CN109384760B - 含氮芥基黄酮类衍生物、其制备方法及抗肿瘤方向应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类含氮芥基黄酮类衍生物的制备方法及它们在抗肿瘤活性研究中的用途。如式Ⅰ和式Ⅱ所示，其中n为1,2,3。目标化合物均未见文献报道。此类化合物可抑制多种肿瘤细胞的生长活性。实验表明，目标化合物对测试的7种癌细胞都显示出了较好的抗肿瘤活性，与现有的抗肿瘤药物5‑氟尿嘧啶相比，本发明的目标化合物对多种肿瘤细胞的生长抑制活性，都明显高于它；其中目标化合物Ⅱ₂抗肿瘤效果最好，对于Hela、DU145、PC‑3、MCF‑7、SH‑SY5Y细胞而言，它们的IC₅₀值均在10μM以下，与抗肿瘤药物顺铂相比，都在同一个数量级。进一步研究发现，目标化合物Ⅱ₂可通过将HeLa细胞周期阻滞在G2/M期诱导细胞凋亡，目标化合物Ⅱ₂有望成为新型的抗肿瘤药物。

Description

含氮芥基黄酮类衍生物、其制备方法及抗肿瘤方向应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，涉及一类含氮芥基黄酮类衍生物、其制备方法及在抗肿瘤细胞增殖中的应用。

背景技术

黄酮类化合物是一类广泛存在于豆科植物中的天然产物，因具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗骨质疏松、类雌激素等多种生理活性而受到重视。黄酮类化合物种类繁多，根据化合物中间三个碳原子的连接情况、苯环的相对位置，可分为异黄酮类、黄酮类、黄酮醇类、查尔酮类、花青素类等。染料木素作为一种具有多种生物活性的异黄酮，呈现出弱雌激素样作用，对于雌激素依赖性肿瘤细胞的增殖具有一定的抑制作用。而白杨素是一种低毒天然的黄酮，具有可以诱导肿瘤细胞凋亡，抑制多种肿瘤细胞生长的作用。

氮芥类化合物是一种重要的抗肿瘤药物，已有多种投入临床使用，如美法仑、苯丁酸氮芥等。氮芥类抗肿瘤药物往往存在选择性低，对正常细胞同样存在高毒性的缺点。氮芥类抗肿瘤药物，从化合物的结构上可分为烷基化部分和载体部分，载体部分影响着氮芥类药物的毒性大小、选择性以及生物利用度等，因而对于载体部分的选择和修饰一直是科学研究的热点之一。伴随着肿瘤发病率的上升和耐药性的产生，人们迫切地需要开发新的抗肿瘤药物。因此，对氮芥类药物的结构修饰性的改性研究，显现出了重要的科学意义。

虽然黄酮类化合物生理活性广泛，但是均较弱，且脂溶性和水溶性较差，生物利用度低。本发明采用染料木素和白杨素作为原料，烷基介导氮芥药效基团，设计并合成了一系列新型的，未见文献报道的黄酮类衍生物，测试了它们对多种肿瘤细胞的细胞生长抑制率，并进行了细胞形态学、细胞周期、细胞凋亡实验，进一步的研究抗肿瘤机制。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一类具有抗肿瘤活性的含氮芥基黄酮类衍生物、其制备方法及在抗肿瘤细胞增殖中的应用。

本发明提供了一种含氮芥基黄酮类衍生物，如式Ⅰ和Ⅱ所示。

其中n为1,2,3。结构式如下所示：

本发明还提供了一种含氮芥基黄酮类衍生物的制备方法，包括：

S1)将染料木素或白杨素与式Ⅲ所示的卤代烷烃在碱性条件下反应，得到式Ⅳ和式Ⅴ所示的化合物；

S2)将式Ⅳ和式Ⅴ所示的化合物与二乙醇胺反应，得到式Ⅵ和Ⅶ所示的化合物；

S3)将式Ⅵ和Ⅶ所示的化合物与氯化亚砜反应，得到式Ⅰ和Ⅱ所示的含氮芥基黄酮类衍生物；

其中，X为卤素；n为1,2,3。

本发明还提供了一种上述含氮芥基黄酮类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途，对于多种肿瘤细胞的体外增殖具有抑制作用。

附图说明

图1为本发明合成化合物的结构通式；

图2为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和顺铂在不同浓度下对HeLa细胞的生长抑制率评价图；

图3为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和顺铂在不同浓度下对HepG2细胞的生长抑制率评价图；

图4为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和顺铂在不同浓度下对A549细胞的生长抑制率评价图；

图5为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和顺铂在不同浓度下对SH-SY5Y细胞的生长抑制率评价图；

图6为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和顺铂在不同浓度下对DU145细胞的生长抑制率评价图；

图7为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和顺铂在不同浓度下对MCF-7细胞的生长抑制率评价图；

图8为本发明涉及化合物与阳性化合物5-氟尿嘧啶和顺铂在不同浓度下对PC-3细胞的生长抑制率评价图。

图9为本发明实施例8中细胞形态学实验的实验结果图。

图10为本发明实施例9中细胞凋亡实验的实验结果图。

图11为本发明实施例10中细胞周期实验的实验结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明进行更为具体清晰的说明，所描述的实施例仅为解释性的，并非全部的实施例，并不意味着会限制本发明的范围。

本发明提供了一种含氮芥基黄酮类衍生物，其特征在于，如式Ⅰ和Ⅱ所示：

其中n为1,2,3。

本发明还提供了一种含氮芥基黄酮类衍生物的制备方法，包括：

S1)将染料木素或白杨素与式Ⅲ所示的卤代烷烃在碱性条件下反应，得到式Ⅳ和式Ⅴ所示的化合物；

S2)将式Ⅳ和式Ⅴ所示的化合物与二乙醇胺反应，得到式Ⅵ和Ⅶ所示的化合物；

S3)将式Ⅵ和Ⅶ所示的化合物与氯化亚砜反应，得到式Ⅰ和Ⅱ所示的含氮芥基黄酮类衍生物；

其中，X为卤素；n为1,2,3。

将染料木素与式Ⅲ所示的卤代烷烃在碱性条件下反应；所述染料木素与式Ⅲ所示的卤代烷烃的摩尔比优选为1：(1～20)，更优选为1：(5～15)，再优选为1:10；该反应优选在碱性条件下进行；所述碱性条件优选加入碱性化合物提供；所述碱性化合物为本领域技术人员熟知的碱性化合物即可，并无特殊的限制，本发明中优选为碱金属碳酸盐，更优选为碳酸钾；所述碱性化合物与染料木素的摩尔比优选为(1～3)：1，更优选为2:1；该反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂为本领域技术人员熟知的有机溶剂，如二甲基亚砜、1,4-二氧六环、乙醇、甲醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺等不阻碍反应的溶剂，这些溶剂也可以按照适当的比例混合使用，本发明中优选为丙酮；该反应的反应温度通常可以在室温～回流温度下进行4～24小时，也可以在微波下反应，本发明中温度优选为回流下反应，时间优选为8小时。

将白杨素与式Ⅲ所示的卤代烷烃在碱性条件下反应；所述白杨素与式Ⅲ所示的卤代烷烃的摩尔比优选为1：(1～20)，更优选为1：(5～15)，再优选为1:10；该反应优选在碱性条件下进行；所述碱性条件优选加入碱性化合物提供；所述碱性化合物为本领域技术人员熟知的碱性化合物即可，并无特殊的限制，本发明中优选为碱金属碳酸盐，更优选为碳酸钾；所述碱性化合物与白杨素的摩尔比优选为(2～6)：1，更优选为4:1；该反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂为本领域技术人员熟知的有机溶剂，如二甲基亚砜、1,4-二氧六环、乙醇、甲醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺等不阻碍反应的溶剂，这些溶剂也可以按照适当的比例混合使用，本发明中优选为丙酮；该反应的反应温度通常可以在室温～回流温度下进行4～24小时，也可以在微波下反应，本发明中温度优选为回流下反应，时间优选为8小时。

染料木素与式Ⅲ所示的卤代烷烃的反应结束后，优选通过旋蒸除去溶剂，用石油醚洗涤除去未反应的卤代烷烃，水洗除去碳酸盐，柱层析后得到产物；所述柱层析所用的淋洗剂优选为甲醇和二氯甲烷的混合溶液；所述甲醇与二氯甲烷的体积比优选为1:(40～80)，再优选为1:60。

白杨素与式Ⅲ所示的卤代烷烃的反应结束后，优选通过旋蒸除去溶剂，用石油醚洗涤除去未反应的卤代烷烃，水洗除去碳酸盐，柱层析后得到产物；所述柱层析所用的淋洗剂优选为二氯甲烷。

将所述式Ⅳ和式Ⅴ所示的化合物与二乙醇胺反应；所述式Ⅳ和式Ⅴ所示的化合物与二乙醇胺的摩尔比优选为1：(1～20)，更优选为1:10；该反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂为本领域技术人员熟知的有机溶剂，如二甲基亚砜、1,4-二氧六环、乙醇、甲醇、乙腈、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺等不阻碍反应的溶剂，这些溶剂也可以按照适当的比例混合使用，本发明中优选为乙腈；该反应的反应温度通常可以在室温～回流温度下进行12～72小时，也可以在微波下反应，本发明中温度优选为回流下反应，时间优选为48小时。

反应结束后，优选室温下冷却结晶，减压抽滤，水洗烘干后得到产物。

将式Ⅵ和Ⅶ所示的化合物与氯化亚砜反应；所述式Ⅵ和Ⅶ所示的化合物与氯化亚砜的摩尔比优选为1：(1～16)，更优选为1:8；该反应优选在有机溶剂中进行；所述有机溶剂为本领域技术人员熟知的有机溶剂，如二甲基亚砜、1,4-二氧六环、乙醇、甲醇、二氯甲烷、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺等不阻碍反应的溶剂，这些溶剂也可以按照适当的比例混合使用，本发明中优选为二氯甲烷；该反应的反应温度通常可以在室温～回流温度下进行12～72小时，也可以在微波下反应，本发明中温度优选为回流下反应，时间优选为48小时。

反应结束后，优选通过旋蒸除去溶剂，二氯甲烷重结晶得到产物。

本发明还提供了一种上述含氮芥基黄酮类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途，对于多种肿瘤细胞的体外增殖具有抑制作用。

本发明目标化合物的抗肿瘤活性，采用MTT比色法，研究其在不同浓度下，抑制肿瘤细胞增殖的效果作为评价手段之一，用肿瘤细胞的生长抑制率予以表现。活细胞的线粒体中含有琥珀酸脱氢酶，它能够将外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，而死细胞无此过程。在一定细胞数范围内，甲瓒的量与活细胞数目成正比。用DMSO溶解细胞中的甲瓒，利用酶标仪测定其在490nm波长处的吸光度，可间接反映样品对肿瘤细胞增殖的抑制情况。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的含氮芥基黄酮类衍生物、其制备方法及在抗肿瘤细胞增殖中的应用进行详细阐述。

以下实施例中所用试剂均为市售。

本发明实施例制备流程如下：

其中，a为n＝1,b为n＝2，c为n＝3时。

实施例1

目标化合物Ⅰ₁的制备

步骤1：

将染料木素(2.7g,10mmol)、无水K₂CO₃(2.76g,20mmol)、10mL 1,2-二溴乙烷和150mL丙酮加入250mL圆底烧瓶，加热搅拌回流约8h。然后停止反应，旋蒸除去丙酮，得到的混合物加入石油醚洗涤除去1,2-二溴乙烷，减压抽滤，固液分离，收集固体。用大量蒸馏水洗涤除去碳酸钾，烘干。粗产品采用柱层析的方法纯化(洗脱液组成为：CH₂Cl₂：CH₃OH＝60:1)，最终得到黄色固体2a，产率70％。¹H NMR(400MHz,DMSO-D6)δ12.96(s,1H),9.58(s,1H),8.41(s,1H),7.38(d,J＝8.6Hz,2H),6.82(d,J＝8.7Hz,2H),6.69(d,J＝2.3Hz,1H),6.43(d,J＝2.3Hz,1H),4.47–4.43(m,2H),3.86–3.78(m,2H).

步骤2：

将上述制备的中间产物2a(0.377g,1mmol)，二乙醇胺(1.05g,10mmol)和50mL乙腈加入100mL圆底烧瓶，加热搅拌回流约48h。停止反应，室温下逐渐冷却，析出浅黄色晶体。减压抽滤，并用大量蒸馏水洗涤，烘干，得到浅黄色固体3a，产率88％。¹H NMR(400MHz,METHANOL-D4)δ8.08(s,1H),7.37(d,J＝8.5Hz,2H),6.84(d,J＝8.5Hz,2H),6.51(d,J＝1.9Hz,1H),6.35(d,J＝2.0Hz,1H),4.15(t,J＝5.6Hz,2H),3.63(t,J＝5.7Hz,4H),3.01(t,J＝5.6Hz,2H),2.77(t,J＝5.7Hz,4H).MS(ESI):Calcd.C₂₁H₂₃NO₇,[M+H⁺]m/z:402.15,found:402.1180.

步骤3：

将上述制备的产物3a(0.401g,1mmol)，SOCl₂(0.58mL,8mmol)和50mL二氯甲烷投入到100mL圆底烧瓶中，加热搅拌回流约48h。停止反应，旋蒸除去溶剂。用二氯甲烷重结晶得到浅黄色固体Ⅰ₁。产率92％。¹H NMR(600MHz,METHANOL-D4)δ8.20(s,1H),7.46–7.42(m,2H),6.92–6.88(m,2H),6.68(d,J＝2.3Hz,1H),6.51(d,J＝2.3Hz,1H),4.60–4.54(m,2H),4.11(t,J＝6.2Hz,4H),3.94–3.89(m,2H),3.86(t,J＝6.2Hz,4H).MS(ESI):Calcd.C₂₁H₂₁Cl₂NO₅,[M+H⁺]m/z:438.08,found:438.0252.

实施例2

目标化合物Ⅰ₂的制备

步骤1：

将染料木素(2.7g,10mmol)、无水K₂CO₃(2.76g,20mmol)、10mL 1,3-二溴丙烷和150mL丙酮加入250mL圆底烧瓶，其余步骤同实施例1中步骤1。得到黄色固体2b，产率69％。¹H NMR(600MHz,DMSO-D6)δ9.59(s,1H),8.41(s,1H),7.38(d,J＝8.6Hz,2H),6.81(d,J＝8.6Hz,2H),6.68(d,J＝2.2Hz,1H),6.42(d,J＝2.2Hz,1H),4.20(t,J＝6.0Hz,2H),3.66(t,J＝6.6Hz,2H),2.26(p,J＝6.3Hz,2H).

步骤2：

将上述制备的中间产物2b(0.391g,1mmol)，二乙醇胺(1.05g,10mmol)，和50mL乙腈加入100mL圆底烧瓶，其余步骤同实施例1中步骤2。得到浅黄色固体3b，产率85％。¹H NMR(600MHz,METHANOL-D4)δ8.09(s,1H),7.38(d,J＝8.4Hz,2H),6.85(d,J＝8.5Hz,2H),6.52(s,1H),6.35(s,1H),4.14(t,J＝6.0Hz,2H),3.62(t,J＝5.7Hz,4H),2.74(t,J＝7.0Hz,2H),2.68(t,J＝5.7Hz,4H),2.02–1.90(m,2H).MS(ESI):Calcd.C₂₂H₂₅NO₇,[M+H⁺]m/z:416.16,found:416.0802.

步骤3：

将上述制备的产物3b(0.415g,1mmol)，SOCl₂(0.58mL,8mmol)和50mL二氯甲烷投入到100mL圆底烧瓶中，其余步骤同实施例1中步骤3。得到浅灰色固体Ⅰ₂，产率91％。¹H NMR(600MHz,METHANOL-D4)δ8.15(s,1H),7.41(d,J＝8.6Hz,2H),6.88(d,J＝8.6Hz,2H),6.58(d,J＝2.1Hz,1H),6.41(d,J＝2.2Hz,1H),4.24(t,J＝5.6Hz,2H),4.07(t,J＝6.1Hz,4H),3.78(t,J＝6.1Hz,4H),3.65–3.55(m,2H),2.36–2.30(m,2H).MS(ESI):Calcd.C₂₂H₂₃Cl₂NO₅,[M+H⁺]m/z:452.10,found:452.0548.

实施例3

目标化合物Ⅰ₃的制备

步骤1：

将染料木素(2.7g,10mmol)、无水K₂CO₃(2.76g,20mmol)、10mL 1,4-二溴丁烷和150mL丙酮加入250mL圆底烧瓶，其余步骤同实施例1中步骤1。得到黄色固体2c，产率75％。¹H NMR(400MHz,DMSO-D6)δ12.95(s,1H),9.59(s,1H),8.41(s,1H),7.39(d,J＝8.7Hz,2H),6.82(d,J＝8.7Hz,2H),6.66(d,J＝2.3Hz,1H),6.41(d,J＝2.3Hz,1H),4.14(t,J＝6.3Hz,2H),3.62(t,J＝6.6Hz,2H),2.01–1.92(m,2H),1.90–1.81(m,2H).

步骤2：

将上述制备的中间产物2c(0.405g,1mmol)，二乙醇胺(1.05g,10mmol)，和50mL乙腈加入100mL圆底烧瓶，其余步骤同实施例1中步骤2。得到浅黄色固体3c，产率86％。¹H NMR(400MHz,METHANOL-D4)δ8.08(s,1H),7.40–7.35(m,2H),6.87–6.82(m,2H),6.50(d,J＝2.4Hz,1H),6.34(d,J＝2.0Hz,1H),4.07(t,J＝6.4Hz,2H),3.62(t,J＝6.0Hz,4H),2.70–2.60(m,6H),1.86–1.77(m,2H),1.71–1.62(m,2H).MS(ESI):Calcd.C₂₃H₂₇NO₇,[M+H⁺]m/z:430.18,found:430.3159.

步骤3：

将上述制备的产物3c(0.429g,1mmol)，SOCl₂(0.58mL,8mmol)和50mL二氯甲烷投入到100mL圆底烧瓶中，其余步骤同实施例1中步骤3。得到浅灰色固体Ⅰ₃，产率87％。¹H NMR(600MHz,METHANOL-D4)δ8.12(s,1H),7.46–7.27(m,2H),6.91–6.76(m,2H),6.55(d,J＝2.2Hz,1H),6.38(d,J＝2.2Hz,1H),4.16(t,J＝5.8Hz,2H),4.01(t,J＝6.1Hz,4H),3.72(t,J＝6.0Hz,4H),3.53–3.34(m,2H),2.02–1.95(m,2H),1.95–1.89(m,2H).MS(ESI):Calcd.C₂₃H₂₅Cl₂NO₅,[M+H⁺]m/z:466.11,found:466.25.

实施例4

目标化合物Ⅱ₁的制备

步骤1：

将白杨素(2.54g,10mmol)、无水K₂CO₃(5.52g,40mmol)、10mL 1,2-二溴乙烷和150mL丙酮加入250mL圆底烧瓶，加热搅拌回流约8h。然后停止反应，旋蒸除去丙酮，得到的混合物加入石油醚洗涤除去1,2-二溴乙烷，减压抽滤，固液分离，收集固体。用大量蒸馏水洗涤除去碳酸钾，烘干。粗产品采用柱层析的方法纯化(洗脱液为：CH₂Cl₂)，最终得到黄色固体5a，产率67％。¹H NMR(600MHz,CHLOROFORM-D)δ12.74(s,1H),7.91–7.86(m,2H),7.63–7.45(m,3H),6.68(s,1H),6.53(d,J＝2.2Hz,1H),6.38(d,J＝2.2Hz,1H),4.37(t,J＝6.3Hz,2H),3.67(t,J＝6.3Hz,2H).

步骤2：

将上述制备的中间产物5a(0.361g,1mmol)，二乙醇胺(1.05g,10mmol)，和50mL乙腈加入100mL圆底烧瓶，加热搅拌回流约48h。停止反应，室温下逐渐冷却，析出浅黄色晶体。减压抽滤，并用大量蒸馏水洗涤，烘干，得到浅黄色固体6a，产率91％。¹H NMR(400MHz,CHLOROFORM-D)δ12.71(s,1H),7.87(dd,J＝8.0,1.6Hz,2H),7.58–7.47(m,3H),6.65(s,1H),6.51(d,J＝2.2Hz,1H),6.36(d,J＝2.2Hz,1H),4.12(t,J＝5.3Hz,2H),3.66(t,J＝5.2Hz,4H),3.04(t,J＝5.3Hz,2H),2.82(t,J＝5.2Hz,4H).MS(ESI):Calcd.C₂₁H₂₃NO₆,[M+H⁺]m/z:386.15,found:386.0789.

步骤3：

将上述制备的产物6a(0.385g,1mmol)，SOCl₂(0.58mL,8mmol)和50mL二氯甲烷投入到100mL圆底烧瓶中，加热搅拌回流约48h。停止反应，旋蒸除去溶剂。用二氯甲烷重结晶得到浅黄色固体Ⅱ₁。产率84％。¹H NMR(400MHz,METHANOL-D4)δ8.02(d,J＝6.6Hz,2H),7.66–7.52(m,3H),6.86–6.79(m,2H),6.49(d,J＝1.7Hz,1H),4.61–4.53(m,2H),4.08(t,J＝6.0Hz,4H),3.95–3.79(m,6H).MS(ESI):Calcd.C₂₁H₂₁Cl₂NO₄,[M+H⁺]m/z:422.08,found:422.0545.

实施例5

目标化合物Ⅱ₂的制备

步骤1：

将白杨素(2.54g,10mmol)、无水K₂CO₃(5.52g,40mmol)、10mL 1,3-二溴丙烷和150mL丙酮加入250mL圆底烧瓶，其余步骤同实施例4步骤1。最终得到黄色固体5b，产率77％。¹H NMR(400MHz,CHLOROFORM-D)δ12.72(s,1H),7.94–7.84(m,2H),7.60–7.47(m,3H),6.67(s,1H),6.52(d,J＝2.3Hz,1H),6.38(d,J＝2.2Hz,1H),4.20(t,J＝5.8Hz,2H),3.61(t,J＝6.4Hz,2H),2.41–2.29(m,2H).

步骤2：

将上述制备的中间产物5b(0.375g,1mmol)，二乙醇胺(1.05g,10mmol)，和50mL乙腈加入100mL圆底烧瓶，其余步骤同实施例4步骤2。得到浅黄色固体6b，产率89％.¹H NMR(600MHz,CHLOROFORM-D)δ12.71(s,1H),7.88(dd,J＝8.1,1.4Hz,2H),7.58–7.48(m,3H),6.66(s,1H),6.51(d,J＝2.2Hz,1H),6.37(d,J＝2.2Hz,1H),4.14(t,J＝5.9Hz,2H),3.66(t,J＝5.2Hz,4H),2.78(t,J＝6.8Hz,2H),2.71(t,J＝5.2Hz,4H),2.07–1.88(m,2H).MS(ESI):Calcd.C₂₂H₂₅NO₆,[M+H⁺]m/z:400.17,found:400.1818.

步骤3：

将上述制备的产物6b(0.399g,1mmol)，SOCl₂(0.58mL,8mmol)和50mL二氯甲烷投入到100mL圆底烧瓶中，其余步骤同实施例4中步骤3。得到浅黄色固体Ⅱ₂。产率80％。¹H NMR(600MHz,METHANOL-D4)δ8.02(d,J＝7.1Hz,2H),7.66–7.53(m,3H),6.81(s,1H),6.74(d,J＝1.9Hz,1H),6.42(d,J＝2.1Hz,1H),4.28(t,J＝5.6Hz,2H),4.08(t,J＝6.1Hz,4H),3.80(t,J＝6.1Hz,4H),3.67–3.58(m,2H),2.40–2.33(m,2H).MS(ESI):Calcd.C₂₂H₂₃Cl₂NO₄,[M+H⁺]m/z:436.10,found:436.33.

实施例6

目标化合物Ⅱ₃的制备

步骤1：

将白杨素(2.54g,10mmol)、无水K₂CO₃(5.52g,40mmol)、10mL 1,4-二溴丁烷和150mL丙酮加入250mL圆底烧瓶，其余步骤同实施例4步骤1。最终得到黄色固体5c，产率89％。¹H NMR(400MHz,CHLOROFORM-D)δ12.69(s,1H),7.89–7.85(m,2H),7.57–7.48(m,3H),6.65(s,1H),6.48(d,J＝2.2Hz,1H),6.35(d,J＝2.2Hz,1H),4.07(t,J＝6.0Hz,2H),3.49(t,J＝6.4Hz,2H),2.12–2.03(m,2H),2.03–1.94(m,2H).

步骤2：

将上述制备的中间产物5c(0.389g,1mmol)，二乙醇胺(1.05g,10mmol)，和50mL乙腈加入100mL圆底烧瓶，其余步骤同实施例4步骤2。得到浅黄色固体6c，产率96％。¹H NMR(600MHz,METHANOL-D4)δ7.95(d,J＝7.3Hz,2H),7.58–7.49(m,3H),6.71(s,1H),6.61(s,1H),6.30(d,J＝1.3Hz,1H),4.06(t,J＝5.9Hz,2H),3.60(t,J＝5.9Hz,4H),2.65(t,J＝5.9Hz,4H),2.63–2.59(m,2H),1.83–1.77(m,2H),1.69–1.62(m,2H).MS(ESI):Calcd.C₂₃H₂₇NO₆,[M+H⁺]m/z:414.18,found:414.1972.

步骤3：

将上述制备的产物6c(0.413g,1mmol)，SOCl₂(0.58mL,8mmol)和50mL二氯甲烷投入到100mL圆底烧瓶中，其余步骤同实施例4中步骤3。得到红棕色固体Ⅱ₃。产率79％。¹H NMR(600MHz,METHANOL-D4)δ7.96(d,J＝7.3Hz,2H),7.62–7.46(m,3H),6.75(s,1H),6.67(d,J＝1.6Hz,1H),6.34(d,J＝2.0Hz,1H),4.15(t,J＝5.7Hz,2H),4.00(t,J＝6.1Hz,4H),3.71(t,J＝6.0Hz,4H),3.46–3.38(m,2H),2.03–1.94(m,2H),1.94–1.87(m,2H).MS(ESI):Calcd.C₂₃H₂₅Cl₂NO₄,[M+H⁺]m/z:450.12,found:450.22.

实施例7

本发明合成的黄酮类氮芥衍生物对于几种肿瘤细胞增殖的抑制作用的测定。阳性对照化合物为顺铂和5-氟尿嘧啶。涉及到的细胞种类有A549(人肺癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞)、SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)、DU145(人前列腺癌细胞)、PC-3(人前列腺癌细胞)以及MCF-7(人乳腺癌细胞)。

实验方法(以A549细胞为例)：

种板：用含有10％胎牛血清的DMEM培养基将A549细胞制备成浓度为8万/mL的均匀细胞悬液，接种到96孔板中，每孔100μL。放入CO₂培养箱中培养。

给药：待细胞贴壁后，将本发明目标化合物用医用DMSO配制母液，再用培养基稀释至浓度梯度为5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、80μM的试验用样品，设置空白对照，即样品浓度为0，依次加入各孔，每孔100μL。每种浓度和空白对照均设置6个复孔。放入CO₂培养箱中培养。

显色：样品作用48h后，弃去孔内培养液。每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液和100μL培养基，在CO₂培养箱中孵育4h。

测试：弃去孔内液体，加入150μLDMSO，培养箱中孵育20min，使紫色甲瓒结晶充分溶解至DMSO中。使用酶标仪测定每孔在490nm波长下的吸光度。计算公式：肿瘤细胞增殖抑制率＝(A_对照-A_样品)/(A_对照-A_空白)×100％。最后使用SPSS 20拟合计算出IC₅₀值。

表1：目标化合物、原料以及阳性化合物对7种肿瘤细胞的IC₅₀值。

实施例8

细胞形态学：

选取对肿瘤细胞体外增殖抑制效果最好的目标化合物Ⅱ₂作用于HeLa细胞进行更深入的研究。将处于对数生长期的HeLa细胞接种于共聚焦小皿中，培养过夜至细胞贴壁后，用浓度为2μM的样品Ⅱ₂处理，并设置不加药组作为对照。孵育48h后，弃去培养液，用PBS洗涤2次，用DAPI染色液染色15min，然后用PBS洗去染料并用共聚焦显微镜拍照。如图9所示，不加药时，细胞形态完整，轮廓清晰，蓝色荧光均匀分布在核内，说明染色质分布均匀；经样品Ⅱ₂处理后，蓝色荧光分布集中，且增强变亮，说明染色质高度浓缩，样品Ⅱ₂使得HeLa细胞形态发生变化，引起细胞凋亡。

实施例9

细胞凋亡实验：

将对数生长期的HeLa细胞接种于六孔板中，培养过夜至细胞贴壁后，用不同浓度的样品Ⅱ₂(0.1μM,0.3μM,0.8μM,1.5μM)处理细胞，并设置不加药组。孵育48h后，收集细胞，并用PBS和Binding Buffer(1×)洗涤。然后用100μL Binding Buffer(1×)重悬细胞，并加入5μL AnnexinⅤ-FITC室温避光染色5min。再加入5μL PI，室温避光孵育5min。最后补加PBS至500μL，用流式细胞仪检测。结果如图10所示，随着样品Ⅱ₂浓度的增加，细胞凋亡率逐渐增大，说明样品Ⅱ₂可诱导HeLa细胞发生凋亡。

实施例10

细胞周期实验：

将对数生长期的HeLa细胞接种于六孔板中，培养过夜至细胞贴壁后，用不同浓度的样品Ⅱ₂(0.5μM,0.8μM)处理细胞，并设置不加药组。孵育48h后，收集细胞，用75％乙醇固定24h，然后离心弃去固定液，加入100μL RNase A溶液，37℃水浴30min。再加入400μL PI染色液混匀，4℃避光孵育30min。用流式细胞仪检测。检测结果如图11所示，随着样品Ⅱ₂浓度的增加，处于G2/M期的细胞占比逐渐增多，处于S期的基本不变，处于G0/G1期的细胞占比逐渐减少。说明样品Ⅱ₂可将HeLa细胞的细胞周期阻滞在G2/M期，引起细胞凋亡。

Claims (3)

1.一种含氮芥基黄酮类衍生物，其特征在于，是通式Ⅰ或Ⅱ所示的化合物：

其中n为1，2，3。

2.一种权利要求1所述的含氮芥基黄酮类衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1)将染料木素或白杨素与式Ⅲ所示的卤代烷烃在碱性条件下反应，得到式Ⅳ和式Ⅴ所示的化合物；

S2)将式Ⅳ和式Ⅴ所示的化合物与二乙醇胺反应，得到式Ⅵ和Ⅶ所示的化合物；

S3)将式Ⅵ和Ⅶ所示的化合物与氯化亚砜反应，得到式Ⅰ和Ⅱ所示的含氮芥基黄酮类衍生物；

其中，X为卤素；n为1，2，3。

3.权利要求1所述的含氮芥基黄酮类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

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