CN109385374A - 一种微型细胞培养装置及其腔体内部环境控制方法 - Google Patents

一种微型细胞培养装置及其腔体内部环境控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可以放置在倒置显微镜上的微型细胞培养装置及其腔体内部环境的控制方法，所述微型细胞培养装置包括加热恒温单元、循环气体加湿单元、CO2循环控制单元和显示与控制单元；所述腔体内部环境的控制方法通过温度、湿度及CO2浓度控制步骤精确控制腔体的内环境；该微型细胞培养装置能够与显微镜等实验平台配合使用，打破了常规的细胞培养箱对后续实验条件的限制，应用范围广；该装置利用传感与PID控制技术，精确控制微腔内的温度、湿度以及CO2浓度，能够为细胞提供一个适合生长的孵育环境，并能高效稳定地维持所需外环境，保证细胞的增殖活力。

Description

一种微型细胞培养装置及其腔体内部环境控制方法
技术领域
本发明涉及细胞培养装置领域，尤其涉及一种微型细胞培养装置及其腔体内部环境控制方法。
背景技术
体外细胞培养技术是指在细胞离体后，用人工的方法提供细胞生长的营养要素，模拟细胞生长所需的外界环境，从而达到离体细胞连续健康生长、繁殖并维持其功能与形态结构特性的目标。在细胞培养的过程中，维持细胞活力首先要保持稳定的细胞外环境。目前在实验室中，通常用CO2细胞培养箱来为细胞培养提供一个稳定且高效的培养环境。
但是，常规的CO2细胞培养箱体积大，无法与其他实验仪器相结合联用；因此在现有的实验设计中，虽然CO2细胞培养箱可以在细胞培养中保证细胞的活力，但是在细胞研究的其他过程中，往往不能为细胞的孵育生长提供一个稳定高效的细胞外环境。所以现有的细胞培养装置需要将细胞培养与其他后续实验进行分离，由此带来一系列的问题，如：细胞培养与细胞操作分离、无法保证细胞活力、细菌感染高风险、重复样本、观察窗口窄、细胞对照不一致等。这些弊端在现有实验条件中是无法避免的。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种可以放置在倒置显微镜上的微型细胞培养装置及其腔体内部环境的控制方法，使细胞培养装置能够与显微镜等实验平台配合使用，并精确控制微腔内的温度、湿度以及CO2浓度，维持高效稳定的细胞培养外环境。
技术方案：为实现以上目的，本发明公开了一种微型细胞培养装置，包括加热恒温单元、循环气体加湿单元、CO2循环控制单元和显示与控制单元；加热恒温单元包括测温模块、加热模块和恒温腔；循环气体加湿单元包括测湿模块和气体循环加湿模块；气体循环加湿模块包括水槽、微型水泵、接管、风道、微型风机，微型水泵的进水端与水槽相连，出水端与接管相连；接管与风道相连，微型风机设置在风道进风口处，风道出风口与恒温腔相连通；CO2循环控制单元包括CO2传感模块和CO2循环气路模块；CO2循环气路模块包括CO2源、电磁气阀、滤膜、CO2输气管；CO2源与CO2输气管的入口端相连，电磁气阀和滤膜依次设置在CO2输气管上，CO2输气管的出口端与风道进风口相连；显示与控制单元包括显示模块、控制模块；控制模块包括单片机系统、H桥驱动电路、效能器以及直流电源；显示与控制单元分别与加热恒温单元、循环气体加湿单元及CO2循环控制单元电连接，用于接收温度、湿度及CO2浓度信号，并发出指令，控制加热模块、气体循环加湿模块及CO2循环气路模块的工作。
优选地，恒温腔的主体采用金属一体式制成，主体外部包裹有隔热层，隔热层的内、外表面均设有辐射反射层。
优选地，恒温腔的主体材料为铝合金、不锈钢、黄铜或紫铜；隔热层材料为隔热硅胶、隔热泡棉或隔热板；辐射反射层为铝箔纤维胶带；恒温腔的形状为长方体型、圆柱型或壶型。
优选地，所述微型细胞培养装置适用于共聚焦培养皿、6孔板、8孔板、24孔板、12孔板或96孔板；所述培养装置还包括上盖板，上盖板与所使用的实验平台相配合；所述实验平台为超净操作台、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、电化学工作站或扫描电化学显微镜。
本发明还公开了上述微型细胞培养装置的腔体内部环境控制方法，温度控制步骤包括：设定目标温度T0时，装置整体可允许的温度偏差为ΔT；当温度小于T0-ΔT时，控制TEC制冷片执行加热模式，全功率运行；当温度高于T0-ΔT并小于T0时，控制TEC制冷片每2s加热0.5s；当温度高于T0并小于T0+ΔT时，TEC制冷片的加热功率为0；当温度高于T0+ΔT时，控制TEC制冷片执行制冷模式，全功率运行。
湿度控制步骤包括：设定目标湿度，每30s激活一次控制程序；控制程序激活后，系统首先检测当前湿度值，并判断当前的湿度值是否达到了设定值，若当前湿度低于目标湿度，则控制水泵启动，将水槽中的水泵入循环气路中，水泵的运行持续时间为0.1s；若当前湿度不低于目标湿度，则保持水泵处于关闭状态。
CO2控制步骤包括：设定CO2浓度的上限值和下限值；检测并判断当前的CO2浓度值，如果CO2浓度低于浓度下限值，则使通气控制开关处于常开状态，将CO2一直缓慢的充入到循环气路中；如果CO2浓度处于浓度下限值与上限值之间，系统先将通气开关恢复成常闭状态，每隔10s将通气开关打开一次，将CO2通入，开关打开的持续时间为0.5s；如果CO2浓度值高于浓度上限值，则保持通气开关为常闭状态；在执行上述操作时，通入CO2的流量控制在2.5ml/min。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：该细胞培养装置体积小，可与显微镜等实验平台配合使用，打破了常规的细胞培养箱对后续实验条件的限制，应用范围广；该细胞培养装置利用传感与PID控制技术，精确控制微腔内的温度、湿度以及CO2浓度，能够为细胞提供一个适合生长的孵育环境，并能高效稳定地维持所需外环境，保证细胞的增殖活力，降低了细菌感染风险，并可减少重复样本数量、避免出现细胞对照不一致现象。
附图说明
图1为本发明微型细胞培养装置的操作流程图；
图2为本发明恒温腔结构示意图；
图3为本发明循环气体加湿模块结构示意图；
图4为本发明控制与显示模块逻辑图；
图5(a)为本发明微型细胞培养装置运行4h的温度数据；
图5(b)为本发明微型细胞培养装置运行4h的湿度数据；
图5(c)为本发明微型细胞培养装置运行4h的CO2浓度数据；
图6为利用不同装置进行细胞培养得到的细胞存活率图；
图7为微型细胞培养装置与共聚焦荧光显微镜联用所得的细胞荧光图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明所述的微型细胞培养装置包括加热恒温单元、循环气体加湿单元、CO2循环控制单元和显示与控制单元。
加热恒温单元包括三个子模块：测温模块、加热模块和恒温腔。测温模块采用DS18B20作为测温元器件；加热模块中，温度传感器采集周围的环境温度，通过数模转换器将温度信息输入到单片机中，当环境温度小于设计的温度时，通过数字PID控制，采用脉宽调制输出的方式，向H桥电路输出脉冲信号。同时，H桥接收到脉冲信号，耦合恒流电源的DC，将电压按照脉冲信号的频率输入到TEC加热片上。通过加热片对整个培养微腔腔体进行加热。
如图2所示，恒温腔1的主体采用金属一体式制成，可选用铝合金、不锈钢、黄铜或紫铜材料；一体式金属材料作为培养微腔腔体的导热主体，可以迅速地将发热源的热量传导发散开来，以营造腔体内部的温度均匀上升。但由于金属的比热通常较小，储热能力差，很容易出现散失的热量远远超过发热片产生的热量的现象，这不仅会造成加热模块长时间的满负荷运载，也会造成腔内热量分布不均匀的现象。因此本发明采用隔热硅胶作为一体式铝合金外部的隔热层2包裹材料，并用铝箔纤维胶带作为辐射反射层3，对隔热硅胶进行固定的同时，更好地将热量反射回一体式的金属腔体内；恒温腔1的底部设有TEC加热片4。
如图3所示，循环气体加湿单元包括测湿模块和气体循环加湿模块11。测湿模块采用DHT11作为湿度传感器；气体循环加湿模块11包括水槽9、微型水泵10、接管、风道、微型风机5，微型水泵10的进水端与水槽9相连，出水端与接管相连；接管与风道相连，微型风机设置在风道进风口处，风道出风口与微型培养箱相连。
气体循环加湿模块采用循环气体加湿的方法来保证培养微腔腔体内部的湿度要求；同时还可促进腔体内气体的循环流动，以使腔内环境快速达到稳定均一。气体循环加湿模块利用微型水泵将超纯水从水槽中泵出，并通过接管将水接入到气体循环加湿模块的出风口，利用强力的风压将从水泵中的水滴吹散并通过风道带入到腔体中，从而增加整个体系中的含水量，提高腔体内的湿度。同时，高速的循环气流可以带动整个腔体内部气流的流动，杜绝了热量、湿度以及CO2浓度在腔体内分布不均一的现象。
CO2循环控制单元包括CO2传感模块和CO2循环气路模块。CO2传感模块采用高性能CO2传感器MinIR作为CO2的传感器。CO2循环气路模块包括CO2源8、电磁气阀7、滤膜6、CO2输气管；CO2源与CO2输气管的入口相连，电磁气阀和滤膜依次设置在CO2输气管上，CO2输气管的出口端与风道进风口相连；当培养微腔内CO2浓度低于设定值50000ppm(5％)的时候，电磁气阀打开，CO2经过空气滤膜进入到气体循环系统中。高速的循环气流可以使得高纯的CO2和循环气体充分混合，通过腔体内部的出风口处高速流动气体的压强，CO2得以快速扩散到整个腔体内部。和循环加湿模块不同，由于CO2气体是唯一的外部注入气体，所以，在气体通入到培养微腔腔体之前，要用HEPA空气滤膜将气体中的微小颗粒过滤干净，以保证腔体内空气的洁净以及整体环境的无菌性。
显示与控制模块包括显示模块及控制模块。显示模块分为装置显示以及串口显示两类。装置显示可以显示细胞培养微腔内的温度、湿度以及CO2的浓度信息。而串口显示可以接收数据，以便于将温度、湿度以及CO2浓度进行统计分析。
如图4所示，控制模块硬件包括单片机系统、H桥驱动电路、效能器以及直流电源。工作时，传感器所测得的培养微腔内部的温度、湿度和CO2浓度信息，通过数模转换器传送给单片机系统；单片机系统接收到传感器信息后，判断是否需要激活效能器的使用。
所述微型细胞培养装置适用范围广，能够适用于共聚焦培养皿、6孔板、8孔板、24孔板、12孔板或96孔板；该培养装置还包括上盖板，上盖板与所使用的实验平台相配合；所述实验平台包括但不限于超净操作台、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、电化学工作站或扫描电化学显微镜。
本发明还公开了对于上述微型细胞培养装置的腔体内部环境的控制方法，其具体控制步骤为：
温度控制：设定目标温度T0时，装置整体可允许的温度偏差为ΔT；在本实施例中，设定目标温度为37℃，温度偏差ΔT为0.5℃；则当温度小于36.5℃时，控制TEC制冷片执行加热模式，全功率运行；当温度大于36.5℃并小于37℃时，控制TEC制冷片每2s加热0.5s；当温度大于37℃并小于37.5℃时，TEC制冷片的加热功率为0；当温度高于37.5℃时，控制TEC制冷片执行制冷模式，全功率运行；
湿度控制：设定目标湿度，每30s激活一次控制程序；本实施例中，目标湿度值设定为95％RH；控制程序激活后，系统首先检测当前湿度值，并判断当前的湿度值是否达到了设定值，若当前湿度低于目标湿度，则控制水泵启动，将水槽中的水泵入循环气路中，水泵的运行持续时间为0.1s；若当前湿度不低于目标湿度，则保持水泵处于关闭状态；
CO2浓度控制：设定CO2浓度的上限值和下限值，例如上限值设定为50000ppm，下限值设定为30000ppm；检测并判断当前的CO2浓度值，如果CO2浓度低于30000ppm，则使通气控制开关处于常开状态，将CO2一直缓慢的充入到循环气路中；如果CO2浓度处于30000ppm-50000ppm之间，系统先将通气开关恢复成常闭状态，每隔10s将通气开关打开一次，将CO2通入，开关打开的持续时间为0.5s；如果CO2浓度值高于50000ppm，则保持通气开关为常闭状态；在执行上述操作时，通入CO2的流量控制在2.5ml/min。
本发明通过以下两组实验结果数据来证明上述实施方式中微型细胞培养装置及其腔体内部环境的控制方法的技术效果。
实验1：利用微型细胞培养装置进行的细胞增殖与活力实验
MTT溶液制备：将0.5g黄色的噻唑蓝溶于100ml的PBS(pH＝7.3)中，制备成5mg/ml的MTT溶液，用滤膜过滤后用锡纸包裹起来避光保存备用。
测试细胞：L02(正常细胞)、HepG2(肝癌细胞)、U87(神经胶质瘤细胞)
实验步骤：
a.将三种测试细胞用胰酶消化悬浮后，用含有10％胎牛血清的DMEM(高糖)培养基分散，通过细胞计数板计数，按照每个孔5000个细胞的量接种到96孔板中，每个孔中200μ1的培养基。
b.制作三个96孔板样本，分别置于实验室用于培养细胞的Thermo培养箱、本发明所述的微型细胞培养装置以及室外环境，以比较在不同情况下，细胞的存活能力。
c.孵育24h后，终止培养，向96孔板(每孔)中滴加20μl的MTT溶液。继续培养4h；
d.吸取除去孔中的培养基后，每孔加入150μl的DMSO(二甲亚砜)，并在摇床上振荡10分钟，使得孔内的结晶物质完全溶解。用酶联免疫检测仪检测各孔中的吸光度。
e.收集的数据，以Thermo培养箱孵育的细胞作为Control组，进行归一化处理。
图6所示是利用不同装置进行细胞培养24h后的细胞存活率的结果。将Thermo标准培养箱所孵育的细胞设置为control组，归一化为100％，我们发现，无论是HepG2、L02、还是U87细胞，和Thermo标准培养箱相比，细胞活率都超过95％。其中，HepG2的活率为95.28％，标准差为0.037；U87的活率略高于control对照组，为101.8％，标准差为0.022；L02活率为96.13％，标准差为0.041。而置于室外环境的细胞活率均不足50％。因为培养时间为24h，恰好为一个细胞周期，因此在这个细胞周期内，外界环境不能为细胞的一个稳定的增殖环境。由此可知，本发明公开的微型细胞培养装置可以为细胞提供一个适合生长的孵育环境。
实验2：HepG2细胞的追踪成像
取对数生长期的肿瘤细胞HepG2接种于共聚焦培养皿中，利用细胞计数板使得每个皿接种10000～15000个细胞，加入低浓度的HAuCl4与细胞共孵育24h后。将该共聚焦培养皿置于本发明所述的微型细胞培养装置中培养，并结合共聚焦荧光显微镜进行追踪成像。针对其中一个细胞进行长时间观察，得到如图7所示的处于分裂期的细胞荧光图。该荧光图表明，该微型细胞培养装置可以为细胞提供稳定高效的细胞培养外环境，细胞的增殖活力可以得到保证。

Claims (10)

1.一种微型细胞培养装置，包括加热恒温单元、循环气体加湿单元、CO2循环控制单元和显示与控制单元；其特征在于：加热恒温单元包括测温模块、加热模块和恒温腔；循环气体加湿单元包括测湿模块和气体循环加湿模块；气体循环加湿模块包括水槽、微型水泵、接管、风道、微型风机，微型水泵的进水端与水槽相连，出水端与接管相连；接管与风道相连，微型风机设置在风道进风口处，风道出风口与恒温腔相连通；CO2循环控制单元包括CO2传感模块和CO2循环气路模块；CO2循环气路模块包括CO2源、电磁气阀、滤膜、CO2输气管；CO2源与CO2输气管的入口端相连，电磁气阀和滤膜依次设置在CO2输气管上，CO2输气管的出口端与风道进风口相连；显示与控制单元包括显示模块、控制模块；显示与控制单元分别与加热恒温单元、循环气体加湿单元及CO2循环控制单元电连接，用于接收温度、湿度及CO2浓度信号，并发出指令，控制加热模块、气体循环加湿模块及CO2循环气路模块的工作。
2.根据权利要求1所述的微型细胞培养装置，其特征在于：控制模块包括单片机系统、H桥驱动电路、效能器。
3.根据权利要求1所述的微型细胞培养装置，其特征在于：恒温腔的主体采用金属一体式制成，主体外部包裹有隔热层。
4.根据权利要求3所述的微型细胞培养装置，其特征在于：隔热层的内、外表面均设有辐射反射层。
5.根据权利要求3所述的微型细胞培养装置，其特征在于：恒温腔的主体材料为铝合金、不锈钢、黄铜或紫铜；隔热层材料为隔热硅胶、隔热泡棉或隔热板。
6.根据权利要求4所述的微型细胞培养装置，其特征在于：辐射反射层为铝箔纤维胶带。
7.根据权利要求1所述的微型细胞培养装置，其特征在于：恒温腔的形状为长方体型、圆柱型或壶型。
8.根据权利要求1所述的微型细胞培养装置，其特征在于：所述微型细胞培养装置适用于共聚焦培养皿、6孔板、8孔板、12孔板、24孔板或96孔板。
9.根据权利要求1所述的微型细胞培养装置，其特征在于：所述培养装置还包括上盖板，上盖板与所使用的实验平台相配合；所述实验平台为超净操作台、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、电化学工作站或扫描电化学显微镜。
10.一种如权利要求1-9之一所述的微型细胞培养装置的腔体内部环境控制方法，其特征在于：
温度控制步骤包括：设定目标温度T0时，装置整体可允许的温度偏差为ΔT；当温度小于T0-ΔT时，控制TEC制冷片执行加热模式，全功率运行；当温度高于T0-ΔT并小于T0时，控制TEC制冷片每2s加热0.5s；当温度高于T0并小于T0+ΔT时，TEC制冷片的加热功率为0；当温度高于T0+ΔT时，控制TEC制冷片执行制冷模式，全功率运行；
湿度控制步骤包括：设定目标湿度，每30s激活一次控制程序；控制程序激活后，系统首先检测当前湿度值，并判断当前的湿度值是否达到了设定值，若当前湿度低于目标湿度，则控制水泵启动，将水槽中的水泵入循环气路中，水泵的运行持续时间为0.1s；若当前湿度不低于目标湿度，则保持水泵处于关闭状态；
CO2浓度控制步骤包括：设定CO2浓度的上限值和下限值；检测并判断当前的CO2浓度值，如果CO2浓度低于浓度下限值，则使通气控制开关处于常开状态，将CO2一直缓慢的充入到循环气路中；如果CO2浓度处于浓度下限值与上限值之间，系统先将通气开关恢复成常闭状态，每隔10s将通气开关打开一次，将CO2通入，开关打开的持续时间为0.5s；如果CO2浓度值高于浓度上限值，则保持通气开关为常闭状态；在执行上述操作时，通入CO2的流量控制在2.5ml/min。
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