celldevelopment in vivo through regulation of interleukin-2.Immunity 34,409-421(2011).
30.Cong,Y.,Feng,T.,Fujihashi,K.,Schoeb,T.R.&Elson,C.O.A dominant,coordinated T regulatory cell-IgA response to the intestinalmicrobiota.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 106,19256-19261(2009).
31.Kim,J.M.,Rasmussen,J.P.&Rudensky,A.Y.Regulatory T cells preventcatastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice.Nature immunology8,191-197(2007).
32.Su,L.K.et al.Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation inthe murine homolog of the APC gene.Science 256,668-670(1992).
33.Arvey,A.et al.Inflammation-induced repression of chromatin boundby the transcription factor Foxp3 in regulatory T cells.Nature immunology 15,580-587(2014).
34.Levine,A.G.,Arvey,A.,Jin,W.&Rudensky,A.Y.Continuous requirementfor the TCR in regulatory T cell function.Nature immunology 15,1070-1078(2014).
35.Vahl,J.C.et al.Continuous T cell receptor signals maintain afunctional regulatory T cell pool.Immunity 41,722-736(2014).
36.Tadokoro,C.E.et al.Regulatory T cells inhibit stable contactsbetween CD4+T cells and dendritic cells in vivo.The Journal of experimentalmedicine 203,505-511(2006).
37.Lio,C.W.&Hsieh,C.S.A two-step process for thymic regulatory T celldevelopment.Immunity 28,100-111(2008).
38.Feng,Y.et al.Control of the inheritance of regulatory T cellidentity by a cis element in the Foxp3 locus.Cell 158,749-763(2014).
39.Tran,D.Q.et al.Analysis of adhesion molecules,target cells,androle of IL-2 in human FOXP3+regulatory T cell suppressor function.J Immunol182,2929-2938(2009).
40.Rudra,D.et al.Runx-CBFbeta complexes control expression of thetranscription factor Foxp3 in regulatory T cells.Nature immunology 10,1170-1177(2009).
41.Sojka,D.K.,Bruniquel,D.,Schwartz,R.H.&Singh,N.J.IL-2 secretion byCD4+T cells in vivo is rapid,transient,and influenced by TCR-specificcompetition.J Immunol 172,6136-6143(2004).
42.Shanmugasundaram,R.&Selvaraj,R.K.Regulatory T cell properties ofchicken CD4+CD25+cells.J Immunol 186,1997-2002(2011).
43.Andersen,K.G.,Nissen,J.K.&Betz,A.G.Comparative Genomics RevealsKey Gain-of-Function Events in Foxp3 during Regulatory T CellEvolution.Frontiers in Immunology 3,113(2012).
44.Rubtsov,Y.P.et al.Regulatory T cell-derived interleukin-10limitsinflammation at environmental interfaces.Immunity 28,546-558(2008).
45.Anders,S.et al.Count-based differential expression analysis of RNAsequencing data using R and Bioconductor.Nature protocols 8,1765-1786(2013).
46.Bolger,A.M.,Lohse,M.&Usadel,B.Trimmomatic:a flexible trimmer forIllumina sequence data.Bioinformatics 30,2114-2120(2014).
47.Love,M.I.,Huber,W.&Anders,S.Moderated estimation of fold changeand dispersion for RNA-seq data with DESeq2.Genome biology 15,550(2014).
48.Tarca,A.L.et al.A novel signaling pathway impactanalysis.Bioinformatics25,75-82(2009).
49.Maere,S.,Heymans,K.&Kuiper,M.BiNGO:a Cytoscape plugin to assessoverrepresentation of gene ontology categories in biologicalnetworks.Bioinformatics 21,3448-3449(2005).
50.Merico,D.,Isserlin,R.,Stueker,O.,Emili,A.&Bader,G.D.Enrichmentmap:a network-based method for gene-set enrichment visualization andinterpretation.PloS one 5,e13984(2010).
等同物
本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文描述的本发明的具体实施例的许多等同物。本发明的范围不旨在限于以上说明书,而是如在以下权利要求书中所陈述的:
Claims (33)
1.一种工程化调节性T(“Treg”)细胞,其特征在于组成型STAT活性。
2.如权利要求1所述的工程化调节性T细胞,其中该调节性T细胞被工程化以组成型地活化STAT蛋白。
3.如权利要求1所述的工程化调节性T细胞,其中该调节性T细胞被工程化以表达与适当的参考物相比更高水平或活性的STAT蛋白。
4.如权利要求1所述的工程化调节性T细胞,其中该调节性T细胞被工程化以表达组成型活性STAT蛋白。
5.如权利要求4所述的工程化调节性T细胞,其中该组成型活性STAT蛋白是或包括STAT5b。
6.如权利要求4所述的工程化调节性T细胞,其中该组成型活性STAT蛋白是组成型磷酸化的。
7.如权利要求4所述的工程化调节性T细胞,其中该组成型活性STAT蛋白是组成型二聚化的。
8.如权利要求1所述的工程化调节性T细胞,其中该调节性T细胞进一步表达嵌合抗原受体。
9.如权利要求1所述的工程化调节性T细胞,其中该调节性T细胞进一步表达内源性T细胞受体。
10.一种治疗罹患炎性或自身免疫性疾病、病症或病状的受试者的方法,该方法包括以下步骤:
向受试者给予特征在于组成型STAT活性的工程化调节性T细胞。
11.如权利要求10所述的方法,其中该方法进一步包括以下步骤:
从含有调节性T细胞的受试者采集样品,
从该样品中分离调节性T细胞,
将该调节性T细胞工程化以包含组成型STAT活性,
向受试者给予该包含组成型STAT活性的工程化调节性T细胞。
12.如权利要求11所述的方法,其中该工程化调节性T细胞表达内源性T细胞受体。
13.如权利要求11所述的方法,其中该工程化调节性T细胞表达嵌合抗原受体。
14.如权利要求11所述的方法,其中该工程化调节性T细胞被工程化以组成型地活化STAT蛋白。
15.如权利要求11所述的方法,其中该工程化调节性T细胞被工程化以表达与适当的参考物相比更高水平或活性的STAT蛋白。
16.如权利要求11所述的方法,其中该工程化调节性T细胞被工程化以表达组成型活性STAT蛋白。
17.如权利要求16所述的方法,其中该组成型活性STAT蛋白是或包括STAT5b。
18.如权利要求16所述的方法,其中该组成型活性STAT蛋白是组成型磷酸化的。
19.如权利要求14所述的方法,其中该组成型活性STAT蛋白是组成型二聚化的。
20.如权利要求11所述的方法,其中该样品采集自其的受试者和向其给予该工程化调节性T细胞的受试者是同一个受试者。
21.如权利要求11所述的方法,其中该样品采集自其的受试者和向其给予该工程化调节性T细胞的受试者是不同的受试者。
22.如权利要求10所述的方法,其中该方法进一步包括以下步骤:
从含有免疫细胞的受试者采集样品,
从该样品中分离免疫细胞亚群,
由该分离的免疫细胞亚群体外生成调节性T细胞,
将该调节性T细胞工程化以包含组成型STAT活性,
向受试者给予该包含组成型STAT活性的工程化调节性T细胞。
23.如权利要求22所述的方法,其中该免疫细胞亚群由初始CD4+细胞组成。
24.如权利要求22所述的方法,其中该工程化调节性T细胞表达内源性T细胞受体。
25.如权利要求22所述的方法,其中该工程化调节性T细胞表达嵌合抗原受体。
26.如权利要求22所述的方法,其中该工程化调节性T细胞被工程化以组成型地活化STAT蛋白。
27.如权利要求22所述的方法,其中该工程化调节性T细胞被工程化以表达与适当的参考物相比更高水平或活性的STAT蛋白。
28.如权利要求22所述的方法,其中该工程化调节性T细胞被工程化以表达组成型活性STAT蛋白。
29.如权利要求28所述的方法,其中该组成型活性STAT蛋白是或包括STAT5b。
30.如权利要求28所述的方法,其中该组成型活性STAT蛋白是组成型磷酸化的。
31.如权利要求28所述的方法,其中该组成型活性STAT蛋白是组成型二聚化的。
32.如权利要求22所述的方法,其中该样品采集自其的受试者和向其给予该工程化调节性T细胞的受试者是同一个受试者。
33.如权利要求22所述的方法,其中该样品采集自其的受试者和向其给予该工程化调节性T细胞的受试者是不同的受试者。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662351104P | 2016-06-16 | 2016-06-16 | |
US62/351,104 | 2016-06-16 | ||
PCT/US2017/037794 WO2017218850A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-06-15 | Engineered treg cells |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109415698A true CN109415698A (zh) | 2019-03-01 |
Family
ID=60663377
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201780037655.8A Pending CN109415698A (zh) | 2016-06-16 | 2017-06-15 | 工程化Treg细胞 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190322983A1 (zh) |
EP (1) | EP3472305A4 (zh) |
JP (2) | JP2019518460A (zh) |
CN (1) | CN109415698A (zh) |
AU (1) | AU2017285319A1 (zh) |
CA (1) | CA3027546A1 (zh) |
MA (1) | MA45498A (zh) |
WO (1) | WO2017218850A1 (zh) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201714718D0 (en) | 2017-09-13 | 2017-10-25 | Autolus Ltd | Cell |
GB201814203D0 (en) | 2018-08-31 | 2018-10-17 | King S College London | Engineered regulatory t cell |
JP2022507453A (ja) | 2018-11-14 | 2022-01-18 | フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ, インコーポレイテッド | T細胞送達のためのフソソーム組成物 |
WO2021007396A2 (en) * | 2019-07-09 | 2021-01-14 | The Children's Mercy Hospital | Engineered regulatory t cells |
WO2021154882A1 (en) * | 2020-01-27 | 2021-08-05 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. | Hdac6-inhibited human regulatory t cells |
US20230138428A1 (en) | 2020-02-25 | 2023-05-04 | Quell Therapeutics Limited | Chimeric receptors for use in engineered cells |
GB202102637D0 (en) | 2021-02-24 | 2021-04-07 | Quell Therapeutics Ltd | Engineered regulatory t cell |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8658159B2 (en) * | 2008-06-30 | 2014-02-25 | Versitech Limited | Method to induce and expand therapeutic alloantigen-specific human regulatory T cells in large-scale |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6235873B1 (en) * | 1999-07-31 | 2001-05-22 | The Rockefeller University | Constitutively active transcription factors and their uses for identifying modulators of activity including dysproliferative cellular changes |
JP2010531138A (ja) * | 2007-06-13 | 2010-09-24 | ラ ホヤ インスティテュート フォア アラージー アンド イムノロジー | 制御性t細胞ならびに同製造および使用方法 |
ES2928000T3 (es) * | 2014-06-06 | 2022-11-14 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Receptores de antígeno quimérico dirigidos a mesotelina y usos de los mismos |
JP2017519502A (ja) * | 2014-06-17 | 2017-07-20 | セレクティスCellectis | Cd123特異的多重鎖キメラ抗原受容体 |
US11111505B2 (en) * | 2016-03-19 | 2021-09-07 | Exuma Biotech, Corp. | Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof |
-
0
- MA MA045498A patent/MA45498A/fr unknown
-
2017
- 2017-06-15 EP EP17814140.4A patent/EP3472305A4/en not_active Withdrawn
- 2017-06-15 WO PCT/US2017/037794 patent/WO2017218850A1/en unknown
- 2017-06-15 US US16/310,668 patent/US20190322983A1/en not_active Abandoned
- 2017-06-15 CA CA3027546A patent/CA3027546A1/en active Pending
- 2017-06-15 JP JP2018565336A patent/JP2019518460A/ja not_active Withdrawn
- 2017-06-15 CN CN201780037655.8A patent/CN109415698A/zh active Pending
- 2017-06-15 AU AU2017285319A patent/AU2017285319A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-02-15 JP JP2022021158A patent/JP2022058995A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8658159B2 (en) * | 2008-06-30 | 2014-02-25 | Versitech Limited | Method to induce and expand therapeutic alloantigen-specific human regulatory T cells in large-scale |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
C. VOGTENHUBER ET AL,: "Constitutively active Stat5b in CD4+ T cells inhibits graft-versus-host disease lethality associated with increased regulatory T-cell potency and decreased T effector cell responses", 《BLOOD》 * |
JETHWA HANNAH ET AL: "Use of gene-modified regulatory T-cells to control autoimmune and alloimmune pathology: Is now the right time?", 《CLINICAL IMMUNOLOGY》 * |
MATTHEW A. BURCHILL ET AL,: "Distinct Effects of STAT5 Activation on CD4 + and CD8 + T Cell Homeostasis: Development of CD4 + CD25 + Regulatory T Cells versus CD8 + Memory T Cells", 《 THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
MA45498A (fr) | 2019-04-24 |
US20190322983A1 (en) | 2019-10-24 |
JP2019518460A (ja) | 2019-07-04 |
WO2017218850A1 (en) | 2017-12-21 |
AU2017285319A1 (en) | 2018-12-20 |
EP3472305A1 (en) | 2019-04-24 |
CA3027546A1 (en) | 2017-12-21 |
EP3472305A4 (en) | 2020-01-15 |
JP2022058995A (ja) | 2022-04-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109415698A (zh) | 工程化Treg细胞 | |
LaMarche et al. | Distinct iNKT cell populations use IFNγ or ER stress-induced IL-10 to control adipose tissue homeostasis | |
Ostanin et al. | T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade | |
Thiault et al. | Peripheral regulatory T lymphocytes recirculating to the thymus suppress the development of their precursors | |
Bod et al. | B-cell-specific checkpoint molecules that regulate anti-tumour immunity | |
Preglej et al. | Histone deacetylases 1 and 2 restrain CD4+ cytotoxic T lymphocyte differentiation | |
Mathä et al. | Migration of lung resident group 2 innate lymphoid cells link allergic lung inflammation and liver immunity | |
Umeshappa et al. | Re-programming mouse liver-resident invariant natural killer T cells for suppressing hepatic and diabetogenic autoimmunity | |
Muñoz-Ruiz et al. | IFN-γ–dependent interactions between tissue-intrinsic γδ T cells and tissue-infiltrating CD8 T cells limit allergic contact dermatitis | |
US20190376030A1 (en) | Regulatory t cell populations | |
Budeus et al. | Human neonatal B cell immunity differs from the adult version by conserved Ig repertoires and rapid, but transient response dynamics | |
Raghavan et al. | Conditional Deletion of Pdcd1 Identifies the Cell-Intrinsic Action of PD-1 on Functional CD8 T Cell Subsets for Antitumor Efficacy | |
Xia | The Maintenance of CD4 and CD8 T Cell Response to Persistent Antigens | |
Castiello et al. | HyperIgE in hypomorphic recombination-activating gene defects | |
US20220386573A1 (en) | Humanized mouse model with human immune system | |
Shi et al. | MHC Class Ia Empowers MHC Class Ib-restricted CD8+ T Cells with Strong Tumoricidal Capacity | |
Deep | Regulation of Polytypic T Cell Responses in Infection | |
Anstee | Macrophage development in the perivascular niche and their role in cancer progression | |
Alvarez | Functional Characterization of the Role of the IL-1 Family of Alarmins in the Mucosal Adaptation of Regulatory T Cells | |
Kohlgruber | The Role of Gamma Delta T Cells in Adipose Tissue Biology | |
Flavell et al. | RNA m6A demethylase ALKBH5 regulates the development of γδ T cells | |
Junius | Functional dissection of regulatory T cell plasticity and stability | |
Sangani | TET2 Regulates Homeostatic Th2 Immunity in the Small Intestine | |
Agrawal | Epithelial ErbB2 regulation of thymus homeostasis and age-associated T cell mediated immunity | |
Vittoria | I macrofagi IL-1b+ alimentano l'infiammazione patogena nel tumore al pancreas |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190301 |