CN1094038C - 一种用免疫代谢调控技术培育珍珠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用代谢调控技术培育珍珠的方法,首先用呋喃唑酮浸泡待插核珍珠贝待用,再用调控剂II浸润外套膜小片和珠核,然后,在处理过的珍珠贝足基部的表皮上开一切口,送进珠核并将调控剂II浸润过的外套膜小片的外上皮紧贴在珠核上,最后将甲氧苄啶、黄胺甲恶唑和黄胺嘧啶制成的调控剂III放入创口处,将手术贝在海水中吊养,即完成珍珠贝的养殖,本发明育珠的产量和质量高,使用方便,操作简单。
Description
本发明涉及一种用免疫代谢调控技术培育珍珠的方法,属人类生活必需品技术领域。
1907年日本西川藤吉等人研究细胞式全圆珍珠养殖法获得成功,经过许多科技人员的研究和改进,建立了现代养殖珍珠技术,其核心是同种异体组织的体内培养。该技术的广泛应用已使现代养殖珍珠生产成为一种高新科技产业。日本在全球的珍珠养殖业中一直居领先地位,在珍珠贝种苗生产、珍珠加工和国际贸易等方面均占垄断地位。除日本外,世界其它地区,如澳大利亚、菲律宾、缅甸等地也在发展珍珠养殖业,他们借助日本的珍珠养殖技术开辟大型珍珠贝珍珠养殖生产。
我国于60年初用外套膜小片体内组织培养的方法培育出了正圆形海水有核珍珠,1966年又成功地突破了合浦珠母贝人工育苗技术,其技术的大规模推广应用为海水珍珠养殖打下了良好的基础,并促进了我国珍珠养殖业的大发展。30多年来,尤其是改革开放以来,我国的珍珠养殖业发展异常迅速。无论是养殖数量还是科研水平都有了很大的提高,发表了有关珍珠养殖的许多论著,在实践中总结、形成了珍珠养殖的整套技术。据不完全统计,我国已有海水珍珠养殖场2000多个,年产珍珠20余吨,是珍珠养殖第二大国。
尽管我国常规育珠技术已经比较成熟,珍珠的质量和产量已有很大的提高,但仍存在不少问题。如休养期手术贝的死亡率、脱核率较高,育珠贝的成珠率较低;薄层珍珠多,珍珠质量较差;珍珠贝的病害较严重等。因此,如何提高珍珠的产量和质量一直是科研工作者潜心研究的课题。
珍珠贝类及其珍珠的养殖技术是非常复杂和精细的过程,从人工育苗开始,经母贝养成,插核手术、育珠,一直到珍珠收成的整个珍珠生产过程,是一个系统的生物工程。其中最重要的环节是插核手术,即在珍珠贝足基部的表皮上开一切口,由此送进1-2个珠核并随即将外套膜小片紧贴在珠核上。该移植小片细胞围绕珠核分裂生长形成珍珠囊,由珍珠囊分泌珍珠质包饶珠核便形成珍珠。
珍珠养殖技术的改进主要就是围绕着插核手术进行的,其中最关键的是外套膜小片的选择和处理技术。由于外套膜小片是形成珍珠囊和生成珍珠的基础,因此,外套膜小片的选择和处理与珍珠产量和质量关系十分密切。国内外曾用于处理外套膜小片的药品有:聚乙烯吡咯烷酮(以下简称PVP)、腺苷三磷酸(以下简称ATP)、多种氨基酸、荧光增白剂等。广西沿海使用最普遍的是ATP,广东沿海多使用PVP。迄今为止,国内尚无专门用于珍珠养殖的产品问世。日本专利CN 1037065A用活化珠贝血细胞的调控剂(所含促细胞分裂剂为有效成分)处理外套膜小片,其原理是通过活化植入部位的血细胞,从而促进移植片组织生长,结果使脱核数少,珍珠产量和质量都增加。上述方法都是单纯处理外套膜小片,通过提高细胞小片的分裂增殖能力,加速珍珠囊的形成,而没有涉及解决手术贝死亡率的问题。
本发明的目的是提出一种用免疫代谢调控技术培育珍珠的方法,改进原有的珍珠养殖技术,寻找一种能够提高手术贝存活率和成珠率,提高珍珠产量和质量的珍珠养殖的新方法,从而解决长期困扰我国海水珍珠养殖业的主要问题。筛选出的几种免疫与代谢调控剂,用于海水珍珠养殖的插核手术阶段,通过调节珍珠贝的免疫与代谢机能,提高贝体自身的免疫力,从而达到降低插核育珠贝休养期死亡率和脱核率,提高含珠率,最终达到提高珍珠质量和产量的目的。
本发明特别提供了三种不同的免疫与代谢调控剂,并将其应用于海水珍珠养殖的插核手术阶段,旨在提高手术贝的存活率和成珠率,提高珍珠的产量和质量。
本发明提出的用免疫代谢调控技术培育珍珠的方法,包括以下各步骤:
(1)对珍珠贝进行插核手术前,用浓度为5-20ppm的调控剂I即呋喃唑酮浸泡待插核珍珠贝15-30分钟待用;
(2)用浓度为1-8%的调控剂II浸润外套膜小片和珠核15-30分钟,调控剂II的组成成分为生物矿质液与PVP,ATP或镁盐中的任何一种,其比例为:每毫升生物矿质液加PVP1克、ATP0.02克或镁盐0.2克;
(3)在经步骤(1)处理过的珍珠贝的足基部的表皮上开一切口,由此送进1-2个珠核并随即将调控剂II浸润过的外套膜小片的外上皮紧贴在珠核上;
(4)将调控剂III放入创口处,调控剂III为甲氧苄啶、黄胺甲恶唑和黄胺嘧啶按1∶2.5∶2.5的比例,再加以一定的敷料制成直径为1-1.5mm的小丸;
(5)将经手术后的贝在温度范围为15℃-35℃的海水吊养9-12个月,即完成珍珠贝的养殖。
本发明的调控剂I的筛选是以能够提高珍珠贝血细胞的吞噬活性及其血清的溶菌和抗菌活力为主要依据。珍珠贝类虽然是低等的无脊椎动物,其免疫方式为非特异性的,但仍有细胞免疫与体液免疫两种方式。细胞免疫主要是血细胞通过凝集,细胞吞噬及增生来防御外来异物,而体液免疫则对吞噬的异物进行消化分解,这两种作用相互联系,共同完成贝体的防御功能。目前认为,在防御有害微生物入侵方面,贝类的吞噬细胞发挥着重要的作用。吞噬细胞杀死侵入机体的有害微生物的最重要机理是能产生具有强烈的杀菌作用的有毒的各种活性氧,活性氧产生的同时伴有微弱发光现象。用化学发光法可测知血细胞吞噬活性的强弱,即血细胞杀菌机能的强弱。本项专利调控剂I从细胞和体液免疫两个方面改变手术贝自身的免疫水平,能够提高手术贝的成活率。
本发明的调控剂II的配方是以能够激活与珍珠质分泌相关的碱性磷酸酶(ALP)的活性为指标,并结合育珠结果筛选出来的。珍珠是珍珠贝外套膜表皮细胞分泌形成的,其主要成分是碳酸钙、多糖几丁质和蛋白质。珍珠质的分泌受多种酶和因子的调控,其中碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase ALP)珍珠蛋白的分泌与合成密切相关(小林新二朗等,1960),在珍珠质的形成过程中起了重要的作用。因此ALP活性的高低直接影响了珍珠的质量。
本发明的调控剂III的作用是杀菌、消炎,促进损伤组织修复、减少手术后创伤感染。
与已有的传统的养殖技术相比,本技术有如下特点:
1)综合、系统、全面
过去的珍珠养殖技术仅单独考虑提高外套膜小片的细胞分裂能力,如仅用ATP浸润细胞小片等。本技术同时使用三种免疫与代谢调控剂,分别浸泡手术贝、浸润外套膜小片和处理创口,通过提高贝血细胞的吞噬功能及免疫相关酶的活性提高手术贝的自身免疫力,激活与珍珠质分泌相关酶——碱性磷酸酶的活性而促进细胞分裂和珍珠质的分泌,调节珠母贝的免疫与代谢机能达到降低插核育珠贝休养期死亡率和脱核率,提高含珠率;提高优质珍珠比例,最终达到提高珍珠的质量和产量的目的,因而效果更好。
2)育珠的产量和质量高
小试和中试试验表明,与国内普遍采用的ATP浸润外套膜小片相比,在插核手术阶段使用本发明三种调控剂后,插核手术贝休养期的成活率、含珠率均可提高10-15%,商品珠率、光珠率都比正常生产对照组(ATP浸润)高。说明上述三种调控剂能够提高珍珠的产量和质量。
3)使用方便,操作简单
针对国内珍珠养殖的现状,即养殖场条件较差,没有消毒灭菌的设施,插核手术无法作到无菌操作,人员素质较低等,本项目技术在原养殖方法的基础上进行改进,仅在插核手术期间增加了两个程序,方法简单,容易被广大珠农接受。
在人工养殖珍珠的插核手术时期,用本发明调控剂分别浸泡待插核的手术贝、浸润外套膜小片、处理创口,调节了珍珠贝的免疫与代谢机能,提高了贝体自身的免疫力,从而降低插核育珠贝休养期死亡率和脱核率,提高了含珠率,最终能够提高珍珠的质量和产量。
下面介绍本发明的实施例:
实施例一:应用三种免疫与代谢调控剂进行养殖珍珠的试验
1、取1000只健康的2-3龄珍珠贝用5ppm调控剂I浸泡15-30分钟,待插核手术用。
2、选择贝壳鳞片生长较快和体型正常的健康1-2龄幼贝制作外套膜小片,用过滤海水配制1%浓度的调控剂II(生物矿质液与ATP的混合物),分别浸润外套膜小片和珠核15分钟;
3、在经调控剂I处理的珍珠贝的足的基部,用开口刀在表皮上开一切口,由此送进1-2个珠核并随即将浸润过的外套膜小片的外上皮紧贴在珠核上。
4、将调控剂III放入创口处。
5、将经手术后的贝吊养在海水中,海水水温:30.3℃,海水比重1.024。
插核手术后28天统计休养期手术贝的死亡率,8个月后开贝取珠,结果为手术贝休养期的死亡率分别比对照组降低了12.3和8.8个百分点,育珠期成珠率平均约提高9.6个百分点。
实施例二:应用三种免疫与代谢调控剂在不同水域进行珍珠养殖试验结果
1、取1000只健康的2-3龄合浦珠母贝用5ppm的调控剂I浸泡15-30分钟,待插核手术用。
2、选择贝壳鳞片生长较快和体型正常的健康1-2龄幼贝制作外套膜小片(2mm×2mm),用过滤海水配制的1%浓度的调控剂II(生物矿质液与镁盐的混合物)分别浸润外套膜小片和珠核15分钟,小片用中性红或食品红进行染色,
3、在经调控剂I处理的珍珠贝足的基部,用开口刀在表皮上开一切口,由此送进1-2个珠核并随即将浸润过的外套膜小片的外上皮紧贴在珠核上。
4、再将调控剂III放入创口处。
5、将经手术后的贝吊养在海水中,海水水温:30.3℃,海水比重1.024。
插核手术后28天统计休养期手术贝的成活率,8个月后开贝取珠,结果为手术贝休养期的存活率提高了15个百分点,育珠期成珠率平均约提高12.6个百分点,商品珠率提高商品珠率提高13.7个百分点。
实施例三:应用三种免疫与代谢调控剂在不同水域进行珍珠养殖试验结果
1、取3000只健康的2-3龄合浦珠母贝用15ppm的调控剂I浸泡15-30分钟,待插核手术用。
2、选择贝壳鳞片生长较快和体型正常的健康1-2龄幼贝制作外套膜小片(2mm×2mm),用过滤海水配制的4%浓度的调控剂II(生物矿质液)分别浸润外套膜小片和珠核15分钟,小片用中性红或食品红进行染色。
3、在经调控剂I处理的合浦珠母贝的足的基部,用开口刀在表皮上开一切口,由此送进1-2个珠核并随即将浸润过的外套膜小片的外上皮紧贴在珠核上。
4、将调控剂III放入创口处。
5、将经手术后的贝吊养在海水中,海水水温:18℃,海水比重1.024。
插核手术后44天统计休养期手术贝的成活率,9个月后开贝取珠。休养期手术贝的死亡率和脱核率分别比对照组低11和14个百分点。育珠期成珠率平均约提高10.8个百分点。商品珠率提高约9.5个百分点
实施例四:应用三种免疫与代谢调控剂在不同水域进行珍珠养殖试验结果
1、取4000只健康的2-3龄珍珠贝用20ppm的调控剂I浸泡15-30分钟,待插核手术用。
2、选择贝壳鳞片生长较快和体型正常的健康1-2龄幼贝制作外套膜小片(2mm×2mm),用过滤海水配制的8%浓度的调控剂II(生物矿质液与PVP混合液)分别浸润外套膜小片和珠核15分钟,小片用中性红或食品红进行染色。
3、在经调控剂I处理的珍珠贝的足的基部,用开口刀在表皮上开一切口,由此送进1-2个珠核并随即将浸润过的外套膜小片的外上皮紧贴在珠核上。
4、将调控剂III放入创口处;
5、将经手术后的贝吊养在海水中,海水水温:24℃,海水比重1.024。
插核手术后20天统计休养期手术贝的成活率,9个月后开贝取珠。休养期手术贝的死亡率和脱核率分别分别比对照组低10.3和14.6个百分点。育珠期成珠率平均约提高8.8个百分点。商品珠率提高约9个百分点
总之,已有的试验结果表明,在珍珠养殖插核手术阶段配合本发明的三种免疫与代谢调控剂可明显提高手术贝的成活率、含珠率10-15个百分点,商品珠率提高约10个百分点,提高了珍珠的产量和质量。对比实施例一 不同配方的调控剂II对外套膜小片碱性磷酸酶(ALP)活性的影响
取一只合浦珠母贝,剥取外套膜,均分成9份,将其分别浸泡在下述9种不同配方的溶液中15min后,捞出,凉干,再分别加入0.01mol/L的pH7.5Tris-HCl缓冲液0.6ml,匀浆,破碎细胞,4℃下静置4小时,离心,取上清,测相对酶活力。比较不同调控剂及不同配方的调控剂II对外套膜碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。A、对照(海水),B、1%PVP,C、0.01%ATP,D、1%矿质液,E、1%矿质液+1%PVP,F、1%矿质液+0.01%ATP,G、1%矿质液+0.2%Mg2+,H、1%矿质液+0.01%ATP+0.2%Mg2+,I、1%矿质液+0.01%ATP+0.2%Mg2++1%PVP。结果表明,所有调控剂均能提高外套膜小片的ALP的相对活力,其中经配方为D、F、H、I的调控剂浸润后,外套膜小片的ALP的相对活力提高最明显,分别为350.3%、481.8%、432.6%、361.1%,明显高出空白对照组及PVP和ATP试验组,表明调控剂II能够明显提高外套膜的碱性磷酸酶的活性。
对比实施例二 调控剂I对珍珠贝血细胞吞噬发光活性的影响
用LS-5801型液体闪烁计数器(Backman公司)测定调控剂I对合浦珠母贝血细胞吞噬发光活性的影响。使用单光子测定程序,室温下测定。液闪测定管(聚乙烯塑料管,Backman公司)内加入混合血淋巴200ul(ca.5μ×106/ml,n>3),测定未刺激的血淋巴的基础发光5-10min为记录的起始值(t=0).再加入发光剂Luminol 100μl(10-7M)和刺激物(海洋酵母细胞)100μl,然后记录发光值cpm(counts per min)。
结果为对照组血细胞的最大吞噬发光值为6.1×106,试验组加1ppm和5ppm的调控剂I后,血细胞的最大吞噬发光值分别为6.4×106和7.3×106,可见调控剂I能够提高贝血细胞的吞噬发光活性,即能够提高珍珠贝的免疫能力。
Claims (1)
1、一种用免疫代谢调控技术培育珍珠的方法,其特征在于,该方法包括以下各步骤:
(1)对珍珠贝进行插核手术前,用浓度为5-20ppm的调控剂I即呋喃唑酮浸泡待插核珍珠贝15-30分钟待用;
(2)用浓度为1-8%的调控剂II浸润外套膜小片和珠核15-30分钟,调控剂II的组成成分为生物矿质液与PVP,ATP或镁盐中的任何一种,其比例为:每毫升生物矿质液加PVP1克、ATP0.02克或镁盐0.2克;
(3)在经步骤(1)处理过的珍珠贝的足基部的表皮开一切口,由此送进1-2个珠核并随即将调控剂II浸润过的外套膜小片的外上皮紧贴在珠核上;
(4)将调控剂III放入创口处,调控剂III为甲氧苄啶、黄胺甲恶唑和黄胺嘧啶按1∶2.5∶2.5的比例,再加以一定的敷料制成直径为1-1.5mm的小丸;
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