CN109385400A - 共表达pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞 - Google Patents

共表达pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞 Download PDF

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Abstract

本发明涉及表达有靶向GPC3的嵌合抗原受体和PD‑L1阻断剂的免疫效应细胞。本发明还提供了包含所述免疫效应细胞的药物组合物以及利用所述免疫效应细胞或药物组合物治疗肿瘤，特别是GPC3阳性肿瘤的方法。本发明的免疫效应细胞不仅在体外对实体瘤细胞有效，在体内对实体瘤细胞也具备优异的杀伤效果。

Description

共表达PD-L1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
技术领域
本发明属于免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及共表达PD-L1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞。
背景技术
近年来，根据CTL对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体(T CellReceptor，TCR)的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的抗体的scFv与T淋巴细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，并将其通过如慢病毒感染等方式基因修饰在T淋巴细胞表面。这种CAR T淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex，MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。
嵌合抗原受体包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ或FcεRIγ及共刺激信号分子CD28、CD27、CD137、CD134等的胞内信号区。
然而，由于生物体，特别是实体瘤的微环境的复杂性，在体外表现出优良效果的候选药物，在体内往往无法表现出相应的效果。换言之，候选药物的体外结果无法合理预示体内的效果。此外，同一个抗体对具有相同靶点的不同部位的肿瘤也有不同效果。例如，曲多珠单抗在应用于HER2阳性乳腺癌时具有较好的治疗作用，但应用于HER2阳性胃癌时，却没有效果(付强,胃癌HER2信号通路及去拖住单抗临床应用进展,药品评价，2012,9(27):8-12)。
尽管免疫效应细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但是其在实体瘤中的疗效仍不显著，免疫效应细胞在肿瘤组织内的存活率较差、活性不高。
因此，本领域仍然需要进行进一步的研究，以期进一步提高免疫效应细胞对于肿瘤免疫治疗的疗效，特别是开发出对实体瘤切实有效的免疫效应细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对于肿瘤免疫治疗的疗效提高的免疫效应细胞，特别是对实体瘤具备有效杀伤作用的免疫效应细胞。
在第一方面，本发明提供一种靶向GPC3的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞表达有靶向GPC3的嵌合抗原受体和PD-L1阻断剂。
在优选的实施方式中，所述免疫效应细胞靶向阳性表达GPC3的肿瘤，包括但不限于肝癌、胃癌、肺癌、食道癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤、食道癌；优选地，所述肿瘤是肝癌、胃癌、肺癌、食道癌。
在优选的实施方式中，所述免疫效应细胞是在没有细胞因子存在下，优选在没有IL2存在下，表现出优异的体外扩增性能的免疫效应细胞。
在具体的实施方式中，所述的PD-L1阻断剂为天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段、或抗PD-L1的抗体。
在优选的实施方式中，所述PD-1是可溶性PD-1(sPD-1)。
在优选的实施方式中，所述抗PD-L1的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在具体的实施方式中，所述的PD-L1阻断剂为：
天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段；
天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段与抗体的Fc区段或者抗体的Fc区段的片段融合形成的融合肽；或者
天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段与抗体的Fc区段或者抗体的Fc区段的片段的突变体融合形成的融合肽。
在具体的实施方式中，所述PD-L1阻断剂是天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段。
在具体的实施方式中，所述的抗体为IgG1、IgG2、IgG3、或者IgG4，优选IgG4。
在具体的实施方式中，所述的抗体的Fc区段的片段为CH3结构域。
在具体的实施方式中，所述的PD-L1阻断剂为天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段与hIgG4e1-Fc的融合肽；优选地，所述的天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段和所述的hIgG4e1-Fc之间经由linker连接；更优选地，所述的linker的编码序列如SEQID NO:3所示。
在具体的实施方式中，所述的PD-L1阻断剂为天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段与hIgG4e1-Fc的CH3的结构域形成的融合肽；优选地，所述的天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段和所述的CH3的结构域之间经由linker连接；更优选地，所述的liner的编码序列如SEQ ID NO：3所示。
在具体的实施方式中，所述的天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段包括SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码的PD-1胞外区。
在具体的实施方式中，所述的天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段的编码核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示的编码PD-1信号肽的核苷酸序列和SEQ ID NO:2所示的编码PD-1胞外区的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，所述的hIgG4e1-Fc的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在具体的实施方式中，所述的hIgG4e1-Fc的CH3结构域的编码核苷酸序列如SEQID NO:4所示。
在具体的实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括：靶向GPC3的胞外抗原结合区，跨膜区和胞内信号区。
在具体的实施方式中，所述的靶向GPC3的胞外抗原结合区具有SEQ ID NO：15、16、17所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及SEQ ID NO：18、19、20所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
在具体的实施方式中，所述的靶向GPC3的胞外抗原结合区含有SEQ ID NO：21所示的重链可变区和SEQ ID NO：22所示的轻链可变区。
在具体的实施方式中，所述的靶向GPC3的胞外抗原结合区具有SEQ ID NO：14或者SEQ ID NO：27所示的scFv序列。
在具体的实施方式中，所述的胞内信号区包括：CD3ζ，FcεRIγ，CD27，CD28，4-1BB，CD134，CD40的胞内信号区序列或Myd88，或其组合。
在具体的实施方式中，所述的跨膜区包括：CD8跨膜区或CD28跨膜区。
在具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：23、24、25、26、28、29、30、或31所示的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，所述的免疫效应细胞包括：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞，Treg细胞。
在第二方面，本发明提供一种核酸构建物，所述的核酸构建物包括顺序连接的：PD-L1阻断剂编码序列，嵌合抗原受体中靶向GPC3的胞外抗原结合区的编码序列，跨膜区和胞内信号区编码序列。
在具体的实施方式中，所述的PD-L1阻断剂编码序列和胞外抗原结合区编码序列之间以连接肽编码序列连接；和/或
所述的PD-L1阻断剂编码序列和胞外抗原结合区编码序列之间，还包括核糖体跳跃序列。
在第三方面，本发明提供一种表达载体，其包含编码本发明第二方面所述的核酸构建物。
在第四方面，本发明提供一种病毒，所述的病毒包含本发明第三方面所述的表达载体。
在第五方面，本发明提供本发明第二方面所述的核酸构建物、或包含该核酸构建物的表达载体或病毒的用途，用于制备靶向肿瘤的靶向GPC3的免疫效应细胞。
在第六方面，本发明提供本发明第一方面所述的靶向GPC3的免疫效应细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物组合物。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是阳性表达GPC3的肿瘤，包括但不限于肝癌、胃癌、肺癌、食道癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤、食道癌；优选地，所述肿瘤是肝癌、胃癌、肺癌、食道癌。
在第七方面，本发明提供一种用于抑制肿瘤的药物组合物，其包括本发明第一方面所述的嵌合受体修饰的免疫效应细胞。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是阳性表达GPC3的肿瘤，包括但不限于肝癌、胃癌、肺癌、食道癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤、食道癌；优选地，所述肿瘤是肝癌、胃癌、肺癌、食道癌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是CAT-T细胞的阳性率检测的流式图；
图2A显示了GPC3-28Z-sPD1培养上清中分泌的sPD1的量，图2B显示了WesternBlot检测上清中sPD1的表达结果；
图3显示了与靶细胞共孵育后GPC3-28Z-sPD1和GPC3-28Z的PD-1、TIM-3、Lag-3的表达；
图4A显示了PD-L1在肝癌细胞系中的表达情况(蓝色)及IFN-γ刺激后PD-L1上调情况(黄色)；图4B显示了Western Blot检测再次确认GPC3及PD-L1在肝癌细胞系中的表达；
图5A和图5B显示了与靶细胞共孵育后GPC3-28Z-sPD1与GPC3-28Z相比，p-AKT与Bcl-xL有更明显的上调，说明携带了可溶性PD-1的CAR-T增强了抗肿瘤作用；
图6A-6F显示了GPC3-28Z-sPD1和GPC3-28Z的体外对不同肿瘤细胞系的杀伤作用；
图7显示了GPC3-28Z-sPD1和GPC3-28Z的细胞因子释放；
图8显示了GPC3-28Z-sPD1和GPC3-28Z的对SK-HEP-1、SK-HEP-1-GPC3皮下移植瘤的抗肿瘤治疗结果；
图9显示了GPC3-28Z、GPC3-28Z-sPD1对Huh7皮下移植瘤的抗肿瘤治疗结果；
图10显示了GPC3-28Z-sPD1和GPC3-28Z的体内存活情况及细胞因子IFN-γ分泌情况；
图11A和11B显示了SK-HEP-1-GPC3移植瘤病理切片的免疫组化结果；图11C和11D显示了huh7移植瘤病理切片的免疫组化结果；
图12显示了不同CAR-T细胞的体外扩增情况。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现表达有靶向GPC3的嵌合抗原受体和PD-L1阻断剂的免疫效应细胞不仅在体外对实体瘤细胞有效，在体内对实体瘤细胞也具备更优异的杀伤效果，从而提高了免疫效应细胞在肿瘤中的存活及功能。在此基础上完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域
CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
免疫球蛋白可以衍生自任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA，分泌型IgA，IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员熟知的，包括但不限于人IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的Ab类或亚类(例如IgM或IgG1)。术语“抗体”包括，例如，天然存在的和非天然存在的Ab；单克隆和多克隆Ab；嵌合和人源化Ab；人或非人Ab；全合成Ab；和单链Ab。非人Ab可以通过重组方法人源化以降低其在人中的免疫原性。在没有明确说明的情况下，并且除非上下文另有说明，否则术语“抗体”还包括任何上述免疫球蛋白的抗原结合片段或抗原结合部分，并且包括单价和二价片段或部分，以及单链Ab。
本文使用的术语“PD-1”包括人PD-1(hPD-1)，hPD-1的变体(突变的hPD-1)、同种型和物种同源物，以及与hPD-1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同性的类似物。完整的hPD-1序列可以在GenBank登录号U64863下找到。
“程序性死亡配体-1(PD-L1)”是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种是PD-L2)，其在结合PD-1时下调T细胞活化和细胞因子分泌。本文所用的术语“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)，hPD-L1的变体、同种型和物种同源物，以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-L1序列可以在GenBank登录号Q9NZQ7下找到。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
术语“抗体的Fc区段”可以来自天然的或野生型的，也可以是天然或野生型的Fc区段的突变体。“抗体的Fc区段”包括包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体恒定区的多肽。因而，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，和这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。
本文所述的“CH3”或“CH3结构域”可以来自天然的或野生型的，也可以是天然或野生型的Fc区段的突变体，优选人的IgG4的CH3、或者人的IgG4的CH3的突变体，如hIgG4e1。
术语“突变”或“变体”或“突变体”包括由于相比亲本的至少一个氨基酸修饰，而不同于亲本抗体序列的抗体序列，“变体”或“突变体”的序列与亲本抗体序列具有至少约80％、优选至少约90％、更优选至少约95％、更优选至少约97％、更优选至少约98％、最优选至少约99％的氨基酸序列同一性。
GPC3和GPC3阳性肿瘤
本文所用的“GPC3”或“磷脂酰肌醇蛋白聚糖3”是Glypican家族的一员，其在调控细胞生长和分化方面起重要作用。GPC3异常表达与多种肿瘤的发生、发展关系密切，如在肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、甲状腺癌、胃癌、结直肠癌、等中呈现异常表达。
在本发明中，免疫效应细胞靶向GPC3阳性表达的肿瘤。在具体的实施方式中，所述肿瘤包括但不限于肝癌、胃癌、肺癌、食道癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、宫颈癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤、肾上腺癌、神经鞘瘤、恶性纤维组织细胞瘤、食道癌。本领域技术人员知晓，有些肿瘤细胞，例如肝癌细胞对很多药物不敏感，因此，即便在体外有效的药物，有时候在体内的效果也不佳，甚至没有效果。因此，在优选的实施方式中，本文所述的GPC3阳性表达的肿瘤或GPC阳性肿瘤是肝癌、胃癌、肺癌、食道癌。
术语“嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞(或简称嵌合抗原受体免疫效应细胞)”是本领域公知的，其是利用基因改造技术表达抗原(如肿瘤抗原)特异性嵌合受体的免疫效应细胞，能靶向性发挥杀伤作用。所述的免疫效应细胞例如包括T细胞，NK细胞，NKT细胞，调节性T细胞(Regulatory cell，简称Treg)。常规的制备“嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞”的方法是本领域技术人员已知的，包括让其表达胞内共刺激细胞分子胞内结构域，例如CD28，CD137，CD27，CD3ζ(较佳地为CD3ζ细胞内域)，CD8，CD19，CD134，CD20，FcεRIγ中的一种或多种。通过它们与相应配体结合，激活免疫效应细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长免疫细胞的存活时间。
在具体的实施方式中，本发明的嵌合抗原受体的结构依次(较佳地为从N端到C端)包括：程序性死亡配体-1阻断剂，胞外抗原结合区，跨膜区和胞内信号区。
所述的程序性死亡配体-1(PD-L1)阻断剂可以是多种能够下调、阻断、阻滞、抑制PD-L1的物质，只要其能够阻止或竞争性干扰PD-L1与表达于免疫效应细胞的PD-1相互作用。例如，本发明的PD-L1阻断剂为天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段、或抗PD-L1的抗体。在具体的实施方式中，所述的程序性死亡配体-1阻断剂包括但不限于：sPD-1；sPD-1与hIgG4e1-Fc的CH3结构域的融合肽；sPD-1与hIgG4e1-Fc的融合肽；或特异性抗PD-L1抗体。
作为本发明的优选方式，所述胞外抗原结合区包含特异性识别肿瘤高表达的抗原的抗体，较佳地为单链抗体。更优选地，所述嵌合抗原受体的胞外抗原结合区通过CD8铰链区与CD8或者CD28的跨膜区相连接，跨膜区后紧接胞内信号区。
嵌合抗原受体的跨膜区可以选自CD8或CD28等蛋白的跨膜区。人CD8蛋白是异二聚体形态，由αβ或者γδ两条链组成。在本发明的一个实施方案中，跨膜区选自CD8α或者CD28的跨膜区。此外，CD8α铰链区(hinge)是一个柔性区域，因此，CD8或CD28和跨膜区加上铰链区被用于将嵌合抗原受体CAR的胞外抗原结合区和胞内信号区连接起来。
胞内信号区可以选自CD3ζ，FcεRIγ，CD28，CD137(4-1BB)，CD134蛋白的胞内信号区，及其组合。CD3分子由五个亚单位组成，其中CD3ζ亚单位(又称CD3zeta，简称Z)含有3个ITAM基序，该基序是TCR-CD3复合体中重要的信号转导区。CD3δZ是截短的不具有ITAM基序的CD3ζ序列，在本发明实践中一般作为阴性对照的构建。FcεRIγ主要分布在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，其含有一个ITAM基序，在结构、分布及功能上与CD3ζ类似。此外如前所述，CD28，CD137，CD134是共刺激信号分子，在与各自配体结合后其胞内信号区段产生的共刺激作用引起免疫效应细胞(主要是T淋巴细胞)的持续增殖，并能够提高免疫效应细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR免疫效应细胞在体内的存活周期和抗肿瘤效果。
本发明的嵌合抗原受体多肽可以选自按如下方式顺序连接：
胞外抗原结合区-CD8跨膜区-4-1BB-CD3ζ，
胞外抗原结合区-CD28a-CD28b-CD3ζ，
胞外抗原结合区-CD28a-CD28b-4-1BB-CD3ζ，
及其组合，其中相关嵌合抗原受体蛋白中CD28a代表CD28分子的跨膜区，CD28b代表CD28分子的胞内信号区。
本发明也包括编码所述嵌合抗原受体的核酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。
本发明还提供了包含上述嵌合抗原受体的核酸的载体。本发明还包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其它可用于将外源基因转导入免疫效应细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。
本发明还提供了嵌合抗原修饰的免疫效应细胞，其被转导有编码所述的嵌合抗原受体的核酸或被转导有上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括电穿孔法和转座子法。近期Amaxa公司研发的Nucleofector核转染仪能够直接将外源基因导入细胞核获得目的基因的高效转导。另外，基于睡美人转座子(SleepingBeauty system)或PiggyBac转座子等转座子系统的转导效率较普通电穿孔有较大提高，将nucleofector转染仪与睡美人转座子系统联合应用已有报道[Davies JK.，etal.Combining CD19redirection and alloanergization to generate tumor-specifichuman T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.Cancer Res，2010，70(10):OF1-10.]，该方法既具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的免疫效应细胞的转导方法是基于病毒如逆转录病毒或慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养免疫效应细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因免疫效应细胞表面，转导的核酸通过转录、翻译表达在其表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒实验证明，本发明的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果(亦称细胞毒性)，且能够在肿瘤组织中有效存活。因此本发明的编码嵌合抗原受体的核酸，包含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上述核酸，质粒或病毒的转基因免疫效应细胞可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。
本发明所述的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞还可以携带外源的细胞因子的编码序列；所述的细胞因子包括但不限于：IL-12、IL-15或IL-21等。这些细胞因子具有免疫调节或抗肿瘤的活性，能增强效应T细胞及活化的NK细胞的功能，或直接发挥抗肿瘤作用。因此，本领域技术人员可以理解，这些细胞因子的运用有助于所述的免疫细胞更好地发挥作用。
本发明所述的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞还可以表达除了上述嵌合受体以外的另一种嵌合受体，该受体不含有CD3ζ，但含有CD28的胞内信号结构域、CD137的胞内信号结构域或者这两者的组合。
本发明所述的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞还可以表达趋化因子受体；所述的趋化因子受体包括但不限于CCR2。本领域技术人员可以理解，所述的CCR2趋化因子受体可以使得体内的CCR2与之竞争性结合，对于阻断肿瘤的转移是有利的。
本发明所述的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞还可以表达能降低PD-1表达的siRNA或者阻断PD-L1的蛋白。本领域技术人员可以理解，竞争性阻断PD-L1与其受体PD-1的相互作用，有利于恢复抗肿瘤T细胞反应，从而抑制肿瘤生长。
本发明所述的嵌合抗原修饰的免疫效应细胞还可以表达安全开关；较佳地，所述的安全开关包括：iCaspase-9，truncated EGFR或RQR8。
本发明的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞可以应用于制备药物组合物或诊断试剂。所述的组合物除了包括有效量的所述免疫细胞，还可包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液和磷酸盐缓冲液等。
本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式可以采用注射或其它治疗方式。
本发明的优点：
1.本发明的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞可有效地增加所述免疫效应细胞在肿瘤内的存活及功能；
2.本发明的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞不仅在体外对实体瘤细胞有效，与不共表达PD-L1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞相比，在体内对实体瘤细胞具备更优异的杀伤效果以及体外扩增性能。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.可溶性sPD1-CH3结合嵌合抗原(GPC3)受体的重组慢病毒载体PRRLSIN-cPPT.EF-1α-sPD1-CH3-F2A-9F2–CAR的构建
1.设计人源sPD1、sPD1-CH3及sPD1-Fc序列
1)人源sPD1序列设计
PD-1DNA序列参考pubmed Nucleotide数据库，PD-1对应编号NM_005018.2；PD-1的信号肽及胞外段参考Uniprot数据库。
PD-1信号肽序列：
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGG(SEQ IDNO:1)。
PD-1胞外段序列：
CCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTG(SEQ ID NO:2)
2)人源sPD1-CH3序列设计
sPD1通过linker与hIgG4e1-Fc中的CH3结构域，linker序列为TATGGT(SEQ ID NO:3)，CH3结构域序列参考pFUSE-hIgG4e1-Fc1v01质粒。
CH3结构域的DNA序列：
CCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCC(SEQ ID NO:4)
3)人源sPD1-Fc序列设计
sPD1通过linker与hIgG4e1-Fc结构域，linker序列为TATGGT。hIgG4e1-Fc结构域序列参考pFUSE-hIgG4e1-Fc1v01质粒。
hIgG4e1-Fc结构域的DNA序列：
CCCCCATGCCCACCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO：5)
将PD-1的信号肽序列、PD-1胞外段序列、CH3的序列进行全合成并克隆进T载体，得到质粒T-sPD1-Fc。
2.构建GPC3-28Z-sPD1
1)sPD1-CH3片段的扩增
以T-sPD1-Fc质粒为模板，以上游引物5’-acgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatgcagatcccacaggcgccc-3’(SEQ ID NO：6)，下游引物5’-ctctcggggctgcccaccatacaccagggtttggaactggc-3’(SEQ ID NO：7)PCR扩增获得sPD1序列；以上游引物5’-tatggtgggcagccccgagagccacag-3’(SEQ ID NO：8)，下游引物aaaattcaaagtctgtttcactttacccggagacagggag-3’(SEQ ID NO：9)扩增获得sPD1-CH3片段。
2)带有F2A及CD8信号肽的片段的获得
使用编码蛋白Gag/Pol的包装质粒pMDLg RRE(Addgene)，编码Rev蛋白的包装质粒pRSV-REV(Addgene)，编码VSV-G蛋白的包膜质粒pCMV-VSV-G(Addgene)及基于空载体pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE(Addgene)的编码目的基因CAR的重组表达载体。
首先，通过常规分子克隆的技术方式，对空载体pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE进行改造，用延长因子-1α(elongation factor-1α，简称EF-1α)的启动子替代原载体的启动子，并在启动子和CD8α信号肽之间增加了MluI酶切位点。具体地，使用ClaI/SalI(NEB)双酶切载体pWPT-EGFP(Addgene)，回收1.1Kb的DNA片段，用T4DNA连接酶连接于经ClaI/SalI双酶切的载体pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE，并转化于宿主菌TOP10中，挑取克隆通过菌落PCR鉴定阳性克隆并通过测序确认，获得重组质粒pRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP.WPRE。
采用上游引物5’-gcaggggaaagaatagtagaca-3’(SEQ ID NO:32)和下游引物5’-CGGCCTGGCGGCGTGGAG-3’(SEQ ID NO:33)，以pRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP.WPRE为模板，PCR扩增含有CD8α信号区的EF-1α启动子(SEQ ID NO:3)(内含Mlu I酶切位点)，命名为片段1。
以包含AB1的重链可变区(SEQ ID NO:34)片段的质粒为模板，采用上游引物5’-ctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtgcag-3’(SEQ ID NO:36)和下游引物5’-GCGGTGTCCTCGCTCCGCAGGCTGCTCAGCTCCATGTAGGCGGTG-3’(SEQ ID NO:37)扩增出重链可变区片段；以轻链可变区(SEQ ID NO:35)片段的质粒为模板，采用上游引物5’-GCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTTCTACAGCTAC-3’(SEQ ID NO:38)和下游引物5’-CGGCGCTGGCGTCGTGGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTG-3’(SEQ ID NO:39)扩增出轻链可变区片段。上述重链和轻链可变区引物通过搭桥PCR，进一步扩增出含有与上游CD8α信号肽和下游铰链区重复序列的AB1的scFv片段，命名为片段2。
采用上游引物5’-accacgacgccagcgccg-3’(SEQ ID NO:40)和下游引物5’-aatccagaggttgattgtcgacctagcgagggggcagggcctgc-3’(SEQ ID NO:41)，分别以pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z为模板(具体参考中国专利CN104140974A)，扩增得到Hinge-28Z的片段，命名为片段3。
分别将等摩尔约50ng的片段1、片段2和片段3进行拼接PCR，拼接条件为：预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行5个循环，然后总延伸68℃，10min，补充DNA聚合酶及上游引物5’-gcaggggaaagaatagtagaca-3’(SEQ ID NO:32)和下游引物5’-aatccagaggttgattgtcgacctagcgagggggcagggcctgc-3’(SEQ ID NO:41)，通过PCR扩增25个循环，扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，总延伸68℃，10min。扩增获得AB1-28Z。
采用MluI和SalI酶切载体pRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP.WPRE和AB1-28Z。通过T4连接酶进行连接，转化TOP10，挑克隆进行PCR鉴定阳性菌，送去Invitrogen进行测序确认序列正确，获得质粒pRRL-EF-1α-AB1-28Z。
以PRRLSIN-cPPT.EF-1α-AB1-28Z(pRRL-EF-1α-AB1-28Z)为模板，上游引物5’-caaaggcctcccgtccgtgaaacagactttgaattttgac-3’(SEQ ID NO：10)，下游引物5’-tgcgggaagtgtacgtccgggacgggggagcgatccagctgttagt-3’(SEQ ID NO：11)，扩增获得CD8αhinge-CD28TM-AB1-28Z片段。
3)sPD1-CH3-αGPC3-28z的制备
将sPD1-CH3片段、CD8αhinge-CD28TM-AB1-28Z的片段PCR拼接。拼接条件为：预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，150s，进行5个循环，然后总延伸68℃，10min，补充DNA聚合酶及上游引物5’-acgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatgcagatcccacaggcgccc-3’(SEQ ID NO：6)和下游引物5’-tgcgggaagtgtacgtccgggacgggggagcgatccagctgttagt-3’(SEQ ID NO：9)进行PCR扩增，扩增条件为：预变性：94℃，4min；变性：94℃，20s；退火：58℃，30s；延伸：68℃，1000bp/min(kod-plus)；进行35个循环，然后总延伸68℃，10min。获得sPD-1-CH3-GPC3-28z，目的条带理论大小2373bp，PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合目的片段大小。
上述构建片段sPD-1-CH3-αGPC3-28z的5’端带有MluI酶切位点，3’端带有SalI酶切位点。通过MluI和SalI双酶切，连入同样双酶切的PRRLSIN-cPPT.EF-1α载体中，得到表达sPD-1-CH3蛋白的靶向GPC3的嵌合抗原受体的质粒。
实施例2.慢病毒制备及T淋巴细胞嵌合抗原受体的表达
1.慢病毒包装
(1)293T细胞接种：按照6×106的密度接种培养至第6～10代的293T细胞于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养过夜准备用于转染，培养基为含10％胎牛血清(Gibco)的无抗生素DMEM，次日，在细胞丰度约70％-80％准备转染。
(2)转染：
待转质粒：质粒pRRL-EF-1α-AB1-28Z(质粒1)或表达sPD-1-CH3蛋白的靶向GPC3的嵌合抗原受体的质粒(质粒2)
使用PEI进行转染，使用四质粒慢病毒包装系统，配制PEI/DNA混合物A液配制：分别取质粒1或质粒2(待转质粒)5.4μg，pMDLg-pRRE 6.2μg，pRSV-Rev 6.2μg，pCMV-VSV-G2.4μg。将质粒溶解于800μL的无血清DMEM培养液中，予混匀(或1000rpm涡旋5秒钟)。B液配制：将60μg PEI(1μg/μL)溶解于800μL的无血清DMEM培养基中混匀(或1000rpm涡旋5秒钟)，室温孵育5min。待转染复合体的形成：将A液加入B液中轻轻混合(即质粒稀释液加入PEI稀释液中，顺序不能颠倒)，PEI与DNA质量比约为3:1。加入后予立即涡旋混合或轻轻混匀，室温下孵育20min。然后将转染复合体1.6ml滴加入含11ml DMEM培养基的10cm培养皿中。4-5h小时后，用2％FBS的DMEM培基给转染的293T细胞换液。
(3)病毒收集及浓缩：转染后的293T细胞置于37℃培养箱中孵育72小时，可在48小时收集病毒上清一次，于4℃保存，再加10mL2％FBS的DMEM培养基待72小时时收集第二次，与48小时收集的病毒上清一并浓缩。将事先配制好的PEG8000·NacL溶液按1:4的比例加入病毒上清中，置于室温，每半小时上下颠倒混匀一次，共2-3次，4℃沉淀过夜。次日，予以4000rpm，60min，4℃冷冻离心机离心，病毒沉淀用含2％人血清的AIM-V完全培养基重悬(浓缩倍数约70-100倍)，分装后-80℃冰箱冻存备用。
(4)慢病毒滴定：有限稀释法感染293T细胞测定包装有重组载体的慢病毒滴度第一天，以1×105/mL接种293T细胞于96孔培养板，100μL/孔，于37℃，5％CO2培养，培养液为含6μg/mL polybrene的10％胎牛血清的DMEM，于37℃，5％CO2孵育30min。加10μL/孔的病毒原液或1μL/孔的病毒浓缩液，5倍稀释，4个梯度，两个复孔，37℃，5％CO2培养，得到包装有CAR-GCP3的慢病毒和包装有sPD-1-CH3和CAR的慢病毒。
2.CAR阳性的T淋巴细胞的制备
(1)T淋巴细胞的活化：外周血单个核细胞(PBMC)洗涤后计数，调整浓度为1×106/mL，按照1:2比例加入包被αCD3/αCD28抗体的磁珠并添加浓度500U/mL的重组人IL-2刺激培养48h。
(2)病毒感染T细胞：在感染之前补加工作浓度为5μg/mL的polybrene以提高感染效率，采用MOI≈5-10感染的病毒浓缩液重悬已活化的T细胞，1800g，32℃离心30min后重悬，于5％CO2的培养箱中37℃培养。
(3)扩增培养感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度300U/mL的重组人IL-2。得到只表达CAR的T细胞(GPC3-28z)以及共表达sPD-1-CH3和CAR的T细胞(GPC3-28Z-sPD1)。
3.流式检测CAR在T细胞上的表达
T淋巴细胞嵌合抗原受体表达：慢病毒感染的T淋巴细胞在培养第4-5天，收集5×105的T细胞于EP管，用事先冰浴的流式洗涤液(1％NCS加PBS配制)洗涤2次，1:50比例稀释加入Biotin标记的Fab抗体，冰上孵育45min，涡旋洗涤三次，1:200比例稀释加入PE标记的链和亲霉素二抗抗体，冰上孵育45min，涡旋洗涤三次后转至流式专用管，上机检测。结果如图1所示。携带了sPD-1-CH3的CAR-T与普通的CAR-T同样具有较高的阳性表达率。
收集慢病毒感染T细胞后的上清，通过Elisa检测sPD1-CH3在感染T细胞上清中的表达，结果如图2A所示，显示GPC3-28Z-sPD1的PD-1的分泌量大于1000pg/ml，说明sPD1-CH3能较好的分泌到胞外。
收集慢病毒感染T细胞后的细胞及上清，通过免疫印迹法检测sPD1-CH3在感染T细胞细胞及上清中的表达，分泌至细胞培养上清中的sPD-1-CH3通过proterinA/G进行免疫沉淀，结果如2B所示，sPD1-CH3均可以在感染后的T细胞上清及细胞中检测出来，说明sPD1-CH3能较好的分泌到胞外。
实施例3.衰老标记物在CAR-T细胞膜表面表达情况
选择GPC3阳性的SK-HEP-1-GPC3作为靶细胞，将靶细胞分别与体外培养第11天的共表达sPD1的CAR-T细胞(GPC3-28Z-sPD1)及不表达sPD1的CAR-T细胞(GPC3-28Z)按1:1比例共孵育，每24小时予靶细胞刺激1次，共72小时，收集5×105的T细胞于EP管，用事先冰浴的流式洗涤液(1％NCS加PBS配制)洗涤2次，1:50比例稀释分别加入Anti-human CD279(PD-1)(eBioscience PerCP-eFluor○R CLONE:eBioJ105)；Anti-human CD366(TIM-3)(eBioscience APC CLONE:F38-2E2)；Anti-human CD223(Lag-3)(eBioscience eFluor○R450 CLONE:3DS223H)直标抗体，冰上孵育45min，涡旋洗涤三次后，流式检测T细胞的耗竭标志物PD-1、TIM-3、Lag-3，结果如图3所示，T细胞经靶抗原刺激后，GPC3-28Z-sPD1和GPC3-28Z相比，其膜表面的PD-1表达较低，说明在共同接受靶抗原刺激后，GPC3-28Z-sPD1具有防止T细胞衰竭的作用。
实施例4.PD-L1在肝细胞肝癌细胞系上的表达
培养的生长状态良好的如下的HCC(Hepatocellular Carcinoma)细胞：SK-HEP-1、SK-HEP-1-GPC3、Huh7、Hep3B、PLC/PRF/5和HepG2，汇合度为80-90％，其中，SK-HEP-1为GPC3阴性，其余细胞为GPC3阳性。用胰酶消化液消化处理细胞并吹散细胞于2mL EP管，400g离心5min。流式洗涤液洗涤并重悬细胞，2～5×105/管，分管。
流式检测PD-L1的表达，抗体为Anti-Human CD274(B7-H1)PE，5ul(0.5ug)/样，冰浴45min，洗涤三次，去除PE直标抗体，进行流式细胞分析。另一组肿瘤细胞予以IFN-γ按10ng/ml浓度与肿瘤细胞共孵育刺激24小时，检测PD-L1上调情况。结果如图4A所示，说明SK-HEP-1、SK-HEP-1-GPC3、Huh7、Hep3B、PLC/PRF/5和HepG2均有PD-L1的表达，经微量的IFN-γ(10ng/mL)刺激后各细胞系的PD-L1都具有明显的上调。
为了进一步验证各肝癌细胞系的PD-L1的表达，采用Western Blot检测PD-L1的表达，结果如图4B所示，显示GPC3阴性的SK-HEP-1和GPC3阳性的其他细胞均显示PD-L1阳性。
实施例5.GPC3-28Z-sPD1的肿瘤免疫逃逸对抗
由于AKT的磷酸化水平及Bcl-xL蛋白的表达是肿瘤免疫逃逸的重要指标，因此通过检测T细胞的磷酸化的AKT(p-AKT)及Bcl-xL蛋白的表达来验证GPC3-28Z-sPD1的对抗肿瘤逃逸的情况。
将GPC3-28Z、GPC3-28Z-sPD1-T细胞1×106作为效应细胞，按照1:1的比例分别与靶细胞Huh7，SK-HEP-1-GPC3共孵育24小时，收集T淋巴细胞，然后裂解T淋巴细胞并收集蛋白，BCA法蛋白定量后Western Blot检测AKT、p-AKT及Bcl-xL蛋白在各组中的表达情况。
表达结果如图5A和5B所示，与GPC3-28Z相比，在两种不同的靶细胞中，GPC3-28Z-sPD1具有更高水平的p-AKT及Bcl-xL的表达，说明GPC3-28Z-sPD1具有更强的抗肿瘤活性。
实施例6.体外毒性试验
采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。具体方法参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
效应细胞：按效靶比3:1、1:1或1:3分别接种Untransduced T细胞、GPC3-28Z T细胞、GPC3-28Z-sPD1T细胞于96孔板。
靶细胞：分别接种50μL 2×105/mL的SK-HEP-1、SK-HEP-1-GPC3、Huh-7、PLC/PRF/5、Hep3B、HepG2到相应的96孔板。
每组均设置5个复孔。将培养板置于细胞培养箱中孵育18h。
其中各实验组及各对照组设置如下：实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的T淋巴细胞；对照组1：靶细胞最大释放LDH；对照组2：靶细胞自发释放LDH；对照组3：效应细胞自发释放LDH。计算公式为：％细胞毒性＝[(实验组-效应细胞自发组-靶细胞自发组)/(靶细胞最大-靶细胞自发)]*100。实验结果如图6所示。
实施例7.细胞释放的细胞因子检测
将5×104的CAR-T细胞接种到24孔板，同时接种5×104的靶细胞，终体积为400ul，不添加外源IL-2，放培养箱培养24h后收集上清，采用ELISA方法检测IL-2、IFN-γ、IL-4和TNF-α的浓度。
实验结果如图7所示，有细胞因子分泌说明T细胞被活化并起到杀伤作用。
实施例8.皮下移植瘤的抗肿瘤治疗实验
1.SK-HEP-1、SK-HEP-1-GPC3皮下移植瘤模型
1)实验分组：NOD-SCID小鼠20/24只，6-8周龄随机分为3组，每组5只，分别为Untransduced、GPC3-28Z对照组和GPC3-28Z-sPD1治疗组。
2)皮下移植瘤的接种：胰酶消化法收集处于对数生长期且生长状态良好的SK-HEP-1细胞、SK-HEP-1-GPC3细胞，用生理盐水洗涤1次后，调整细胞密度为1×107/mL，用注射器在NOD-SCID小鼠右侧腹部皮下部位注射200μL细胞悬液，即每只小鼠接种2×106的肿瘤细胞，接种日记为第0天。
3)CAR-T细胞回输：当肿瘤大小约为150mm3时，即接种肿瘤后第14天腹腔注射环磷酰胺(200mg/kg)，注射24小时后即接种肿瘤后第15天尾静脉注射8×106/只CAR-T细胞(阳性转导率70-90％)或未经转导的T细胞对照。实验结果如图8所示。
2.Huh7皮下移植瘤模型
参照上述操作，制备Huh7皮下移植瘤模型，当肿瘤大小约为150mm3时，即接种肿瘤后第13天腹腔注射环磷酰胺(200mg/kg)，注射24小时后即接种肿瘤后第14天尾静脉注射7×106/只基因修饰的T细胞(阳性转导率70-90％)或未经转导的T细胞对照，结果如图9所示。
根据图8和图9，在GPC3表达阴性的肿瘤模型SK-HEP-1中两者均没有治疗作用，说明对于靶抗原阴性的前提下GPC3-28Z-sPD1不会有非特异杀伤；在GPC3表达阳性的SK-HEP-1-GPC3模型中，两者在早期都具有较强的抗肿瘤活性，但随着时间的推移，GPC3-28Z-sPD1具有更强的抑瘤效果。
实施例9.外周血T细胞的数量及血清IFN-γ分泌情况
小鼠眼眶取血加入BDTruCount试管，随后取20μL CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP抗体加入BDTruCount试管；吸取50μL与肝素充分混匀的抗凝血加入CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP抗体中，并混匀，室温孵育30min；加入450μL 1×红细胞裂解液(BD)，充分混匀，室温孵育15min。
流式检测CD4+FITC和CD8+PE阳性细胞，计算二者阳性细胞数，计算公式：细胞数/μL＝FITC或PE阳性的细胞数×总的微球数目/微球数目/50μL。
检测血清中IFN-γ的分泌，检测方法同实施例7的体外细胞因子检测。检测结果如图10所示，外周血T细胞的存活量是CAR-T能否发挥长久抑瘤作用的关键，IFN-γ的分泌表明T细胞被充分活化并发挥抗肿瘤作用。
实施例10.肿瘤组织免疫组织化学染色
取实施例8构建的两种动物模型的肿瘤病例切片，将石蜡包埋的病理切片，置于65℃烘箱中烤片1～2h，常规脱蜡后，对标本进行水化，水化的操作为：二甲苯浸泡3次，每次10min(按照二甲苯I、II、III的顺序)；无水乙醇浸泡2次，每次5min；90％乙醇浸泡5min；80％乙醇浸泡5min；70％乙醇浸泡5min；蒸馏水浸泡5min。
水化完成后将切片置于摇床上PBS清洗3次，每次5min，用3％H2O2(用甲醇配制)室温孵育10min，用PBS缓冲液在脱色摇床上(145rpm/min)洗涤3次，每次洗涤2min。
抗原热修复：将盛有柠檬酸缓冲液煮沸后将组织切片放入柠檬酸缓冲液中，92℃～98℃加热10min，室温冷却1h。用PBS缓冲液在脱色摇床上(145rpm/min)洗涤3次，每次洗涤5min；采用1％BSA封闭，室温孵育30min。
将封闭好的切片加入相应的GPC-3抗体、PD-L1抗体、GranB抗体、Ki67抗体(用1％BSA封闭液1:200稀释)或空白对照试剂，4℃孵育过夜；用0.5％PBST缓冲液在脱色摇床上(145rpm/min)洗涤1次，5min；然后用PBS缓冲液在脱色摇床上(145rpm/min)洗涤2次，每次洗涤5min。
将洗涤好的切片加入二抗(Dako REALTMEnVisionTMDetection System,Peroxidase/DAB+，家兔/小鼠)，37℃孵育1h。用0.5％PBST缓冲液在脱色摇床上(145rpm/min)洗涤2次，每次5min；然后用PBS缓冲液在脱色摇床上(145rpm/min)洗涤1次，5min。DAB(Dako REALTMEnVisionTMDetection System,Peroxidase/DAB+,1:50稀释)显色。
苏木紫复染至细胞核染至深红色，将复染后的组织切片置于1％盐酸乙醇分化液分化3～5秒钟；自来水冲洗20min后脱水透明；90％乙醇浸泡1min；100％乙醇I浸泡1min；100％乙醇II浸泡1min；二甲苯浸泡3min；在通风橱内进行中性树胶封片，风干。
结果如图11所示，两种肝癌模型的肿瘤切片CD3、Ki67、GramB表达情况：CD3表达增多说明T细胞存活数目多(GPC3-28Z-sPD1治疗组CD3表达多)；Ki67表达减少说明肿瘤细胞被抑制了生长(GPC3-28Z-sPD1治疗组Ki67表达最少)；GramB分泌增多说明T细胞活化后分泌更多的GramB，说明杀伤更强(GPC3-28Z-sPD1治疗组表达更明显)。
实施例11.CAR-T细胞体外增殖情况检测
为了验证表达PD1后CAR-T细胞在靶抗原刺激后活化扩增情况差异，进行了扩增试验。
将Untransduced T、GPC3-28Z、GPC3-28Z-sPD1三组T细胞在活化扩增第4天时与辐照后(50Gy)靶细胞SK-HEP-1-GPC3共孵育，不加额外的IL2刺激，每周给予一次靶抗原刺激并持续四周，结果如图12所示，GPC3-28Z-sPD1的体外扩增情况优于GPC3-28Z。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 科济生物医药（上海）有限公司
上海市肿瘤研究所
<120> 共表达PD-L1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
<130> P2017-1557
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-1信号肽编码序列
<400> 1
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
<210> 2
<211> 450
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-1胞外段编码序列
<400> 2
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 60
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 120
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 180
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 240
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 300
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 360
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 420
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg 450
<210> 3
<211> 6
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker编码序列
<400> 3
tatggt 6
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CH3结构域的DNA序列
<400> 4
cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 60
cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 120
gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 180
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 240
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 300
tccaacaaag gcctcccgtc c 321
<210> 5
<211> 672
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIgG4e1-Fc结构域的DNA序列
<400> 5
cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 60
cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 120
gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 180
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 240
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 300
tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 360
cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 420
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 480
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 540
ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 600
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 660
tctccgggta aa 672
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 6
acgcgtccta gcgctaccgg tcgccaccat gcagatccca caggcgccc 49
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 7
ctctcggggc tgcccaccat acaccagggt ttggaactgg c 41
<210> 8
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 8
tatggtgggc agccccgaga gccacag 27
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 9
aaaattcaaa gtctgtttca ctttacccgg agacagggag 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 10
caaaggcctc ccgtccgtga aacagacttt gaattttgac 40
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 11
tgcgggaagt gtacgtccgg gacgggggag cgatccagct gttagt 46
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 12
aagcttacgc gtcctagcgc taccggtcgc caccatgcag atcccacagg cgccctggcc 60
<210> 13
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 13
atgcaggccc tgccccctcg ctaggtcgac aatcaacctc tggattaca 49
<210> 14
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1 scFv（9F2）氨基酸序列
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
130 135 140
Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1的HCDR1区
<400> 15
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1的HCDR2区
<400> 16
Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1的HCDR3区
<400> 17
Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr
1 5
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1的LCDR1区
<400> 18
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln
1 5 10 15
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1的LCDR2区
<400> 19
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1的LCDR3区
<400> 20
Ser Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 21
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1的VH区
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 22
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1的VL区
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 23
<211> 356
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1-CD3Z
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
130 135 140
Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
245 250 255
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
260 265 270
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
275 280 285
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
290 295 300
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
305 310 315 320
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
325 330 335
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
340 345 350
Leu Pro Pro Arg
355
<210> 24
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1-28z
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
130 135 140
Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
290 295 300
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
305 310 315 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
325 330 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
340 345 350
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
355 360 365
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
370 375 380
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
385 390 395 400
Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
420 425 430
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
435 440 445
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
450 455 460
Ala Leu Pro Pro Arg
465
<210> 25
<211> 466
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1-BBZ
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
130 135 140
Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
290 295 300
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
305 310 315 320
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
325 330 335
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
340 345 350
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
355 360 365
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
370 375 380
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
385 390 395 400
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
405 410 415
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
420 425 430
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
435 440 445
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
450 455 460
Pro Arg
465
<210> 26
<211> 511
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1-28BBZ
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
130 135 140
Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
290 295 300
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
305 310 315 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
325 330 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
340 345 350
Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
355 360 365
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
370 375 380
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln
435 440 445
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
450 455 460
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
465 470 475 480
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
485 490 495
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 27
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB2（GC33的scFv）氨基酸序列
<400> 27
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
130 135 140
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
145 150 155 160
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 28
<211> 469
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB2-28Z
<400> 28
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
130 135 140
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
145 150 155 160
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
290 295 300
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
305 310 315 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
325 330 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
340 345 350
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
355 360 365
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
370 375 380
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
385 390 395 400
Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
405 410 415
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
420 425 430
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
435 440 445
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
450 455 460
Ala Leu Pro Pro Arg
465
<210> 29
<211> 511
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB2-28BBZ
<400> 29
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
130 135 140
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
145 150 155 160
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
290 295 300
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
305 310 315 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
325 330 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
340 345 350
Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
355 360 365
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
370 375 380
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln
435 440 445
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
450 455 460
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
465 470 475 480
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
485 490 495
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 30
<211> 356
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1-CD3Z
<400> 30
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
130 135 140
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
145 150 155 160
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
245 250 255
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
260 265 270
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
275 280 285
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
290 295 300
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
305 310 315 320
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
325 330 335
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
340 345 350
Leu Pro Pro Arg
355
<210> 31
<211> 466
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1-BBZ
<400> 31
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
130 135 140
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
145 150 155 160
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
290 295 300
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
305 310 315 320
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
325 330 335
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
340 345 350
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys
355 360 365
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
370 375 380
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
385 390 395 400
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
405 410 415
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
420 425 430
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
435 440 445
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
450 455 460
Pro Arg
465
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 32
gcaggggaaa gaatagtaga ca 22
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 33
cggcctggcg gcgtggag 18
<210> 34
<211> 441
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1的VH区核苷酸序列
<400> 34
ggatcgatat ctgcggccta tctagccacc atgcgggtgc tgatcctgct gtggctgttt 60
accgccttcc ccggcttcct gagcgaggtg cagctggtgc agagcggcgc cgaggtgaag 120
aagcccggcg ccagcgtgaa ggtgagctgc aaggccagcg gctacacctt cagcgactac 180
gagatgcact gggtgcggca ggcccccggc cagggcctgg agtggatggg cgccatccac 240
cccggcagcg gcgacaccgc ctacaaccag cggttcaagg gccgggtgac catcaccgcc 300
gacaagagca ccagcaccgc ctacatggag ctgagcagcc tgcggagcga ggacaccgcc 360
gtgtactact gcgcccggtt ctacagctac gcctactggg gccagggcac cctggtgacc 420
gtgagcgccg ctagcaccaa a 441
<210> 35
<211> 429
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AB1的VL区核苷酸序列
<400> 35
ggatcgatat ccaccatgga catgatggtg ctggcccagt tcctggcctt cctgctgctg 60
tggttcccag gcgctagatg cgacatcgtg atgacccaga cccccctgag cctgcccgtg 120
acccccggcg agcccgccag catcagctgc cggagcagcc agagcctggt gcacagcaac 180
ggcaacacct acctgcagtg gtacctgcag aagcccggcc agagccccca gctgctgatc 240
tacaaggtga gcaaccggtt cagcggcgtg cccgaccggt tcagcggcag cggcagcggc 300
accgacttca ccctgaagat cagccgggtg gaggccgagg acgtgggcgt gtactactgc 360
agccagagca tctacgtgcc ctacaccttc ggccagggca ccaagctgga gatcaaacgt 420
acggtggct 429
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 36
ctccacgccg ccaggccgga ggtgcagctg gtgcag 36
<210> 37
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 37
gcggtgtcct cgctccgcag gctgctcagc tccatgtagg cggtg 45
<210> 38
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 38
gcggagcgag gacaccgccg tgtactactg cgcccggttc tacagctac 49
<210> 39
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 39
cggcgctggc gtcgtggtac gtttgatctc cagcttggtg 40
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 40
accacgacgc cagcgccg 18
<210> 41
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 41
aatccagagg ttgattgtcg acctagcgag ggggcagggc ctgc 44

Claims (27)

1.一种靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞表达有靶向GPC3的嵌合抗原受体和PD-L1阻断剂。
2.如权利要求1所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的PD-L1阻断剂为天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段、或抗PD-L1的抗体。
3.如权利要求2所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的PD-L1阻断剂为：
天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段；
天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段与抗体的Fc区段或者抗体的Fc区段的片段融合形成的融合肽；或者
天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段与抗体的Fc区段或者抗体的Fc区段的片段的突变体融合形成的融合肽。
4.如权利要求3所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述PD-L1阻断剂是天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段。
5.如权利要求3所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的抗体为IgG1、IgG2、IgG3、或者IgG4，优选IgG4。
6.如权利要求3-5任一所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的抗体的Fc区段的片段为CH3结构域。
7.如权利要求3所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的PD-L1阻断剂为天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段与hIgG4e1-Fc的融合肽；优选地，所述的天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段和所述的hIgG4e1-Fc之间经由linker连接；更优选地，所述的linker的编码序列如SEQ ID NO：3所示。
8.如权利要求3所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的PD-L1阻断剂为天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段与hIgG4e1-Fc的CH3的结构域形成的融合肽；优选地，所述的天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段和所述的CH3的结构域之间经由linker连接；更优选地，所述的liner的编码序列如SEQ ID NO：3所示。
9.如权利要求2-8任一所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段包括SEQID NO:2所示的核苷酸序列编码的PD-1胞外区。
10.如权利要求2-8任一所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1结合的天然或突变PD-1的片段的编码核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示的编码PD-1信号肽的核苷酸序列和SEQ ID NO:2所示的编码PD-1胞外区的核苷酸序列。
11.如权利要求7所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的hIgG4e1-Fc的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
12.如权利要求8所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的hIgG4e1-Fc的CH3结构域的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
13.如权利要求1所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括：靶向GPC3的胞外抗原结合区，跨膜区和胞内信号区。
14.如权利要求13所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的靶向GPC3的胞外抗原结合区具有SEQ ID NO：15、16、17所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及SEQ ID NO：18、19、20所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
15.如权利要求14所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的靶向GPC3的胞外抗原结合区含有SEQ ID NO：21所示的重链可变区和SEQ ID NO：22所示的轻链可变区。
16.如权利要求13所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的靶向GPC3的胞外抗原结合区具有SEQ ID NO：14或者SEQ ID NO：27所示的scFv序列。
17.如权利要求13所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的胞内信号区包括：CD3ζ，FcεRIγ，CD27，CD28，4-1BB，CD134，CD40的胞内信号区序列或Myd88，或其组合。
18.如权利要求13所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的跨膜区包括：CD8跨膜区或CD28跨膜区。
19.根据权利要求1-18任一所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：23、24、25、26、28、29、30、或31所示的氨基酸序列。
20.如权利要求1所述的靶向GPC3的免疫效应细胞，其特征在于，所述的免疫效应细胞包括：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞，Treg细胞。
21.一种核酸构建物，所述的核酸构建物包括顺序连接的：PD-L1阻断剂编码序列，嵌合抗原受体中靶向GPC3的胞外抗原结合区的编码序列，跨膜区和胞内信号区编码序列。
22.如权利要求21所述的核酸构建物，其特征在于，所述的PD-L1阻断剂编码序列和胞外抗原结合区编码序列之间以连接肽编码序列连接；和/或
所述的PD-L1阻断剂编码序列和胞外抗原结合区编码序列之间，还包括核糖体跳跃序列。
23.一种表达载体，其包含编码权利要求21或22所述的核酸构建物。
24.一种病毒，其特征在于，所述的病毒包含权利要求23所述的表达载体。
25.权利要求21所述的核酸构建物、或包含该核酸构建物的表达载体或病毒的用途，用于制备靶向肿瘤的靶向GPC3的免疫效应细胞。
26.权利要求1-20任一所述的靶向GPC3的免疫效应细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物组合物。
27.一种用于抑制肿瘤的药物组合物，其特征在于，其包括：权利要求1-20任一所述的嵌合受体修饰的免疫效应细胞。
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