CN109349041B - 一种温郁金优良种苗选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种温郁金优良种苗选育方法，包括以下步骤：（1）建立温郁金种质资源圃；（2）施加PGRP菌株；（3）种质特性评比；（4）采收；（5）复种；（6）优良种苗选择。本发明在引进温郁金种质种植过程中，通过施加当地温郁金种植地区所种植温郁金根系土壤中得到的PGRP菌株混合物，使种质资源圃土壤环境的特质放大，加速外地优质种质资源的驯化和观察试验，从而使更加适应当地的优质种质在植物特性和产品特性与不适应当地的优质种质之间差异更大，便于进行选育。
Description
技术领域
本发明涉及一种温郁金优良种苗选育方法。
背景技术
温郁金( Curcuma wenyujin) 系姜科姜黄属植物，其块根、根茎可供药用，块根加工成的药材温郁金是浙江省著名道地药材“浙八味”之一。为浙江南部地区种植的一种姜科药用植物, 野生种已罕见, 以人工栽培为主，温郁金喜温暖湿润、阳光充足的气候，耐旱抗涝，但怕霜冻。适宜在土质疏松、排水良好、土层深厚的冲积土、砂壤土中生长。温郁金开花很少，种子多不充实，栽培上用种姜根茎繁殖。温郁金年生长周期约250天左右，一般4月上旬(清明前后)种植，12月中上旬收获。
经研究发现，温郁金由于长期的无性繁殖及种源的自繁、自留，导致了植株的混杂、老化，无种子质量标准，未进行过优良品种选育研究，再加上连作现象十分普遍，导致种质退化、抗逆性差、植株病毒化严重，引起减产现象。植株间良莠不齐、品质变异较大，导致药材质量不稳定，严重影响了临床用药的有效性和安全性。外地引进优质种质资源是一种方法，但是如何确定外地优质种质资源是否适合当地生长，从而选育郁金优良种苗是一个难点。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种温郁金优良种苗选育方法。
本发明所采取的技术方案如下：一种温郁金优良种苗选育方法，包括以下步骤：
（1）建立温郁金种质资源圃：搜集、引进温郁金种质材料，集中分区域种植于种质资源圃，插牌标记；
（2）施加PGRP菌株：种植期间，每隔20-40天，施加温莪术特异性PGRP菌株混合物，所述温莪术特异性PGRP菌株是从当地温郁金种植地区所种植温郁金根系土壤中收集、筛选、培养、繁育得到；
（3）种质特性评比：在当年11月1~5日，在温郁金种质资源圃中，针对不同种质个体和小群体进行形态特性评比，选择株高在70～120cm、叶片长×宽在51～60cm×16～22cm的植株，进行标记；
（4）收获：在当年11月4-6日，将全株挖起，抖掉泥土，摘下块根，保留根须，计算霉败率、除去霉败品后的单株产量、平均单株产量、标准偏差；
（5）复种：在第二年的3月下旬～4月中旬温度达到13℃以上时下种，采用穴栽，栽种前取出上年贮存的种茎，除去须根，每穴放入种茎2～4个，芽眼向上栽种，均匀摆放，放种时种茎与土壤密接，栽后覆盖细土，厚3～5厘米；
（6）优良种苗选择：重复步骤（2）-（4），进行评比，选出连续两年株高在70～120cm、叶片长×宽在51～60cm×16～22cm的植株，再综合评估霉败率、除去霉败品后的单株产量、平均单株产量、标准偏差，得到优良种苗。
步骤（2）中， PGRP（植物根际促生细菌）是指自由生活在土壤或附生于植物根际的一类可促进植物生长、防治病害、增加作物产量的有益菌类，一般具有固氮、解磷、释钾、产生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中之一能力的特性。PGPR对土壤中有害病原微生物与非寄生性根际有害微生物都有生防作用，可促进植物吸收利用矿物质营养，并可产生有益植物生长的代谢产物，从而促进植物的生长发育。
温莪术特异性PGRP菌株混合物通过以下方法得到：
a)采集当地温郁金种植地区温郁金根系土壤，置于液体培养基中，避光摇床培养，隔数天转接培养液至新鲜的液体培养基富集培养；
b)将步骤a得到的富集培养液与温莪术凝集素粗品或温莪术凝集素纯品混合，摇床反应1-2h，在0-8℃、1000-2500r/min下离心5-10min，得到沉淀物；
c)在沉淀物中加入含有200mm乳糖的缓冲溶液，摇床反应1-2h，在0-8℃、3000-4000r/min下离心15-30min，沉淀为温莪术特异性PGRP菌株混合物。
所述的温莪术凝集素粗品通过以下方法得到：
a)取新鲜的温莪术，切片，粉碎打浆，得到浆状原料，在0-8℃、8000 -10000r/min下离心20-45 min，弃上清液，得第一次沉淀物；
b)在pH为5.5~6.5的缓冲溶液中加入1~3%的复合酶溶液，所述复合酶溶液为纤维素酶:果胶酶=2-3:1，与第一次沉淀物以体积比5-7:1混合，混合后在常温下，低速搅拌4-6h，然后在0-8℃、2000 r/min下离心10-15 min，取上清液，然后在0-8℃、8000 -10000 r/min下离心20-45 min，弃上清液，得第二次沉淀物；
c)在第二次沉淀物中按1:1-2的体积比加入预冷石油醚，在0-8℃下，低速搅拌10-30min，抽滤，按1:0.5-1的体积比加入预冷丙酮，静置1-2min，抽滤，晾干，得第三次沉淀物；
d)在第三次沉淀物中按1:8-10的体积比加入PH为5.5-6.5的缓冲液，在0-8℃下，低速搅拌2-4h，在0-8℃、8000-10000 r/min下离心20-45 min，弃沉淀物，按1:0.1-0.3的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在0-8℃下，低速搅拌1-2min，在0-8℃、2000-3000 r/min下离心2-4 min，弃沉淀物，按1：2.5-2.9的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在0-8℃下，低速搅拌3-5min，在0-8℃、8000 -10000 r/min下离心25-35min，得到第四次沉淀物；
e)将第四次沉淀物溶于水中，置于透析袋中进行透析至透析液中无硫酸根，冷冻干燥得到温莪术凝集素粗品；
所得到的温莪术凝集素粗品与富集培养液以浓度0.1-0.2g/L混合。
步骤（5）中，复种所用种茎为上年度株高在70～120cm、叶片长×宽在51～60cm×16～22cm之间的植株上采集的长度70～80mm一级二头、三头的根茎。
本发明的有益效果如下：本发明在引进温郁金种质种植过程中，通过施加当地温郁金种植地区所种植温郁金根系土壤中得到的PGRP菌株混合物，使种质资源圃土壤环境的特质放大，加速外地优质种质资源的驯化和观察试验，从而使更加适应当地的优质种质在植物特性和产品特性与不适应当地的优质种质之间差异更大，便于进行选育。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1为温郁金种质资源圃分布图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1 温莪术凝集素粗品的制备：
（1）取新鲜的温莪术10kg，切片，粉碎打浆，得到浆状原料，在4℃、10000r/min下离心45 min，弃上清液，得第一次沉淀物；
（2）在pH为5.5~6.5的磷酸盐缓冲溶液中加入1~3%的复合酶溶液，所述复合酶溶液为纤维素酶:果胶酶=3:1，与第一次沉淀物以体积比7:1混合，混合后在常温下，低速搅拌5.5h，然后在4℃、2000 r/min下离心10 min，取上清液，然后在4℃、10000r/min下离心45min，弃上清液，得第二次沉淀物；
（3）在第二次沉淀物中按1:2的体积比加入预冷石油醚，在4℃下，低速搅拌20min，抽滤，按1:0.7的体积比加入预冷丙酮，静置1-2min，抽滤，晾干，得第三次沉淀物；
（4）在第三次沉淀物中按1:8.7的体积比加入PH为5.5-6.5的磷酸盐缓冲液，在4℃下，低速搅拌3h，在4℃、10000 r/min下离心45 min，弃沉淀物，按1:0.2的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在4℃下，低速搅拌1-2min，在4℃、2000 r/min下离心3 min，弃沉淀物，按1：2.7的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在4℃下，低速搅拌4min，在4℃、10000 r/min下离心45 min，得到第四次沉淀物；
（5）将第四次沉淀物溶于水中，置于透析袋中进行透析至透析液中无硫酸根，冷冻干燥得到温莪术凝集素粗品879 g。
（6）取家兔新鲜血液加肝素钠(0．05％W／W)，2 000 r／min离心10 min，用4倍体积的0．01 mol/L PBS洗涤3次，然后将红细胞用0．0l mol/L PBS配成10％的血细胞悬液，再缓慢加入等体积的2．5％戊二醛，4cC下缓慢搅拌2 h。再用0．01 mol/L PBS洗涤3次，离心后配成2％血细胞悬液。测得温莪术凝集素粗品比活1574 .01HU/mg。
实施例二 温莪术特异性PGRP菌株混合物的制备：
（1）采集温莪术根系土壤，置于液体培养基中，室温下避光摇床培养，每隔7天后转接培养液至新鲜的液体培养基富集培养，连续富集4轮；
（2）将步骤（1）得到的富集培养液与实施例一所得到的温莪术凝集素粗品混合根据表1中的条件进行混合，摇床反应1-2h，在0-8℃、1000-2500r/min下离心5-10min，得到沉淀物；
（3）在沉淀物中加入含有200mm乳糖的缓冲溶液，摇床反应1-2h，在0-8℃、3000-4000r/min下离心15-30min，沉淀为温莪术特异性PGRP菌株混合物，上清液透析、冻干得到温莪术凝集素。
实施例三 种质资源圃的建立：
1. 收集种质资源
通过对郁金在全国的主要分布区进行资源调查，进行样品的收集和引种工作，本实施例中引入种质资源如表1所示。
2. 选地
根据温郁金的生长习性，选择土质疏松、排水良好、土层深厚、富含有机质的冲积土、砂壤土，土壤pH中性或微酸性。
3. 整地
按图1所示的温郁金种质资源圃图纸进行建设，对种植区域进行整地，春季以1.1~1.2m间距浅翻地20~25cm，形成1.1~1.2宽厢面，翻地后打碎大图快，检出杂草、草根等田间杂物。种植密度为1480株/667m2。在种植前，用100千克每亩腐熟的菜籽饼作基肥施用。
4. 田间管理
每隔20-40天，施加实施例2所得到温莪术特异性PGRP菌株混合物，2000倍稀释，灌窝。在5月底至6月上旬、8月上旬至中旬，施加两次肥料。需要保持土壤湿润，特别在7-9月生长旺盛期。
5. 种植时间和采收时间
在3月35日至4月5日内，所有种质同一天种植，在12月5日进行采收，种植两个年度，第二年复种所用种茎为上年度株高在70～120cm、叶片长×宽在51～60cm×16～22cm之间的植株上采集的长度70～80mm一级二头、三头的根茎。。
6. 记录
每个年度记录相关数据，
（1）株高、叶片长宽：选取株高在70～120cm、叶片长×宽在51～60cm×16～22cm之间的植株。高大植株是温郁金重要的农艺性状。但是，在长期种植研究过程中，发现温郁金茎叶生长十分茂盛，过剩生长带来的营养消耗过大，而矮化的温郁金品种不仅抗倒伏性增强，促进根茎生长，提高通风透光，减少病害发生，株高在70～120cm的矮杆品种产量明显较高，所收获的温郁金大多数个大、浆足、质实，品质较高，且统计病害发生的几率相比其它品种发生的几率低70%左右。另外叶片长×宽降低在51～60cm×16～22cm范围的植株所收获的温郁金产品产量明显高于其它植株，估计是由于茎叶生长过剩带来营养消耗过大。故优选株高在70～120cm、叶片长×宽在51～60cm×16～22cm为优选植株。
（2）平均单株霉败率、单株霉败率标准偏差：收获后，计算单株产量，然后筛分出霉败品，计算霉败品的重量，霉败率=霉败品/单株总产量，计算平均值及标准偏差。
平均单株产量、单株产量标准偏差：收获后，计算每株温郁金除去霉败品后的产量，计算平均值及标准偏差。
记录结果如表2、表3所示，综合所有结果，分析得到17号种质为被选育出的优良种苗。
另外，对第二年收获的温郁金，烘干至含水量低于15%。然后进行测定挥发油含量测定，结果如表4所示，17号种质挥发油含量也较高。
第三年开始，将17号种质第二年收集的种茎种植到种植区，与其它本地温郁金植株进行相同管理，第三年、第四年的平均单株霉败率、平均单株产量与第二年相差不大。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (4)
1.一种温郁金优良种苗选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
建立温郁金种质资源圃：搜集、引进温郁金种质材料，集中分区域种植于种质资源圃，插牌标记；
施加PGRP菌株：种植期间，每隔20-40天，施加温郁金特异性PGRP菌株混合物，所述温郁金特异性PGRP菌株是从当地温郁金种植地区所种植温郁金根系土壤中收集、筛选、培养、繁育得到；
种质特性评比：在当年11月1~5日，在温郁金种质资源圃中，针对不同种质个体和小群体进行形态特性评比，选择株高在70～120cm、叶片长×宽在51～60cm×16～22cm的植株，计算百分比；
采收：在当年11月4-6日，将全株挖起，抖掉泥土，摘下块根，保留根须，计算霉败率、除去霉败品后的单株产量、平均单株产量、标准偏差；
复种：在第二年的3月下旬～4月中旬温度达到13℃以上时下种，采用穴栽，栽种前取出上年贮存的种茎，除去须根，每穴放入种茎2～4个，芽眼向上栽种，均匀摆放，放种时种茎与土壤密接，栽后覆盖细土，厚3～5厘米；
优良种苗选择：重复步骤（2）-（4），进行评比，选出连续两年株高在70～120cm、叶片长×宽在51～60cm×16～22cm的植株，再综合评估霉败率、除去霉败品后的单株产量、平均单株产量、标准偏差，得到优良种苗。
2.根据权利要求1所述的温郁金优良种苗选育方法，其特征在于：步骤（2）中，温郁金特异性PGRP菌株混合物通过以下方法得到：
采集当地温郁金种植地区温郁金根系土壤，置于液体培养基中，避光摇床培养，隔数天转接培养液至新鲜的液体培养基富集培养；
将富集培养液与温郁金凝集素粗品或温郁金凝集素纯品混合，摇床反应1-2h，在0-8℃、1000-2500r/min下离心5-10min，得到沉淀物；
在沉淀物中加入含有200mM 乳糖的缓冲溶液，摇床反应1-2h，在0-8℃、3000-4000r/min下离心15-30min，沉淀为温郁金特异性PGRP菌株混合物。
3.根据权利要求2所述的温郁金优良种苗选育方法，其特征在于：所述的温郁金凝集素粗品通过以下方法得到：
取新鲜的温郁金，切片，粉碎打浆，得到浆状原料，在0-8℃、8000 -10000r/min下离心20-45 min，弃上清液，得第一次沉淀物；
在pH为5.5～6.5的缓冲溶液中加入1～3%的复合酶溶液，所述复合酶溶液为纤维素酶:果胶酶=2～3:1，与第一次沉淀物以体积比5～7:1混合，混合后在常温下，低速搅拌4-6h，然后在0-8℃、2000 r/min下离心10-15 min，取上清液，然后在0-8℃、8000 -10000 r/min下离心20-45 min，弃上清液，得第二次沉淀物；
在第二次沉淀物中按1:1-2的体积比加入预冷石油醚，在0-8℃下，低速搅拌10-30min，抽滤，按1:0.5-1的体积比加入预冷丙酮，静置1-2min，抽滤，晾干，得第三次沉淀物；
在第三次沉淀物中按1:8-10的体积比加入PH为5.5-6.5的缓冲液，在0-8℃下，低速搅拌2-4h，在0-8℃、8000-10000 r/min下离心20-45 min，弃沉淀物，按1:0.1-0.3的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在0-8℃下，低速搅拌1-2min，在0-8℃、2000-3000 r/min下离心2-4 min，弃沉淀物，按1：2.5-2.9的体积比在上清液中加入饱和硫酸铵，在0-8℃下，低速搅拌3-5min，在0-8℃、8000 -10000 r/min下离心25-35min，得到第四次沉淀物；
将第四次沉淀物溶于水中，置于透析袋中进行透析至透析液中无硫酸根，冷冻干燥得到温郁金凝集素粗品；
所得到的温郁金凝集素粗品与富集培养液以浓度0.1-0.2g/L混合。
4.根据权利要求1所述的温郁金优良种苗选育方法，其特征在于：步骤（5）中，复种所用种茎为上年度株高在70～120cm、叶片长×宽在51～60cm×16～22cm之间的植株上采集的长度70～80mm一级二头、三头的根茎。
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| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Jiang Chengxi Inventor after: Luo Sha Inventor after: Hong Tao Inventor after: Ren Xianying Inventor after: Yuan Wei Inventor after: Zhao Qi Inventor after: Bao Kangde Inventor after: Qin Yuwen Inventor after: Li Fan Inventor after: Zhang Jinhua Inventor after: Guo Yueqin Inventor before: Jiang Chengxi Inventor before: Luo Sha Inventor before: Hong Tao Inventor before: Yuan Wei Inventor before: Zhao Qi Inventor before: Ren Xianying Inventor before: Bao Kangde Inventor before: Qin Yuwen Inventor before: Li Fan Inventor before: Zhang Jinhua Inventor before: Guo Yueqin |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211213 Address after: 230000 No. 19, Fenglin Road, Shuangfeng Development Zone, Changfeng County, Hefei City, Anhui Province Patentee after: Hefei future drug development Co.,Ltd. Address before: 325000 Wenzhou City National University Science and technology incubator, No. 38 Dongfang South Road, Ouhai District, Wenzhou, Zhejiang Patentee before: Wenzhou University |
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| TR01 | Transfer of patent right |