CN109387576A - 一种黄曲霉毒素和磺胺类药物的微型光衍生化器 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种黄曲霉毒素和磺胺类药物的微型光衍生化器。它包括1只紫外LED光源，其激发波长在280～370nm之间，采用透紫外光的细内径管作为衍生反应池，衍生反应管以单层螺旋缠绕在反光碗内壁上，衍生反应管的内径为0.10～0.35毫米，长度为17～30cm，衍生池体积为7～15μL。本发明的光衍生化器使黄曲霉毒素B1的荧光强度提高5倍；该衍生化器用于液相色谱柱后衍生和流动注射分析衍生的需要，包括高效液相色谱(HPLC)和超高压液相色谱(UPLC)联用分析样品中的痕量黄曲霉毒素和磺胺类药物。

Description

一种黄曲霉毒素和磺胺类药物的微型光衍生化器

技术领域

本发明专利涉及高效液相色谱(HPLC)、流动注射分析(FIA)的光学检测领域，更具体地说，涉及一种用于黄曲霉毒素和磺胺类药物的光衍生化器。

背景技术

光衍生化器广泛用于高效液相色谱(HPLC)-荧光检测法定量检测黄曲霉毒素，如国家标准GB/T 18979-2003和GB/T 23212-2008，以及2015年中国药典将光衍生化器列入至黄曲霉毒素测定法一章中，用来辅助测定药材、饮片和制剂中的痕量黄曲霉毒素。黄曲霉毒素(AFTS)是一种分子真菌毒素，它被称为最强的天然致癌物质，1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构定为Ⅰ类致癌物。黄曲霉毒素广泛存在于霉变的粮食产品中，检测农产品和食品中的黄曲霉毒素是国际性重要问题。目前分离出来的黄曲霉毒素有十多种，主要有B1(AFTB1)、B2(AFB2)、G1(AFTG1)、G2(AFTG2)、M1(AFTM1)。其中，B1的毒性最强，约是氰化钾的10倍，是三氧化二砷(砒霜)的68倍。黄曲霉毒素检测方法主要有高效液相色谱-荧光检测法、荧光光度法、液相色谱-质谱法等。在众多的AFTS国标检测方法中，提出最早的也是目前应用最为广泛的方法是高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)法，随着时代的发展、科技的进步，国标和欧标对各类物质中黄曲霉毒素的限量逐渐降低，分析检测的难度不断提高，检测下限已经低于常规荧光检测器的水平，必须依靠衍生化或分子标记技术来提高检测灵敏度。

黄曲霉毒素B1和G1本来具有较强的荧光，但其与水接触后，会有荧光淬灭现象发生，荧光变得很弱，所以一般用衍生方法来提高它们的荧光强度。目前主流衍生方法为柱后碘/溴衍生法和光化学衍生法。碘衍生法还额外需要一台衍生泵，还要配制碘液，浪费人力资源；而且碘化学物质对人体有一定毒性，还附加了一台泵的成本，另外配置碘液也需要费时；光化学衍生法操作很简单，只需连接管路打开衍生器开关即可，即插即用；无需使用化学物质(省钱的同时，也避免操作人员接触有毒化学物质)；增加HPLC仪器的寿命(没有腐蚀性酸流经流通池)；无需冲洗步骤。光化学衍生器广泛用于黄曲霉毒素和磺胺类药物的HPLC法检测，它能够显著增强黄曲霉毒素B1、G1和磺胺类药物如磺胺嘧啶等的荧光强度。但目前，无论是科研用的光化学衍生器(范海东，王玲锋，赵冬吉，自制光化学衍生反应器－高效液相色谱法测定大豆油中黄曲霉毒素B1，理化检验-化学分册，2013，49，999-1001)还是商品化的光化学衍生器(http://www.josvok.com/product_show.php？id＝57)，(http://www.18show.cn/zt410303/Product_10226818.html)，其激发光源都是254nm低压汞灯，寿命仅2000-3000小时，发射光强随着光源点亮时间的增加而逐渐衰减，光衍生效率随之降低，导致光衍生效率在灯的寿命周期内不断降低；光衍生化器所用的反应管是高透明的FEP管，内径0.4～0.5mm，长度10～12米，衍生池体积～1mL；采用密集编织的环套结构形成一个长方形的网，这种结构使流过的液体获得良好的混合，同时又尽可能降低谱带展宽。但是编制这样的一个环套结构的网是用手工编制，费时费力；一台商品化光化学衍生器的价格在3～4万元人民币。总之，现有技术的光化学衍生器存在光源寿命短、制作复杂、体积大、价格昂贵等诸多问题。

发明内容

针对上述问题，为了改进现有技术的不足，基于对光化学衍生反应机理的进一步深入研究，本发明提出采用1只波长为280～370nm的紫外LED光源代替传统的低压汞灯作为激发光源；简单的阿基米德螺旋形缠绕在反光碗内壁表面代替传统的“蜂窝编制”结构的衍生反应管；通过对衍生反应管的改进和优化，本发明光化学衍生器的衍生体积仅为7～15μL，衍生反应管长仅17～30cm；经实验证明，本发明的光衍生化器即使采用10μL池体积，可以使黄曲霉毒素G1的荧光强度提高7倍，使黄曲霉毒素B1的荧光强度提高5倍，衍生效果接近目前商品化光衍生化器，而且池体积只有商品光衍生化器的1/100，显著地降低色谱峰展宽。

本发明的技术方案是：

一种黄曲霉毒素和磺胺类药物的微型光衍生化器，由紫外LED光源、衍生反应管、反光碗、LED基板和散热片组成，散热片上方设有风扇，

反光碗为上端圆形开口的碗形容器，内表面为倒圆台形或小于等于半球的球缺面；

衍生反应管从上至下螺旋形绕制在反光碗内壁上，衍生反应管在反光碗内壁上形成单层阿基米德螺旋形结构；

一只紫外LED光源位于衍生反应管的上方作为光衍生反应的激发光源；LED基板的下表面与反光碗上口表面所在平面平行；紫外LED光源的中轴线与反光碗上开口中心轴线以及衍生反应管绕制螺旋的中轴线保持重合；紫外LED光源与衍生反应管之间设有一定距离；

散热片紧贴于LED基板上表面，用于紫外LED光源的散热，散热片上方设有风扇。

所述紫外LED光源的中心波长在280～370nm之间，发散角60～140°；所述紫外LED光源与衍生反应管之间设有一定距离是指它们之间留有间隙，使紫外LED光源均匀地照射在衍生反应管上；紫外LED光源与最上端衍生反应管的上表面的距离为2～7毫米。

所述衍生反应管的材质为透明的FEP管或PFA管或石英管；其内径0.10～0.35毫米，外径0.3～1.6毫米，长17～30厘米，内容积7～15微升，相邻匝的衍生反应管之间互相贴紧。

所述反光碗的材质为表面抛光的金属，如不锈钢、铝、铜或表面镀膜的塑料。

所述反光碗的是上口直径15～25mm，高度8～15mm，可以使光衍生管在其内壁缠绕3～6圈，以保证衍生体积是7～15μL。

所述LED基板和散热片的材质为导热良好的金属材料，如铝或铜，散热片上方设有风扇，利于散热。

与现有技术相比，本发明的光化学衍生器具有如下优点：

1、传统的光衍生化器采用254nm汞灯紫外光源，而本发明采用280～370nm波长的紫外LED作为光源，依然得到很高的衍生化效率。对于中心波长355到370nm波长的LED，其寿命在20000小时以上，紫外LED光源总功耗仅1～3W，无论是寿命、稳定性、功耗、体积乃至成本指标，紫外LED光源都远远优于传统的低压汞灯；

2、传统光衍生化器采用编织型衍生化反应管，而本发明采用阿基米德螺线型绕制的衍生化反应管，在10μL时就能获得接近传统光衍生化器池体积1000μL时的衍生效率，不仅大幅度降低了衍生池体积、大幅度减小了色谱带的展宽，缩短分析时间，而且结构更简单、实用、大幅降低了制作成本；

3、整个光衍生化器使黄曲霉毒素G1的荧光强度提高7倍，使黄曲霉毒素B1的荧光强度提高5倍，可以满足当下对于黄曲霉毒素痕量检测的需求；

4、整个光化学衍生器体积小巧、轻便、成本低、易于拆卸和更换部件，实用性非常强。

附图说明

图1为反光碗光衍生化器的垂直方向剖面图；

图中：1-紫外LED光源，2-衍生反应管，3-反光碗，4-LED基板和5-散热片。

图2为实施例1的检测谱图,图(a)使用RF-20A检测图，图(b)使用本发明光化学衍生器检测图。

具体实施方式

一种黄曲霉毒素和磺胺类药物的反光碗式光衍生化器，由紫外LED光源1、衍生反应管2、反光碗3、LED基板4和散热片5组成，其特征在于：

反光碗3上端圆形开口的碗形容器，内表面为倒圆台形或小于等于半球的球缺面；

衍生反应管2从上至下螺旋形绕制在反光碗3内壁上，衍生反应管2在反光碗3内壁上形成单层阿基米德螺旋形结构；

一只紫外LED光源1位于衍生反应管2的上方作为光衍生反应的激发光源；LED基板4的下表面与反光碗上口表面3所在平面平行；紫外LED光源1的中轴线与反光碗3上开口中心轴线以及衍生反应管2绕制螺旋的中轴线保持重合；紫外LED光源1与衍生反应管2之间设有一定距离；

散热片5紧贴于LED基板4上表面，用于紫外LED光源1的散热，散热片5上方设有风扇。

所述紫外LED光源1的中心波长在280～370nm之间，发散角60～140°；所述紫外LED光源1与衍生反应管2之间设有一定距离是指它们之间留有间隙，使紫外LED光源1均匀地照射在衍生反应管上；紫外LED光源1与最上端衍生反应管2的上表面的距离为2～7毫米。

所述衍生反应管2的材质为透明的FEP管或PFA管或石英管；其内径0.10～0.35毫米，外径0.3～1.6毫米，长17～30厘米，内容积7～15微升，相邻匝的衍生反应管2之间互相贴紧。

所述反光碗3的材质为表面抛光的金属，如不锈钢、铝、铜，或表面镀膜的塑料。

所述反光碗3的上口直径15～25mm，高度8～15mm，可以使光衍生管在其内壁缠绕3～6圈，以保证衍生体积是7～15μL。

所述LED基板4和散热片5的材质为导热良好的金属材料，如铝或铜，散热片上方设有风扇，利于散热。

实施例1

一种高效液相色谱(HPLC)柱后光衍生化器，激发光源为1只大功率中心波长365nm紫外LED，带宽(FWHM)10nm，发散角60°，额定电流800mA；衍生反应管为高透明的FEP管，内径0.25mm，外径1/16英寸，长18cm，衍生池体积10μL，衍生反应管与LED光源距离为7mm；衍生反应管螺旋形缠绕在反光碗内壁表面，并用细钢丝固定；LED基板和散热片的材质为金属铝。将该光化学衍生器与岛津RF-20A型荧光检测器联接评价其性能。液相色谱条件为：色谱柱：C18柱，4.6mm×150mm×5μm；流动相A甲醇：流动相B纯水＝45:55；流动相流速：1.0mL/min；进样：20μL 0.6ppb黄曲霉毒素混标。浙江大学N2000色谱工作站用于信号采集。

实验结果：

图2为检测谱图：(a)使用RF-20A，无需衍生，直接进样，对黄曲霉毒素B1检测限为0.14ppb；(b)使用本发明光化学衍生器，对黄曲霉毒素B1检测灵敏度提高5倍，检测限为0.03ppb。我们还进行了碘衍生化器和商品化的低压汞灯-Pribolab KRC光化学衍生器的实验。其中，碘衍生器使B1的灵敏度提高7倍，Pribolab KRC光化学衍生器使B1的灵敏度提高6.5倍。值得注意的是，本发明光化学衍生器的峰展宽最小，B1的半峰宽仅0.30min，而碘衍生器和Pribolab KRC光化学衍生器的B1的半峰宽0.38min，且本发明光衍生器的出峰时间比碘衍生器和Pribolab KRC光化学衍生器早1min，分析时间缩短。

本发明的光衍生化器连续使用3个月中，荧光检测黄曲霉毒素的灵敏度未见任何衰减。而Pribolab KRC光衍生化器连续使用三个月后，由于低压汞灯的寿命短，仅2000-3000h，其检测灵敏度已开始下降。可见，本发明光衍生化器的稳定性优于进口PribolabKRC光衍生化器。

实施例2

如实施例1所述的光化学衍生器，将其和岛津RF-20A荧光检测器联用分析检测4种磺胺类药物。RF-20A激发波长230nm，发射波长400nm。

实验结果：进样5ppb磺胺嘧啶(SDZ)，未联接光化学衍生器时RF-20A未检出；联接本发明光化学衍生器后，5ppb磺胺嘧啶(SDZ)可检出，检测信噪比15。

依据本发明实施例的设计思想对实施例的具体实施方式及应用范围进行修改对本领域的专业技术人员来说是显而易见的。本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的一般原理和新颖特点相一致的最宽的范围。凡依据本发明设计思想所做的任何无创造性劳动的改变都在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种黄曲霉毒素和磺胺类药物的微型光衍生化器，由紫外LED光源(1)、透明衍生反应管(2)、反光碗(3)、LED基板(4)和散热片(5)组成，其特征在于：

反光碗(3)为上端圆形开口的碗形容器，内表面为倒圆台形或小于等于半球的球缺面；

衍生反应管(2)从上至下螺旋形绕制在反光碗(3)内壁上，衍生反应管(2)在反光碗(3)内壁上形成单层阿基米德螺旋形结构；

一只紫外LED光源(1)位于衍生反应管(2)的上方作为光衍生反应的激发光源；LED基板(4)的下表面与反光碗上口表面(3)所在平面平行；紫外LED光源(1)的中轴线与反光碗(3)上开口中心轴线以及衍生反应管(2)绕制螺旋的中轴线保持重合；紫外LED光源(1)与衍生反应管(2)之间设有一定距离；

散热片(5)紧贴于LED基板(4)上表面，用于紫外LED光源(1)的散热，散热片(5)上方设有风扇。

2.根据权利要求1所述的反光碗式光衍生化器，其特征在于：所述紫外LED光源(1)的中心波长在280～370nm之间，发散角60～140°；所述紫外LED光源(1)与衍生反应管(2)之间设有一定距离，使紫外LED光源(1)均匀地照射在衍生反应管(2)上；紫外LED光源(1)与最上端衍生反应管(2)的上表面的距离为2～7毫米。

3.根据权利要求1所述的光衍生化器，其特征在于：所述衍生反应管(2)的材质为透明的FEP管或PFA管或石英管；其内径0.10～0.35毫米，外径0.3～1.6毫米，长17～30厘米，内容积7～15微升，相邻匝的衍生反应管(2)之间互相贴紧。

4.根据权利要求1所述的微型光衍生化器，其特征在于：所述反光碗(3)为表面抛光的金属或表面镀膜的塑料。

5.根据权利要求1所述的微型光衍生化器，其特征在于：所述反光碗(3)的上口直径15～25mm，高度8～15mm，可以使得光衍生管在其内壁缠绕3～6圈，以保证衍生体积是7～15μL。

6.根据权利要求1所述的微型光衍生化器，其特征在于：所述LED基板(4)和散热片(5)的材质为导热良好的金属材料，如铝或铜。