CN109370991A - 一种膀胱癌干细胞标志物及标记方法、膀胱癌分子分型试剂盒及应用 - Google Patents

一种膀胱癌干细胞标志物及标记方法、膀胱癌分子分型试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种膀胱癌干细胞标志物及标记方法、膀胱癌分子分型试剂盒及应用。本发明的标记方法是用小鼠源性OV6抗体与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠一起孵育，得到混合物；再将膀胱癌细胞系或膀胱癌组织细胞与上述混合物孵育；将孵育后的体系置于MACS MS柱上进行过滤分离，得到OV6阳性膀胱癌细胞，即为膀胱癌干细胞。最后检测OV6阳性膀胱癌细胞标记效率。进一步的，在OV6标记后用CD44抗体再标记膀胱癌细胞系，得到OV6阳性/CD44阳性膀胱癌细胞。经干细胞相关实验验证，本发明能够对膀胱癌干细胞进行显著标记，OV6阳性/CD44阳性膀胱癌细胞具有更高的成瘤率。本发明还建立了膀胱癌组织中OV6的检测方法，发现OV6阳性比例高的膀胱癌患者的预后更差，提示OV6应用可以指导膀胱癌的分子分型和预后评估。

Description

一种膀胱癌干细胞标志物及标记方法、膀胱癌分子分型试剂 盒及应用
技术领域
本发明涉及癌细胞标志物技术领域，特别涉及一种膀胱癌干细胞标志物及标记方法、膀胱癌分子分型试剂盒及应用。
背景技术
膀胱癌是世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一。据统计2012年全世界有429,800个新发病例，死亡人数为165,100。相对与西方发达国家，中国的膀胱癌发病率和病死率较低，然而研究数据表明中国的前膀胱癌发病率正在逐年攀升。因此膀胱癌不仅是世界范围内重要的健康问题，也成为了威胁我国国民健康的重要问题之一。
肿瘤干细胞被认为是癌症复发、转移的主要原因，癌症治疗中以肿瘤干细胞为靶标的重要性已被指出。但是肿瘤组织中肿瘤干细胞比率较低，特异性识别肿瘤干细胞并进行治疗是极其困难的。肿瘤干细胞的检测技术以及以肿瘤干细胞为靶标的新疗法的开发已成为癌症医疗中的重要课题。目前膀胱癌干细胞的标志物主要包括CD133、SOX2和醛脱氢酶1A1(ALDH1A1)等，主要用于膀胱癌干细胞的标记和分选。但是目前膀胱癌干细胞的研究存在一些问题，首先，以上膀胱癌干细胞标志物标记的膀胱癌细胞是否属于膀胱癌干细胞还存在争议；然后，这些标志物在多数膀胱癌细胞系和组织中的表达丰度存在较大差异，这些都大大影响了膀胱癌干细胞研究的深入和临床应用的探索；最后，这些标记物在膀胱癌组织中的表达水平与膀胱癌患者的预后的关系没有研究清楚，这极大地影响了膀胱癌干细胞标志物在临床精准治疗的应用。
发明内容
本发明提出一种膀胱癌干细胞标志物及标记方法、膀胱癌分子分型试剂盒及应用，增强了对膀胱癌干细胞标记的特异性，分离出的膀胱癌干细胞的干细胞特性也更强，并且结合标记试剂盒的应用，使标记和分离膀胱癌干细胞更加简洁有效。
本发明的技术方案是这样实现的：
根据本发明实施例的第一方面，提供一种膀胱癌干细胞标志物，标志物包括抗体OV6。
可选地，所述标志物还包括抗体CD44。如此，增强了对膀胱癌干细胞标记的特异性。
根据本发明实施例的第二方面，提供一种对膀胱癌干细胞进行标记的方法，包括以下步骤：
a.用小鼠源性OV6抗体与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠一起孵育，得到混合物；
b.将膀胱癌细胞系或膀胱癌组织细胞与上述混合物孵育；
c.将孵育后的体系置于MACS MS柱(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)上进行过滤分离，得到OV6阳性膀胱癌细胞，即为膀胱癌干细胞。
在本实施例中，膀胱癌细胞系为UMUC3，是从上海中国科学院细胞所获得。UMUC3细胞在Minimum Essential Medium培养基(1871544,Gibco,Waltham,MA,USA)含10％胎牛血清(FBS，10099-141、Gibco、美国)中培养，辅以1％青霉素/链霉素(15140122，Gibco，美国)。将1×106个UMUC3细胞铺板于10cm皿(430167，Coring，USA)中，培养48h，至细胞长至80～90％。
本发明先将OV6抗体与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠一起孵育，然后再与膀胱癌细胞系或膀胱癌组织细胞一起孵育。OV6抗体与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠之间的结合属于抗原抗体免疫结合，抗原抗体免疫结合在低温4℃左右结合较慢，但结合地更稳定、特异性更强，尤其是长时间的低温条件下的结合更为紧密。因此我们将OV6抗体与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠一起在低温条件下长时间孵育，可以使三者之间紧密稳定地结合，之后再与膀胱癌细胞系或膀胱癌组织细胞一起孵育能使磁珠复合物更好地结合细胞，从而显著提高OV6抗体标记膀胱癌细胞的效果。
可选地，步骤a中小鼠源性OV6抗体与步骤c孵育后的体系的体积比为1:50。可选地，步骤c孵育后的体系包含小鼠源性OV6抗体、大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠和膀胱癌细胞系，或者，步骤c孵育后的体系包含小鼠源性OV6抗体、大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠和膀胱癌组织细胞。
可选地，步骤a中孵育温度为3℃～8℃。优选地，步骤a℃中孵育温度为4℃。可选地，步骤a中孵育时间为12～18h。如此，使小鼠源性OV6抗体与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠紧密结合。
可选地，步骤b中孵育温度为3℃～5℃。优选地，步骤b中孵育温度为5℃。可选地，步骤b中孵育时间为20～30min。
具体地，步骤a中磁性微珠用量为20～30微升，步骤b中膀胱癌细胞系或膀胱癌组织细胞总体积为500微升。如此，能够使小鼠源性OV6抗体对膀胱癌细胞系或膀胱癌组织细胞的标记效果显著。
可选地，步骤a中大鼠抗小鼠IgG与步骤c孵育后的体系的体积比为1:50。
在本实施例中，利用MiniMACS TM Cell Sorter(Miltenyi Biotec，BergischGladbach，Germany)对OV6阳性膀胱癌细胞进行磁激活细胞分选(MACS)。其中，MiniMACS TMCell Sorter为细胞分选仪，磁激活细胞分选(MACS)为利用结合磁性微粒的单克隆抗体标记细胞，在外加磁场的作用下，将样品中与不带磁的细胞分开，达到分离纯化目的的方法。
为了检验OV6对膀胱癌干细胞的标记效率，还包括采用流式细胞术检测OV6阳性膀胱癌细胞标记效率的步骤，具体如下：
①.对于上述步骤中OV6阳性膀胱癌细胞进行OV6表达比例检测，利用APC偶联的OV6抗体(1:50，FAB2020A，R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)标记OV6阳性膀胱癌细胞；
②.利用Cyan ADP分选仪(Beckman，CA，USA)进行流式细胞术测定APC-OV6(APC偶联的OV6抗体)细胞的比例分布，即得到OV6阳性膀胱癌细胞的标记效率。
在本实施例中，流式细胞术(Flow CytoMetry，FCM)是对悬液中的单细胞或其他生物粒子，通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。
在一些可选实施例中，对膀胱癌干细胞进行标记的方法还包括：步骤d.将步骤c得到的OV6阳性膀胱癌细胞再用小鼠源性CD44抗体孵育20～30分钟，将CD44抗体标记的膀胱癌细胞系或膀胱癌组织细胞再与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠一起孵育，将孵育后的体系置于MACS MS柱上进行过滤分离，即得到OV6+/CD44+膀胱癌干细胞。
可选地，步骤d中大鼠抗小鼠IgG与步骤c孵育后的体系的体积比为1:40。可选地，磁性微珠的用量为30～40微升。
可选地，还包括采用流式细胞术检测OV6+/CD44+膀胱癌干细胞标记效率，包括步骤：
③.利用别藻蓝素(Allophycocyanin,APC,一种荧光标记物)偶联的OV6抗体(抗体与细胞悬液的体积比为1:50，货号：FAB2020A，公司：R&D Systems)和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC,一种荧光标记物)标记的CD44抗体(抗体与细胞悬液的体积比为1:50，货号：130-102-511，公司：Miltenyi Biotec)标记OV6阳性膀胱癌细胞；
④.利用Cyan ADP分选仪(Beckman，CA，USA)进行流式细胞术测定APC-OV6(APC偶联的OV6抗体)标记和FITC-CD44(FITC偶联的CD44抗体)标记细胞的比例分布，即得到OV6阳性膀胱癌细胞的标记效率。
根据本发明实施例的第三方面，提供一种膀胱癌分子分型试剂盒，包含前述任一项可选实施例提供的膀胱癌干细胞标志物。
根据本发明实施例的第四方面，提供膀胱癌分子分型试剂盒的应用，采用前述实施例提供的膀胱癌分子分型试剂盒鉴定OV6+和OV6-膀胱癌。
本发明的有益效果是：
(1)本发明膀胱癌细胞系应用OV6标记和分离膀胱癌干细胞，或，OV6和CD44联合标记和分离膀胱癌干细胞，增强了对膀胱癌干细胞标记的特异性，分离出的膀胱癌干细胞的干细胞特性也更强，并且结合标记试剂盒的应用，使标记和分离膀胱癌干细胞更加简洁有效。
(2)本发明应用OV6标记膀胱癌组织中的干细胞，或OV6和CD44联合标记膀胱癌组织中的干细胞，并根据膀胱癌组织的OV6表达水平、OV6和CD44表达水平分析对比患者的预后，从而通过OV6，或，OV6和CD44的表达水平来提示膀胱癌患者的预后的分型，对于膀胱癌精准治疗具有重要的临床价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：实施例1通过流式细胞术计算的APC-OV6的百分比；
图2：实施例2通过流式细胞术计算的APC-OV6的百分比；
图3：实施例3通过流式细胞术计算的APC-OV6的百分比；
图4：实施例4通过流式细胞术计算的APC-OV6的百分比；
图5：实施例5通过流式细胞术计算的APC-OV6的百分比；
图6：实时定量PCR分析OV6-和OV6+膀胱癌细胞中干性相关基因(CD133，CD44，SOX2，KLF4，NANOG)表达水平；
图7：连续传代的OV6+和OV6-细胞衍生球体的代表性图像及数量比较(比例尺＝100μm)；
图8：一代和二代移植后OV6-或OV6+UMUC3细胞的小鼠皮下肿瘤的生物发光成像及计算致瘤细胞频率估计和p值；
图9：干细胞标记物标记膀胱癌干细胞后，进行体内成瘤实验，一代和二代移植后OV6阳性/CD44阳性，OV6阴性/CD44阳性以及OV6阳性/CD44阴性UMUC3细胞的小鼠皮下肿瘤的生物发光成像及计算致瘤细胞频率估计和p值。
图10：正常膀胱和膀胱癌组织中，代表性苏木精伊红(H&E)染色和OV6的免疫组织化学(IHC)染色图片，及正常膀胱和膀胱癌组织中OV6的IHC评分；
图11a：同一膀胱癌患者的原发灶和转移灶组织的代表性H&E染色和OV6的IHC染色，及OV6的IHC评分；
图11b：同一膀胱癌患者的化疗前后组织的代表性H&E染色和OV6的IHC染色，及OV6的IHC评分；
图12：膀胱癌患者的疾病特异性生存、无进展生存和总体生存的Kaplan-Meier曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)用小鼠源性OV6抗体与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠20微升一起在3℃孵育15h，得到混合物；
(2)将500微升的UMUC3细胞与上述混合物在5℃孵育30min；
(3)将孵育后的体系置于MACS MS柱上进行过滤分离，得到OV6阳性膀胱癌细胞，即为膀胱癌干细胞。
实施例2
(1)用小鼠源性OV6抗体与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠20微升一起在5℃孵育18h，得到混合物；
(2)将500微升的UMUC3细胞与上述混合物在4℃孵育30min；
(3)将孵育后的体系置于MACS MS柱上进行过滤分离，得到OV6阳性膀胱癌细胞，即为膀胱癌干细胞。
实施例3
(1)用小鼠源性OV6抗体与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠20微升一起在4℃孵育12h，得到混合物；
(2)将500微升的UMUC3细胞与上述混合物在5℃孵育30min；
(3)将孵育后的体系置于MACS MS柱上进行过滤分离，得到OV6阳性膀胱癌细胞，即为膀胱癌干细胞。
分别对实施例1～3得到的膀胱癌干细胞进行OV6表达比例检测，利用APC偶联的OV6抗体(1:50，FAB2020A，R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)标记OV6阳性膀胱癌细胞后，利用Cyan ADP分选仪(Beckman，CA，USA)进行流式细胞术进行测定APC-OV6细胞的比例分布，其中，实施例1的测定结果如图1所示，从图1中可以看出，UMUC3细胞的OV6基础表达(未经磁激活细胞分选)比例在2％左右，经过磁激活分选后OV6阳性膀胱癌细胞所占比例80％以上，效率较高。实施例2的测定结果如图2所示，从图2中可以看出，UMUC3细胞的OV6基础表达(未经磁激活细胞分选)比例在1.5％左右，经过磁激活分选后OV6阳性膀胱癌细胞所占比例85％以上，效率较高。实施例3的测定结果如图3所示，从图3中可以看出，UMUC3细胞的OV6基础表达(未经磁激活细胞分选)比例在6％左右，经过磁激活分选后OV6阳性膀胱癌细胞所占比例为89.58％以上，效率最高。
实施例4
(1)用小鼠源性OV6抗体与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠20微升一起在4℃孵育15h，得到混合物；
(2)将500微升UMUC3细胞与上述混合物在5℃孵育30min；
(3)将孵育后的体系置于MACS MS柱上进行过滤分离，得到OV6阳性膀胱癌细胞，即为膀胱癌干细胞；
(4)将步骤c得到的OV6阳性膀胱癌细胞再用小鼠源性CD44抗体孵育30分钟，分别将CD44抗体标记的UMUC3细胞再与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠一起孵育，磁性微珠为30微升，将孵育后的体系置于MACS MS柱上进行过滤分离，即得到OV6+/CD44+膀胱癌干细胞。
实施例5
(1)用小鼠源性OV6抗体与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠20微升一起在4℃孵育15h，得到混合物；
(2)将500微升UMUC3细胞与上述混合物在5℃孵育30min；
(3)将孵育后的体系置于MACS MS柱上进行过滤分离，得到OV6阳性膀胱癌细胞，即为膀胱癌干细胞；
(4)将步骤c得到的OV6阳性膀胱癌细胞再用小鼠源性CD44抗体孵育20分钟，分别将CD44抗体标记的UMUC3细胞再与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠一起孵育，磁性微珠为30微升，将孵育后的体系置于MACS MS柱上进行过滤分离，即得到OV6+/CD44+膀胱癌干细胞。
对实施例4～5得到得到的膀胱癌干细胞进行OV6表达比例和CD44表达比例检测，利用Cyan ADP分选仪(Beckman，CA，USA)进行流式细胞术测定APC-OV6标记和FITC-CD44标记细胞的比例分布，即得到OV6+/CD44+膀胱癌细胞的标记效率。实施例4的标记效率如图4所示，分选得到OV6+/CD44+膀胱癌的比例为80.1％。实施例5的标记效率如图5所示，分选得到OV6+/CD44+膀胱癌的比例为77.5％。
实施例6
对实施例1得到的标记物标记的膀胱癌干细胞进行干细胞特性检测。
1、实时聚合酶链式反应检测干性相关基因表达水平。
根据制造商的方案，使用RNAiso Plus(9109，Takara，日本)，抽提UMUC3分选的细胞的总RNA。使用PrimeScript One Step RT试剂盒(RR037B，Takara，Japan)在随机引物和逆转录酶存在下进行逆转录。所产生的cDNA的扩增在SYBR Green Realtime PCR MasterMix(QPK201，Toyobo，Japan)和ABI PRISM 7300HT Sequence Detection System中进行。
每个测量一式三份进行，结果通过β-actin基因的表达来标准化。倍数相对于平均值的变化由2-△△Ct确定，结果如图6所示，数据表示为相对于OV6阴性UMUC3细胞的倍数变化，表明OV6阳性膀胱癌细胞具有高表达干性相关基因。
2、成球实验检测OV6阳性膀胱癌细胞体外成球能力
成球能力测定，将5000个经过磁激活细胞分选的OV6阳性和OV6阴性细胞的单细胞悬浮液在6孔超低附着培养板(Corning，USA)中孵育5天。在显微镜下计数形成的球状体的数量，并拍摄代表性图片，如图7所示，OV6阳性膀胱癌细胞具有更高成球能力。
3、体内有限稀释成瘤实验检测OV6阳性膀胱癌细胞体内成瘤能力
所有的实验动物程序均经中国上海第二军医大学动物护理与使用委员会批准。从上海实验动物中心(SLAC，China)购买NOD-SCID小鼠(雄性，6周龄)并且在特定的无病原体条件下饲养。
体内有限稀释测定，将分选的OV6阳性和OV6阴性膀胱癌细胞连续稀释至5000、10000、20000个细胞/50μL的细胞密度。注射细胞并对不同注射细胞量形成的肿瘤数量进行评分。使用由霍尔研究所Walter和Eliza提供的ELDA软件(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html)计算肿瘤干细胞的频率。图8显示了一代和二代移植后OV6阴性或OV6阳性UMCU3细胞的小鼠皮下肿瘤的生物发光成像，并且通过有限稀释分析工具计算致瘤细胞频率估计和p值(HTTP//bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)。从图8的数据可以看出，OV6阳性膀胱癌细胞具有更高成瘤能力。
实施例7
1、在实施例4的步骤(4)中，将孵育后的体系置于MACS MS柱上进行过滤分离，可得到CD44阳性膀胱癌细胞，其他细胞为CD44阴性膀胱癌细胞，如此可分别得到OV6-/CD44+和OV6+/CD44-膀胱癌细胞。
2、将分选的3组膀胱癌细胞(OV6+/CD44+、OV6-/CD44+和OV6+/CD44-膀胱癌细胞)分别连续稀释至5000、10000、20000个细胞/50μL的细胞密度。注射细胞并对不同注射细胞量形成的肿瘤数量进行评分。使用由霍尔研究所Walter和Eliza提供的ELDA软件(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html)计算肿瘤干细胞的频率。图9显示了一代和二代移植后分选后的UMCU3细胞的小鼠皮下肿瘤的生物发光成像，并且通过有限稀释分析工具计算致瘤细胞频率估计和p值(HTTP//bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)。从图9的数据可以看出，OV6阳性/CD44阳性膀胱癌细胞比OV6阴性/CD44阳性具有更高成瘤能力，OV6阳性/CD44阳性膀胱癌细胞比OV6阴性/CD44阳性具有更高成瘤能力，OV6阳性/CD44阴性膀胱癌细胞比OV6阴性/CD44阳性具有更高成瘤能力，但OV6阳性/CD44阳性膀胱癌细胞和OV6阳性/CD44阴性细胞之间的成瘤能力无明显差异。这也证明了，OV6联合CD44联合应用能更好的标记膀胱癌干细胞，同时也突出了OV6对于膀胱癌干细胞的标记要由于CD44对膀胱癌干细胞的标记。
实施例8
通过免疫组织化学染色的方法检测生物样品中OV6的表达情况对膀胱癌进行分子分型。
1、膀胱癌分子分型试剂盒：特异性识别人OV6抗体和免疫组织化学染色实验试剂等。
2、在2004年和2013年间，收集了队列1：130例在长海医院(中国上海)病理确诊为膀胱癌的患者和队列2：95例在长海医院(中国上海)病理确诊为膀胱癌的患者相关材料，包括临床资料，组织标本和随访资料。
膀胱癌患者的临床资料包括诊断年龄，术后病理分级，病理T分期，病理N分期，肿瘤原发复发，肿瘤多发单发，肿瘤形体等。
苏木精-伊红(HE)染色的膀胱癌标本重新由两位有经验的病理学家评估(g.j.h.和Y.Y.W.)进行双盲法验证。根据美国癌症联合委员会(AJCC)2010和世界卫生组织(WHO)2004的分类原则评估肿瘤分期和分级。临床样本获取过程是根据第二军医大学伦理委员会批准的既定方案，在患者签订书面知情同意书。
3、将石蜡包埋的膀胱癌样品切片在二甲苯中脱蜡，重新水合，在抗原修复后，在3％H2O2的甲醇溶液中在室温下孵育30分钟以灭活内源性过氧化物酶。将切片在室温下用5％BSA封闭20分钟，然后用小鼠抗OV6(1:100，MAB2020，R&D systems，USA)于4℃过夜。然后用过氧化物酶嵌合的抗生蛋白链菌素孵育，并使用二氨基联苯胺(DAB-2031，MXBBiotechnologies，China)显影，最后用苏木素试剂染细胞核，进行脱水封片后在显微镜下读片分析。蛋白质表达评分(IHC评分)通过染色强度和免疫反应评分后阳性染色细胞的百分比(IRS评分)进行综合评判。免疫组化分析由两名独立的研究者进行。
4、分析结果：
1)OV6表达在膀胱癌组织中的表达与膀胱癌的高恶性程度相关；
从图9中可以看出，在正常膀胱和膀胱癌组织中，代表性苏木精伊红(H&E)染色和OV6的免疫组织化学(IHC)染色，按照非肌层浸润性膀胱癌，肌层浸润性膀胱癌(比例尺＝20μm)排列，各组OV6的IHC评分见图10。由图10评分可以看出，OV6表达在膀胱癌组织中的表达与膀胱癌的高恶性程度相关。
2)OV6表达在膀胱癌组织中的表达与膀胱癌的转移和耐药相关
如图11a、11b所示，来自同一膀胱癌患者的原发灶和转移灶以及化疗前后组织的代表性H&E染色和OV6的IHC染色。
3)OV6表达在膀胱癌组织中的表达与膀胱癌的不良预后相关
如图12所示，根据OV6表达，分析膀胱癌患者的疾病特异生存、无进展生存和总体生存的Kaplan-Meier曲线。(队列1，n＝130；队列2，n＝95)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种膀胱癌干细胞标志物，其特征在于，标志物包括抗体OV6。
2.根据权利要求1所述的膀胱癌干细胞标志物，其特征在于，所述标志物还包括抗体CD44。
3.一种对膀胱癌干细胞进行标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.用小鼠源性OV6抗体与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠一起孵育，得到混合物；
b.将膀胱癌细胞系或膀胱癌组织细胞与上述混合物孵育；
c.将孵育后的体系置于MACS MS柱上进行过滤分离，得到OV6阳性膀胱癌细胞，即为膀胱癌干细胞。
4.根据权利要求3所述的标记的方法，其特征在于，步骤a中大鼠抗小鼠IgG与步骤c孵育后的体系的体积比为1:50。
5.根据权利要求3所述的标记的方法，其特征在于，还包括：
d.将步骤c得到的OV6阳性膀胱癌细胞再用小鼠源性CD44抗体孵育20～30分钟，将CD44抗体标记的膀胱癌细胞系或膀胱癌组织细胞再与大鼠抗小鼠IgG、磁性微珠一起孵育，孵育后的体系置于MACS MS柱上进行过滤分离，即得到OV6+/CD44+膀胱癌干细胞。
6.根据权利要求5所述的标记的方法，其特征在于，步骤d中大鼠抗小鼠IgG与步骤c孵育后的体系的体积比为1:40。
7.一种膀胱癌分子分型试剂盒，包含如权利要求1或2所述的膀胱癌干细胞标志物。
8.膀胱癌分子分型试剂盒的应用，其特征在于，采用如权利要求7所述的膀胱癌分子分型试剂盒鉴定OV6+和OV6-膀胱癌。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008035169A2 (en) * 2006-09-18 2008-03-27 Universita' Degli Studi Di Torino Process for preparing hepatic cells from progenitor cells present in umbilical cord blood
CN102653730A (zh) * 2012-04-18 2012-09-05 中国人民解放军第二军医大学 一种肝癌起始细胞及其分离方法与应用
CN105158468A (zh) * 2015-08-14 2015-12-16 中国人民解放军第二军医大学 Ck19联合ov6在制备肝癌分子分型试剂盒及肝癌个体化治疗中的应用
US20170246215A1 (en) * 2014-09-16 2017-08-31 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Repopulation of organs and tissues using a yap-ert2 fusion protein
CN108727495A (zh) * 2018-04-27 2018-11-02 上海长海医院 前列腺癌干细胞标志物、抗体ov6在制备前列腺癌干细胞标记材料中的应用及标记方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008035169A2 (en) * 2006-09-18 2008-03-27 Universita' Degli Studi Di Torino Process for preparing hepatic cells from progenitor cells present in umbilical cord blood
CN102653730A (zh) * 2012-04-18 2012-09-05 中国人民解放军第二军医大学 一种肝癌起始细胞及其分离方法与应用
US20170246215A1 (en) * 2014-09-16 2017-08-31 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Repopulation of organs and tissues using a yap-ert2 fusion protein
CN105158468A (zh) * 2015-08-14 2015-12-16 中国人民解放军第二军医大学 Ck19联合ov6在制备肝癌分子分型试剂盒及肝癌个体化治疗中的应用
CN108727495A (zh) * 2018-04-27 2018-11-02 上海长海医院 前列腺癌干细胞标志物、抗体ov6在制备前列腺癌干细胞标记材料中的应用及标记方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAI-JIAN WANG等: "Targeting an Autocrine Regulatory Loop in Cancer Stem-like Cells Impairs the Progression and Chemotherapy Resistance of Bladder Cancer", 《CLIN CANCER RES》 *

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