CN109338007B

CN109338007B - 海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用

Info

Publication number: CN109338007B
Application number: CN201811441274.9A
Authority: CN
Inventors: 杨秀莲; 刘华歧; 岳远征; 施婷婷; 王良桂; 华雅洁
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2019-11-29
Anticipated expiration: 2038-11-28
Also published as: CN109338007A

Abstract

本发明公开了海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用，该荧光定量内参基因为MDH、UBC‑E2和UBQ，其中，MDH基因的基因序列如SEQ ID NO.10所示，UBC‑E2基因的基因序列如SEQ ID NO.12所示，UBQ基因的基因序列如SEQ ID NO.16所示。本发明依据现有公开的基因筛选出表达较为稳定的候选基因，通过软件对其稳定性进行评估，获得3个适合于海州常山涝害胁迫下表达最稳定的内参基因，并用这些基因为基础设计了实时荧光定量PCR引物，填补了海州常山涝害胁迫下没有内参基因的现状，为海州常山涝害胁迫条件下相关功能基因的精确定量提供有力支持，可提高研究的稳定性、重复性和可靠性。

Description

海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用。

技术背景

海州常山(Clerodendrum trichotomum Thunb.)又名臭梧桐，马鞭草科(Verbenaceae)大青属(Clerodendrum L.)下落叶灌木或小乔木，较耐旱，耐盐碱性较强，也耐涝，有一定耐寒性，极少病虫害，适应性极强。现在关于海州常山涝害胁迫下基因的研究还未曾有报道。探究海州常山涝害胁迫情况下基因表达的差异的研究过程中，涉及到运用实时荧光定量技术分析和验证基因的表达水平就需要稳定可靠的内参基因，因此筛选海州常山涝害胁迫条件下稳定表达的内参基因是实时荧光定量结果准确的关键因素。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明目的在于提供适于海州常山涝害胁迫条件下内参基因，该基因能够满足实时荧光定量检海州常转录表达水平的要求，提高了海州常山基因表达分析研究的稳定性、可靠性和效率。本发明的另一目的是提供一种上述内参基因的专用引物。本发明还有一目的是提供一种上述内参基因或专用引物的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因，为MDH、UBC-E2和UBQ基因，其中，MDH基因的基因序列如SEQ ID NO.10所示，UBC-E2基因的基因序列如SEQ ID NO.12所示，UBQ基因的基因序列如SEQ ID NO.16所示。

所述的海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因的专用引物，MDH基因的引物序列如下：

MDH正向引物5’-ACCTGGAATGACGAGGGATG-3’

MDH反向引物5’-GCCACAAACGTATTAGCTCTGACT-3’。

所述的海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因的专用引物，UBC-E2基因的引物序列如下：

UBC-E2正向引物5’-GCAAAGGCTGATTGATGAGATTC-3’

UBC-E2反向引物5’-CCTCAACATTGTCTTGGGTGG-3’。

所述的海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因的专用引物，UBQ基因的引物序列如下：

UBQ正向引物5’-TGCTGTTGAGAAGGTGCTACG-3’

UBQ反向引物5’-CGAAAATGGTTGACGGGAC-3’。

所述的海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因在海州常山荧光定量中的应用。

所述的MDH基因的引物序列在海州常山荧光定量中的应用。

所述的UBC-E2基因的引物序列在海州常山荧光定量中的应用。

所述的UBQ基因的引物序列在海州常山荧光定量中的应用。

本申请通过GeNorm、NormFinder和BestKeeper这三个软件对17个内参进行基因稳定性评价，综合软件分析结果，筛选出在涝害胁迫条件下过程中稳定表达的内参基因。共获得三个稳定表达内参基因分别为MDH、UBC-E2和UBQ。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过海州常山的转录组测序库，并参考了常用的内参基因，设计出了适用于海州常山涝害胁迫下的内参基因，同时揭露了内参基因序列，并依此设计了实时荧光定量引物，不仅解决了现有海州常山检测中没有内参基因的现状，而且所设计的实时荧光定量引物用于海州常山涝害胁迫条件下基因表达分析时引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测海州常山基因时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。

附图说明

图1是琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量胶图；图中，M为DNA2000Marker，用到1-18均为样品的RNA；

图2是17个候选内参基因的Ct值图；

图3是GeNorm确定用于准确定量分析最优的内参基因数目结果图；

图4是GeNorm软件对17个候选内参基因表达稳定值(M)排序，稳定值越低，基因表示越稳定结果图；

图5是应用ClNHXl验证所筛选出的内参基因结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例所使用的主要供试材料为：采用种植于南京林业大学白马基地的泰安种源、盐城种源。采集组织材料植株插穗进行扦插，基质使用珍珠岩∶蛭石∶泥炭∶沙子＝1∶1∶1∶2，栽于培养室(25℃，60％RH)，定期浇灌养护，保证正常生长。所有胁迫处理均在人工气候培养箱(宁波东南仪器有限公司)中完成，昼夜温度及时间设定为25℃/21℃和13h/11h，湿度为60％RH，光强为10000lux。待需要进行涝害胁迫处理时，将海州常山扦插苗移栽于不含糖、琼脂、有机物及碳源的1/4MS培养基，每瓶加入150mL的培养基，每5天更换一次培养基，适应一个月。涝害胁迫时将海州常山扦插苗浸于收集的雨水中，并于处理后0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h采集嫩叶。叶片均采自于从上至下数2-4对叶片，每次采样均有三个生物学重复，样品用液氮速冻，在-80℃下保存。

实施例1

1、植物组织总RNA提取及cDNA的合成

用EASYspin Plus植物RNA提取试剂盒(艾德莱生物技术有限公司)提取总RNA，用分光光度计(METTLER TOLEDO，Switzeriand)检测RNA浓度和质量，利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测总的完整性。利用北京全式金反转录试剂盒(全式金生物技术有限公司)，按说明书进行RNA的纯化和合成cDNA第一条链。

2、内参基因的选择及引物的设计

根据文献查询其他植物中主要的内参基因并最终设计出本实施例所需的17个内参基因，分别为Actin(SEQ ID NO.1)、PP2A(SEQ ID NO.2)、RPL(SEQ ID NO.3)、PK(SEQIDNO.4)、18S(SEQ IDNO.5)、RAN(SEQ ID NO.6)、APT(SEQ ID NO.7)、SAND(SEQ ID NO.8)、PROF(SEQ ID NO.9)、MDH(SEQ ID NO.10)、EF-1A(SEQ ID NO.11)、UBC-E2(SEQ ID NO.12)、AP-2(SEQ ID NO.13)、HSP70(SEQ ID NO.14)、TUA(SEQ ID NO.15)、UBQ(SEQ ID NO.16)、H3(SEQ ID NO.17)。首先在本申请人已经获得的海州常山转录组数据库中寻找各候选基因的保守序列，根据基因保守序列用Primer Premier 5.0设计引物，再用Oligo7进行分析。引物均在南京金斯瑞公司合成(表1)，通过普通PCR初步筛选引物，利用琼脂糖胶和凝胶成像系统观察PCR产物的条带，检测产物特异性。选择条带大小正确，条带特异性好，没有引物二聚体的引物，近一步通过RT-qPCR进一步检测引物特异性，选择峰图单一，没有杂峰，阴性对照无峰的引物作为最终的引物。

表1内参基因及其对应的引物

3、内参基因引物标准曲线的建立

对每一对内参基因的引物制作各自的标准曲线，计算对应引物的扩增效率。将反转录的cDNA混合后，以5为倍数稀释成5个梯度(1、1/5、1/25、1/125、1/625)，作为建立标准曲线的模板。同时，以dd H₂O作为阴性对照模板，来检测实验过程中的试剂或者人为污染。所有的样品均做3次重复，以确保实验数据的可信度。用Applied Biosystems StepOne(Thermo Fisher Scientific，USA)进行RT-q PCR，利用得到的数据结果求得各候选基因的扩增效率及斜率，荧光定量PCR扩增效率要求所选引物的扩增效率在90％-110％之间。

4、荧光实时定量

使用Applied Biosystems StepOne(Thermo Fisher Scientific，USA)进行RT-qPCR，以叶片样品第一链为模板进行定量分析，首先将模板稀释10倍。利用Premix ExTaq^TMM(TakaRa，Japan)进行实时荧光定量，反应体系为总体积为10uL，正反向引物0.4uL、SYBR5 uL、cDNA1 uL、校正液0.2uL、超纯水3uL。扩增程序为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环，再运行溶解曲线阶段的95℃15s，60℃ 1min，95℃ 15s的分析，每个样品设3个重复，并设阴性对照。

5、数据处理

内参基因稳定性分析，利用软件GeNorm，NormFinder，BestKeeper和在线分析工具RefFinder(http：//150.216.56.64/referencegene.php)综合分析内参基因的表达稳定性。筛选出稳定的内参基因。

6、结果

1)RNA提取质量及引物特异性检测

各样品的OD₂₆₀/OD₂₈₀、OD₂₆0/OD₂₃₀均符合要求，琼脂糖凝胶电泳图检测显示28S及18S条带清晰，其灰度比约为2∶1，5S条带亮度较暗，无降解现象，满足要求(图1)。17对引物在荧光实时定量中熔解曲线均只有明显的单一峰，且电泳检测也只有单一条带图，说明所用引物可特异扩增各内参基因的相应产物，无引物二聚体，且每个待测样品扩增曲线的重复性好，模板能特异性扩增，实时荧光定量结果准确可信。

2)内参基因Ct值分析

Ct值与基因的表达量呈反比，Ct值越大，基因的表达量越低，反之，Ct值越小，代表基因的表达量越高。17个内参基因Ct值的平均值在19.41-28.00之间，其中Actin最高，PROF和APT的表达量较低(图2)。

3)软件分析

GeNorm软件分析：GeNorm软件是根据平均变异度M值来衡量基因的稳定性，软件默认的取舍值为1.5，高于1.5的基因不适合作为内参使用，M值越低表示基因越稳定。此外GeNorm软件还根据候选内参基因的配对差异值Vn/Vn+1来确定合适的内参基因个数，当Vn/Vn+1＜1.5时，采用n个内参基因个数。根据软件，计算出V3/V4＝0.140＜1.5，所以在海州常山涝害胁迫条件下应选用三个内参基因(图3)，为MDH、UBC-E2和HSP70(图4)。

NormFinder软件分析：NormFindcr软件是根据计算候选内参基因的稳定值进行评价，稳定值越高稳定性越差，具有最小稳定值的基因为最稳定的基因。MDH的值为0.151，为最稳定的基因，H3稳定值为1.703，为稳定性最差的基因。(表2)

表2NormFinder软件分析结果

BestKeeper软件分析：BestKeeper软件是基于内参基因Ct值的标准差(SD)和调节系数标准差SD(±x-fold)来评判基因的表达稳定性，直接对基因表达Ct值进行分析。SD值越小，表达越稳定，程序默认临界值为1，当SD值大于1时，认为该基因表达不稳定。分析结果显示APT、EF-1A、H3和RAN，SD数值大于1，其余基因SD数值均小于1，基因的稳定性为MDH＞UBC-E2＞UBQ＞AP-2＞PP2A＞18S＞SAND＞RPL＞HSP70＞TUA＞PK＞Actin＞PFOF＞APT＞EF-1A＞H3＞RAN，表达最稳定的是MDH，最不稳定的为RAN。(表3)

表3BestKeeper软件分析结果

排名	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										基因	MDH	UBC-E2	UBQ	AP-2	PP2A	18S	SAND	RPL	HSP70
SD	0.36	0.42	0.51	0.52	0.7	0.71	0.75	0.76	0.76
										CV	1.58	1.93	2.1	2.26	3.1	2.86	2.89	3.42	3.72
排名	10	11	12	13	14	15	16	17
										基因	TUA	PK	Actin	PFOF	APT	EF-1A	H3	RAN
SD	0.81	0.88	0.91	0.96	1.06	1.19	1.35	1.4
										CV	3.5	4.01	4.71	3.42	3.95	5.41	6.21	5.41

4)内参基因稳定性验证

综合考虑Ct值和BestKeeper、GeNorm和Normfinder 3个软件的分析结果得出，MDH、UBC-E2和UBQ是适合于海州常山涝害胁迫条件下适用的内参基因(表4)。

表4综合排名

选用ClNHXl(SEQ ID NO.18)来验证所筛选的内参基因，并用表达不稳定的H3基因来做比较，发现用所筛选出的内参基因来作为内参时ClNHXl有着相似的变化趋势，但用H3基因来做内参时，ClNHXl基因表达情况不同，说明筛选出的内参基因是准确可靠的(图5)。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用

<130> 100

<160> 52

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1283

<212> DNA

<213> 海州常山的Actin基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 1

ggaaagcaat tgcaataaat ccattccatt caaaacacaa tagcagaaca acgatgtaaa 60

aacgttcagc gcagtccaaa atactacagc gttaaggaca cgtctagaaa accataaacg 120

attttttttt ttagaaaagc aaatataaat agtacctagg cataccaacc aaaacaaaag 180

accatataaa ataacttcat gcactcaaaa ctgcaatcga actcacacgg actccaatag 240

aagcatgaat aaatgatacc attttcgccg ccttagaagc actttctgtg aacaatagca 300

ggacctgatt catcgtactc tccttttgca atccacatct gttggaaagt actgagggaa 360

gcaagaatcg accctccaat ccagacacta tacttccttt caggtggggc aaccaccttt 420

atcttcatac tactcggagc aagagccgta atttccttac tcatacgatc agcaataccc 480

gggaacatag ttgaaccacc actgagcaca atgttcccat acagatcctt cctaatatcc 540

acatcacatt tcattataga attgtaagtt gtttcatgaa ttccggcagc ttccattcca 600

atcagtgatg gctggaacaa cacttccgga caacggaacc tctcagcgcc gatggtgatg 660

acctgtccat ccggaagctc gtagctcttc tccaccgcag agctgttctt cgccgtctct 720

gtttcctgct cgaaatcaag tgccacataa gcgagcttct cctttacatc gcggacaatt 780

tcccgctcag cggttgttgt aaacatgtaa cctctttcag tcagaatctt catgaggtaa 840

tcggtgaggt cacgaccagc gagatccaat ctcagaatag cgtggggaag ggcgtaccct 900

tcataaatag ggacagtatg gctcacaccg tcaccagaat caagcactat acctgttgta 960

cgaccactag cataaagaga gaggacagcc tggatggcaa catacatggc cggcacattg 1020

aaggtctcga acatgatttg agtcattttt tctctgttcg ctttagggtt gagaggggcc 1080

tctgtgagga ggacagggtg ctcttcagga gcgacacgca gctcattgta aaatgtatgg 1140

tgccaaatct tctccatatc atcccagttg ctcactattc catgctcaat tgggtacttc 1200

aatgtgagga tacctctttt ggattgggct tcatcaccta cataagcatc tttttggccc 1260

attccaacca tgacacctgt atg 1283

<210> 2

<211> 1437

<212> DNA

<213> 海州常山的PP2A基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 2

attcccagaa actgtcatgc aagagattgt aaaaatggtg tccataaatt tgtttcgtac 60

actctcgtcg cagcctcgtg aaaacaaagt cttggaagct tttgatgtgg atgaagagga 120

acccttgatg gatcctgcct ggccccattt gcaagttgtg tatgagtttc ttctaaggtt 180

tgtggcttca ccagagacag atgcaaagtt agcaaaacgt tacattgatc actcctttgt 240

tttgaggtta ttagatcttt tcgactctga agatcccaga gaaagggact acctaaagac 300

tgtccttcac cgcatatatg gaaagttcat ggttcatcgt cccttcatca ggaaatcgat 360

caataatata ttctaccact tcatatttga aacagagaag cataatggga tcgctgaact 420

gttagaaatt ctgggtagca ttataaatgg ttttgcattg cctttgaaag aagaacataa 480

acttttcctt gttcgggcac tcattccgct tcacaagcca aagtgcatcc ctatgtacca 540

tcaacaacta tcgtattgca taacacaatt tgtggagaag gactgcaaac ttgctgatac 600

tgtcataaga ggcttactca ggtattggcc gatcacaaac agttcaaagg aggtaatgtt 660

cttgggtgag ctagaggaag tgttggaagc aactcagcct ccagagtttc agcgttgtat 720

ggttcctttg ttccgccaga ttgctcgttg cctgagcagt tcgcattttc aggttgcaga 780

aagggctctc tttttatgga acaacgatca catcgagaac ctgatcaaac aaaaccgtag 840

agtgatccta ccggttatac tccctgcatt ggagaagaac tcaagaaccc attggaacca 900

ggcggtacag agtttgacca tgaatgtccg taaaatcttc tccgatgctg atcctgagct 960

ctttgaggaa tgtttgatca aattccaaga agacgaagca agggaagaag aaaccaaaaa 1020

gaaacgggaa gcaacatgga aacgtctaga agaaatagcc gcaatgaaag cttctagtaa 1080

tgaaccggtc cttgtttctc ccaggacaag caccaagacg ccctccggct aaacatggaa 1140

ggcttcgttt gagtcgcttg aattgtggaa ttatgtattt gcccctactc atgcttctgg 1200

ttttttttgt ccggttgggt cgagcagggt gaaggaaact aatatctttt tgggggttat 1260

gatgaagcgt tgtttttgat tgtaagaaat agtgggtgta catatagaat tgtgggggcc 1320

agatactgat gcggttttag aagtgctgat gttctatggg ggaatatttg ctggcaaatt 1380

tgccctactt tcatctttag ctctttagaa tgatgttaaa attttaagtt atatttt 1437

<210> 3

<211> 1554

<212> DNA

<213> 海州常山的RPL基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 3

ttaaagcgaa gtctcactag atctgggtcg ttgtctaact gagtgataat cttatataat 60

taaccaaagc ctgcatatag aatagggttt tgagcctctg gaattttact ttgcggcggt 120

cagagtaatt aggcccaaga aactatgtct cacagaaagt ttgagcaccc aagacacgga 180

tctttggggt ttctaccaag aaagagggcc tctcgtcaca gaggaaaagt gaaggccttt 240

cccaaggatg atccaacaaa accttgcagg ttgactgctt ttcttggata caaagcaggg 300

atgacacata ttgttcgtga ggttgaaaaa cctgggtcca aactccacaa gaaggagaca 360

tgtgaagctg taactattgt tgaaacccca ccaatgattg ttgttggtgt tgttgggtat 420

gtcaaaacac cacgaggcct ccgttgcttg aatactgttt gggctcaaca tcttagtgaa 480

gacctcaaga ggaggttcta caaaaactgg tgcaagtcca aaaagaaggc tttctcaaag 540

tattcaaaga agttcgacag tgaagaagga aagaaggata tccaagccca gttggagaaa 600

atgaaaaagt actgcactgt tgttcgtgtt cttgctcata cccagattcg aaagatgaaa 660

gggcttaagc agaagaaagc ccacttgatg gagatccaag tcaatggtgg cgatgtagct 720

aagaaggttg actatgcata cagctttttc gaaaaacagg tccccattga tgctgttttt 780

gggaaagatg agatgatcga cattatcgga gtgaccaagg ggaagggtta cgagggcgtg 840

gtgacccgtt ggggtgtgac tcgactccca cgcaagaccc accgtgggct tcgcaaggtt 900

gcctgtattg gcgcatggca tcctgctagg gtttcattca ctgttgctag ggctggacaa 960

aatggttacc atcacagaac tgagttgaac aagaagatct acaaattggg caaggctggt 1020

caagagtctc actctgccat gacagagttt gataggaccg ataaagatat tacaccaatg 1080

ggagggttcc cacactatgg tgtggtgaag gatgactatc tgttgataaa gggctgctgt 1140

gtgggaccca agaagcgcgt cgtcacattg aggcagtctt tgttgaacca gacgtctagg 1200

gttgcgttgg aggagatcaa actcaagttc attgatacgt cttctaaatt cggccatggc 1260

cgcttccaga ctatggacga gaaagctaag ttttttggca agctcaaggc ttaaaatgac 1320

gtcgattggg tggggatata atggaatcgg tttttatcgt tcattttcct ttataacttt 1380

gttggtttgc cttttttccc ttgtaagctg caggtcttga aatcgtccaa agaactttaa 1440

atagattttg catttgtgtt aaacctgtac cctgcacaat tacaatcatc tacatgttct 1500

catttgcgtt cataagatgc atgtactggt aaatggctat acttaattaa gatg 1554

<210> 4

<211> 1758

<212> DNA

<213> 海州常山的PK基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 4

agtgataaca gtaatctcct aaagtctcaa tcccatacca caagtaccca ccacttccaa 60

tctctctcct ccaattacac tctctcttcc acacatactc acgcactttt ctgagcgagg 120

cgcccacaca ttgaacacag tgagaatggc gtccacagct gcatcatcag ccttctgcgg 180

catccgcaag gcatcgaccg ccgctgccgc caaggcttct ctcaatgccc ctaccaccta 240

cttcctcccc aaaacccccc tccgccgcct cggattcgcc gccggagccg ccgaaccgat 300

cctatctcac catgtcgcca ctaagatgcg atcatttggg aattccggca aaccaattag 360

aggcgtggcc tccatggcga agaagagcat cggagacctt ggtgctgctg acctcaaggg 420

caagaaagtc tttgttaggg ctgacctcaa tgtgcctctt gatgacaacc agaatattac 480

tgatgatact aggattagag ctgctgtccc gacaattaag catctgatta acaatggtgc 540

taaagtcatt ctttctagtc atttgggacg accgaaaggc gtcacgccaa aatacagtct 600

ttcacctctt gttcccaggc tatctgaact tctgggcatt caggttgtga aggccgatga 660

ctgcattggt ccagaggttg aaaaattggt cgcttcactg cctgaaggtg gtgtactcct 720

gctcgagaat gtaaggtttt ataaagagga agagaagaac gagcctgagt ttgcaaagaa 780

acttgcctcg ttggctgatc tttacgttaa cgatgcattt ggtaccgcac acagagcaca 840

tgcctcgact gagggagtca caaagttctt gaagccctct gttgctggtt tcctattaca 900

aaaggagctt gactatcttg ttggggcagt ttcgaaccca aaaagaccat ttgctgccat 960

tgttggtggt tctaaggtct cctccaagat cggagtaatt gaatcacttc tagagaagtg 1020

tgatattttg ctattgggag gaggaatgat atttacattt tacaaagcac aaggactttc 1080

agtggggtcg tctctagtag aagaagacaa gctaaatcta gcaacatcgc tccttgagaa 1140

ggcaaaggcc aagggggtga gcctcttgct gcccactgat ttggttatag ctgacaagtt 1200

cgctcctgat gctaatagca agattgtggc agcatctgct attccagaag gatggatggg 1260

attggatatt ggcccggatt ctataaagac attcagtgat gcactgggga ctacacaaac 1320

tgttatttgg aatggaccga tgggagtgtt tgaatttgac aagtttgctg ttggcacaga 1380

ggcgattgca aacaagctag cagaacttag tgggaaggga gtgacaacaa ttattggtgg 1440

aggagattca gtagcggcag tggagaaagt tggagttgct aatgtgatga gccacatatc 1500

gactggtggt ggtgccagtt tggagctctt ggaaggcaaa gaactgccag gtgttcttgc 1560

ccttgatgaa gccacgcctg ttgccgtgta gtgtgtaaaa aacaccattc ttctcgatta 1620

ttttaacacc catctctaat aatgtctcat tactagcttg taaacgagaa atttcttggt 1680

atacgtggtc atgctataga tgttttacct tgcctccttt tcttgtcatg ttaatatcac 1740

accatggaat ggatccgt 1758

<210> 5

<211> 1308

<212> DNA

<213> 海州常山的18S基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 5

cgaatgctgt taaatttgaa tggtttaaat aaaaacatat taagagagat tacgcaagct 60

taaatctctg gcaacaatca actttcctcg aataattgta aagggtgaag aagaaaaaaa 120

aatcaaaaag caaaggccaa aatttggtat gaatagcaag tagcaacaca agcaaatttg 180

cttgtgtgga cctaacatct tctgtgccac aatttccata attggatcgc ttgcgcgact 240

atagagattc ttattagaac cgagcttttc ttttccgagc agtgtatttt gaatctggtg 300

gcactatatt cccctttctg cgcatttgtt ccttcttacg cagaacccat tctttcccct 360

tcaccttctt gtttagtttt tgccttttcc ttgctctctg ccggtctgat acaaaaactg 420

tctgttcttc atcatcactg ctatcttcat cagaactctc tccatcttca cctttcgcct 480

ttggagtcgc actactcaga gatggtgggc cacaagtgag cacgaggtat tctttcctcg 540

atttcgtact gttaccaaga agaagtatta cagttaacgt gacaacttat cagaactcca 600

gtgcagggaa gttgattcaa acctccaagg aatttacaag aataaaaccc tatgcggata 660

atcaactact acaccaccag aaaacccagc acgcatagca aatcccaaga tcagctcacg 720

ttgagccaaa ttttcaggat atacctgtag cactgcccta gctcctcgtg ctaaacatct 780

gtataatgac ccaaagaagg ccttcagtct caagcgtggc tcatgagaag atttgtcagc 840

attgcataac cactgaacag ctgagatact tattgcgcca tcaataactc cagggcgaag 900

ccctaagccc tgacccatgt caccaagtat aaggtcaccc tcagcttcac gctccaatgc 960

aatatctagc attgatcctg atatatctaa accgatccat tggtgcccat ttccagccaa 1020

tgtctcccca ctaagtccag atccacaacc gatatcgaga agtaatcttg gaacgccatc 1080

atcaggcaaa gcgagaagct ccaatgccct ctcggaaagt ttagcctgaa tttcgatgat 1140

acgagaagaa gaggtgtact tacgagcttc ctcgtcgtta taaaatatct caggcggtgc 1200

ttgtagctct ggtcgagagg ccattgtttc tttccttgtt cttcgaaaca gtactcagag 1260

ggtggctgaa ggctgctttg ttcggtgatt gtccggtttt gtctgatg 1308

<210> 6

<211> 2008

<212> DNA

<213> 海州常山的RAN基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 6

ccccaacatg tgggacccat aaattagaat atgcatacga agtaacagtg aattaccaaa 60

agtaccctca gctgatacat aatgcaaaat aatcaaaagt agagagatca agggcaaaaa 120

tgtcacataa aatcaaacac agcacacttt tggcaagcag ttggcttcag gcttaaacag 180

cgccatctcc tgctcaaatc tagcagaccc accaaagaca tcaaactaaa acctaatgat 240

ctaaatgaca aaactatctt aatctttgtc ttcttcattg acatcaagat tcttgagctt 300

cttttccaat tcatcctgac taccttcgtc ttcatccccc ttgtcgtcaa aatcgtttcc 360

ttcagggtcg ttctcatcca acggcccaag tttctcagga caatctttaa agattatcct 420

caactcatcg agatcttcct cagaaatgaa gttcccgttt acatccaata gcttgaaacc 480

aggcaaacga accaaagcca gagccaactt cttaaccgag gtagttagtg agttctggct 540

catatcaact tccctcaatt gctcttgccc atcttcaaat gctttgctta tctgaatcgc 600

accttcatcc ttaaggtcat tctctgagag gttcaacttg acaatagttt tctttctaga 660

gatgcaggcc gccaagctag gagcagcttc agcagttata tcatttccag ccatctccaa 720

tactgcaagt gatggtgctg actccttgag agcgtcggct attgctattg ctccatcatc 780

ttcaagattc gagtagctta aataaatctc agttagattc ccatgtttgg agagagcgtc 840

gcttagcttc aaaccagcct ccactccaaa catattgtcc cgaagatcga ttttcttcag 900

attcttacat aattccaggg cttcagtcaa cgcaacgcct ccttcagaac caatacgggt 960

agatgagcat cggaaatcct ccaataaagg gcaacgtttc agtatctcgg aaatggcaat 1020

agcgccttca tctcctgtca tattgttatg aaaatggagg attctaagcg aatctgtaga 1080

aggaaccaac tcacaaacag cttgtgcggc ttccttcgat atcccatcat tcatcagata 1140

aagttcctct aagctagtct gagatttcaa gagcttcccg aatgctctga ctcccttctc 1200

acctaaggca ttatcggaga tattgagata tttcaaatga gaaccttcta gagcttcaga 1260

gaagatcttc atgacatcaa gagcttctgc ttctggtcgc cccgcaacaa aatcagacag 1320

atcgacttcc ttcagttggt tcttgattga cgccaagata ggtccagcaa cattggctgc 1380

cccaagacca aagcttcgat tgctaaagca aatcttggtg taagaattcc caggttcttt 1440

caaggggctt aaaagtgttt gagcctcatc tgcttcaata aatgctcgct gacccttgga 1500

aatatcgaaa aatgtctcct gcaaaaccga attgacctca gatttcagta cctgcttttc 1560

ctctgtccca gagcctccct tgagaacatc cagtattagc ttgctgcatt ccttggcata 1620

ccattgtaca gcagaactgc catcaccatc gggttcttgt tcataatgct gatttgccga 1680

agaaaatgct gattcttcaa tttgtttggc atgttttgaa gcctcagctt gactaagagt 1740

gccatacttg cgggtgaaaa ctgttggcgt cgagagattg tttgtcattc gctctacaag 1800

catcaacctc gtgttctggc tagggggcca cagtttaatg gttatgtgcc ggcgttctcc 1860

atttggtgtt ttagcatcca tcgcacccaa actgtcgtct ccttcctgac gaatttttca 1920

atttgcagct cttcggactt cgactgtgta ctgcctgtgt atgtataggc aagaggggag 1980

aagtgaagga aaactaaaat gaaatgag 2008

<210> 7

<211> 1149

<212> DNA

<213> 海州常山的APT基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 7

aaaatctaga gatttaggca aatccattag aaaacaagca tcctgtcttc aattgattct 60

aaaaatccca ctaatgtacg ctgtatctgt atctaagcca tctctctccc tatcaagtga 120

tgtcattgat taaacaaatc ttgagtttta ggcaaatcca ttagaaaaca agcaccctca 180

tggacttcaa aaatcccact aatgtatgct gcatctgtat ctaagctatc cctcaaactc 240

ctcaaggcta gagttgtctc accaaagtac ttgcgcagtg ttaatttctg cttacctcac 300

accgtagcga acactccgct gacctacgtc ggatcaattg gtggcgcagc cgtaccgaaa 360

cgtcggccgg tgttcgtttc aaacatggca tcctcaaatg ctgaaagcat tgatgagcgc 420

atccggcgga ttgcctccac gattcgggtc atacccgact ttccaaaacc tgggatcatg 480

tttcaagata taacgacgtt gttgcttgat cctaaggcgt ttaaggatac gattgatttg 540

tttgttgaga gatataaatg ccaaaacatc aatgttattg ctggtgttga ggcaaggggt 600

tttatattcg gtcctcctat tgcattggct attggtgcaa aatttgttcc tatgaggaag 660

cccaaaaagt tacctgggga agtaatatca gaagagtact ctttggagta tggaactgac 720

ataatggaga tgcatgttgg agccgtacaa cctggggaac gtgcagttgt tgtagatgat 780

cttatcgcaa cagggggtac cttgaatgct gctattcgcc tacttgaacg cgttggagtc 840

catgtggttg agtgtgcttg tgttattgaa ctggagggac tgaagggtcg ggacaagtta 900

ggggagaatc cactgtttgt tcttgtgagc tcaccttgaa gaaaagagta tctacaacaa 960

caataaattg ctgttaacat ctgtatgagt tgatagcatg tgcttgttcc tttctatggg 1020

atatacacat ttcaaatgga tgatggtgtg ttgtatgttg agtgaaattg cttttctttt 1080

ttttttggat gagtcatgtt caggccaccc tctcctgctt gcggattgtt actcaacctg 1140

tcaaataag 1149

<210> 8

<211> 2473

<212> DNA

<213> 海州常山的SAND基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 8

gtaatttgtt tctgtctccg ccatccgtga ctggcagatg cgagtgcgac accatcactg 60

aacttcaaat gttttccttt aaactctaat ttcttagcga ttatccaatc caattctcgt 120

tcgggattgt agattgattg acaatgtctt ccaattcaaa tatttcatct gcgagttcct 180

ctactaatgg agatgacggg aaccctaatt cgtatacaaa aaaggagccg gagaatctgc 240

cggaacccgc actcaacacg agtccggact tgatcgacca gtcgcttgat gcccttgaga 300

atcaattggc ctcaatatca atgtcctccc gttccccgac ggcgactctt gacgatgaag 360

agttcgtcga agaagaagag cagtacctgg agcatccaac aatcataaat ggatcgttga 420

gtgaagaaaa tggagccgga ggatcaagtg atgagcatat tgagtgttat ttgaagggag 480

agtcttcggg agtgataaaa gagaccttgt cctctgtgtg gaggaattat ttagaggcag 540

atgaagttga gcggccgttg agtccgacca gcagcggcta cgctggtgag atggggagca 600

ccagcggcgg tgatgaaatc aatgatgatg acgaagatat taatgaaatt aaagaggtcg 660

aaaacgactt tgtttcgggg tcccatgatc agtgggtttc aggaaaacgc cacccagatg 720

aggatgatgc ttccgtttct tggaggaaaa ggaagaaaca tttctttatc ctgagtcact 780

ctgggaaacc catatattcg agatatggag atgaacacaa gctagctgga ttctctgcaa 840

ctttgcaagc cattatttcc tttgttgaaa atgggggaga ccgggtcaaa ttggttagag 900

ctggtaaaca ccaggtgatt tttcttgtga aaggacccat atacttggtt tgcataagtt 960

gcacggaaga accttatgaa tcactaaaag accagatgga gctactctac ggtcagatga 1020

ttctcatctt gacaaagtct gtaaatcgtt gttttgagaa gaatccaaag tttgatatga 1080

catcattgct ggggggaact gatgctgtct tctcttctct catccattct ttcagttgga 1140

atcctgccac ttttctacat gcctactcat gtcttcccct tgcttatcca acacgtcaag 1200

ccgcaggtgc catcttgcaa gatgtagctg gttcgggagt cctatttgcg cttttgatgt 1260

gtaaacacaa ggttatcagt cttgttggcg cccaaaaagc atctcttcat cctgatgata 1320

tattattact gtcaaatttg ataacgtcct ctgaatcttt taggacatct gaatccttct 1380

caccggtttg cctgccaaga tacaatccca tggcatttct ttatgcttat gtgcattact 1440

ttgatattga tacatacctg atcttgctca ccacaagttc cgatgccttc tatcatttaa 1500

aagattgcag gattcgaatt gaaaacgtac ttttgcagtc aaatgtactg agtgaagttc 1560

aaagatcctt ggtggatggc ggtatgcata tagaggattt gcttgctgac cccacatctc 1620

gtcctggatc cgtttcttct catttaggtc aaccagggcc tggtacaggt tccccggggc 1680

gacttacaga tggatttgtt ggaattggtg gtccagctgg gctatggcat ttcatataca 1740

gaagtattta tcttgaccag tatgtgtcat ctgaattttt atcaccaatc agcagcttga 1800

gacagcaaaa aagattgtat agagcgtacc aaggacttta tgcatccatg catgacaaag 1860

gaattggacc tcacaaaact cagtttagaa gagatgaaaa ttatggtgac atttactaaa 1920

gcaaccaaat tcttcaatta tatgcaagac tggaactctg gaagatagtt tacatcgaga 1980

ttctatgggg tagagccata aattgaagcc atgctactct gctgggtcac acaagatttt 2040

gaactatatg cagcatttga tccactagca gacaaggcac ttgctataaa ggtgtgcaac 2100

cgggtttgtc aatgggtgag agacgttgaa aatgaaatat ttttattggg agtaagccct 2160

ttttcgtggt gattatctca agtattctgt acactggcat gtattctagt ctttccgttc 2220

gactattact taactaccgc ttcctatatg aaattttgcc ttatttttgt tgtacggcct 2280

ctatgttggt ttgcagttcg gatctctatc ctattttttc ttcaccactt gtatctaact 2340

ataaaaacga ataaattgaa gttctatagt gagcttaatt gtagttgttg taattggatg 2400

tttataaaaa ggtaacgttt taacagtgag acataagtgg tatatgggga agtatgattt 2460

tagaggatac cga 2473

<210> 9

<211> 1456

<212> DNA

<213> 海州常山的PROF基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 9

actaacttga taccaatacg cttgcgatta attgttatct ccgccgagag agaagctctc 60

gcatctttct aagaaagaaa ttttcacttt agatctattt gttttcactc tccatcctca 120

cctccctatc tttccgacgt tgaagtctct tcctcacttc ttgatcctat actaactcca 180

gtttctacat ttgaaatgaa gatggaagat ctttttaggt ctagacgcaa ccagagttgt 240

gtgacagcag cagcggcaag attagggcga ctgcagaagg tggatgtagt tccaccatgg 300

cagtgaccct tgatgtgtgt atttccaaat tttctttagt gtagttttac gttgttttca 360

tgttcatcct cgatctggac tggttctcaa ggtgctagtt ttagggtgct ttatactagc 420

tagtcaagtt gggacagtga cctgaatctc tctctaccaa tgtccttgaa tagggttttg 480

gtccggtcaa gctttcttta ttttgtctcc tttagtacga gtggtttttc ttccatcttt 540

gggattgacc gttcattttg tacatttagt cagttggcta tgtattccac atgtatgtga 600

agttttgggg gaagaagata actaagggga aaaaatttca aagccaattc tgtatttgta 660

aagatgtcca taaaatttga acatctatca gagaaccaac caaaaataca taatttactc 720

acatggaatc ataaacccaa gttttcacaa cgagaaaatc aaaagacaag ccctgtttca 780

attcagatag ggacataatc taacacctct cactcaaaac accacattct ttttgccata 840

accaacaacc cacgctgcaa atcattgaca aaaaaagcag taaaggatgc cgaatttaat 900

aatattaccc aaaaaattat taatttataa ttatataatg aatattgatt attaaatgaa 960

atgatttgga agacttacca atcaatttca gacaccctgt tcaataagat agtcaccaat 1020

cttctcaaca accatgttgc actggcctgc agtcattggt tcatcataga taccgatgat 1080

caaggccaaa ttggtctttt tgacagtggc accaccagat cccttcttcc ctcggatgac 1140

agcatttggt tcaccttgaa tcaccatgta tttagtaccc ccaatgtaca atccagtagg 1200

agctaatgat cccggattat caaaatcatt cataatagct gttacttcct caggcttgaa 1260

ctgagggaag ttggaactct gtgcccaaac gctgccgtca tgaccgacaa ttgcggcgga 1320

ggtgagatgg caaccgtcga cgtcggccat caagtggtca tctatgtagg attgccacga 1380

catcgtttcg ataggcggaa ggaatcaata ccaggaaggt ttggagaatg ggtgaggact 1440

gatgatagcg tgaaaa 1456

<210> 10

<211> 1516

<212> DNA

<213> 海州常山的MDH基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 10

tttataagaa ttggtaacat ccattggtat atgatattta tctgtcagca aacgggttca 60

ttacatatct agaattgcaa taaccagaac aactcacgta gcataaggta caacatacac 120

taccgcttat tccaagatgt gtgatcttga atctccaaga ttatttcctt acgaaggaga 180

cccccttatc aatgcttcca tccaactctt tctttgcctt ctccagccca accctttcgt 240

attcatttag tggaccaaga gggaagatct cctcgacccc gttacgtcca agccgtaccc 300

ttgaagcaaa gaatggaagt tccgttacct gggaagaaac aaatgcacat tcaacaacac 360

cggaatctcc cctcaagccc ttcaggcaag catcggcaaa tttcactgct gcatatgcca 420

tggaaagagt tgcagagcct gtacccgctt tggcctcaac aacttcagtc ccaccattct 480

ggatgcgaga tgtcagatac tcagtttctt ctttggtgaa agagcatgca ggtgtaatct 540

gcgagaggag aggtaaaatt gtcacaccag catggcctcc tacaactgga acattaactt 600

cccgaggatc tagccccaaa acttcagcca caaacgtatt agctctgact acatcaagca 660

tcgtgactcc aaggagtcgc cttggatcgt aggtcccagc cttcttgaaa acctctgcag 720

caattggaac tgtggagttc actggattac ttattaagtt aacaatggcc ttagggcagc 780

acttagcaac tccttcacaa agtgtcttta ctattcctgc attaatgttg aaaagatcat 840

ccctcgtcat tccaggtttc ctgggaacac cagcaggaat gattacgagg tccatgccag 900

ttagtgcatc cttcaactgg ttttgaccca gaaaaccacg taccacagca ccagtgttca 960

tatggctgat atctgctgta accccaggag tattaactac atcataaaga tgaagcaccg 1020

aaaccagtgg gttcatcttc atcagcattg ctaaaggctg gcctatgccg ccagctgccc 1080

ccaataccgc caccttgaaa cctggtgacc ctccttttgc tcggcaatcg gaaagccata 1140

aactcccctc cacctgcagc tgattagtag gaggatcgag gtgagctgaa attctggaaa 1200

ttcttcgatg aatatcccca ccctgctgca tactataact cgaacgaatt cttctccaat 1260

atcagaaagc agcaaattcc ttttggaata atgagaaatg aaatgatgga agataacttg 1320

aacggcagaa tagtggagat acccgtattt atacggtaga aaattggaat taattgtatt 1380

ttatggcaca gcacataata aaataaataa atacgtcaga ggctcataga aatgcgttaa 1440

tgtatttttg ggtgcatagc cttatcttat acgtacacgc ttcggcaaga aaattacaaa 1500

ttatcaccat aattca 1516

<210> 11

<211> 1351

<212> DNA

<213> 海州常山的EF-1A基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 11

gaaattcgag accaccaaat attactgcac agtcattgat gcacctgggc atcgtgactt 60

catcaagaac atgattactg gaacctcaca ggctgactgt gccgtcctca tcattgactc 120

cacaacaggt ggttttgaag ctggtatttc caaggatgga cagacccgtg agcatgctct 180

gctggctttc actcttggtg tcaagcaaat gatctgttgt tgtaacaaga tggatgccac 240

tacaccaaaa tactccaaag caaggtatga tgaaattgtg aaggaagtgt cctcttacct 300

caagaaggtt ggatacaacc cggacaagat accatttgtc cccatttctg gttttgaggg 360

agataacatg attgagaggt ctaccaacct agattggtac aagggcccca cgctactcga 420

tgcacttgac cagattaacg agcccaagag gccaacagac aagccactcc gtctcccact 480

tcaggacgtt tacaagattg gtggcattgg tactgttcca gtaggccgtg tggagactgg 540

tgttctaaag cctggtatgg tggtcacctt tggcccgtct ggtctcacca ctgaagttaa 600

atcagttgag atgcaccacg aagccttgca ggaggctctt ccgggtgaca atgtcgggtt 660

caacgtcaag aatgttgctg tcaaggatct aaagcgtggc tttgtggcct ccaactcaaa 720

ggacgaccct gctaaggaag ctgcgaactt cacctctcag gtcatcatca tgaaccaccc 780

tggccagatc ggaagtggct atgcacctgt tctcgactgc cacacctccc acatcgctgt 840

taagtttgct gagttagtca ccaagattga taggcgttcg ggtaaggaga ttgagaagga 900

gccaaaattc ttgaaaaatg gtgatgctgg attcgtgaag atggttccga ctaagcctat 960

ggttgtcgag actttctctg agtacccacc tctgggtcgt tttgctgtac gagacatgcg 1020

acagactgtt gctgttggcg ttattaagag cgtggagaag aaggacccga gtggtgctaa 1080

ggtgaccaaa gctgctgcta agaagggtgc taagtgaacg ctggtgactc cgttttatca 1140

ataaattttg tttttataat gcagtttatg attaatgatt attgctttta ctgctgtatc 1200

tctagcctct tgtaagagga tattggagag tggagcaact tggttttgat tcttgttgct 1260

tcatgtgcag tgatgaaagc agctctgttt ggatattgtc aaatttttat tttccttgtg 1320

gattttgttt tcttgaaatt gttacttagt g 1351

<210> 12

<211> 1214

<212> DNA

<213> 海州常山的UBC-E2基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 12

aaattgtttt gcaaaaacct cgattttcat agtactcgtt cgtcggtgtg cgatctgagg 60

agatggcgga agataagtat aacaggaaga accctgctgt gaagaggatt ttgcaggagg 120

tgaaagagat gcaatccaat ccttccgatg atttcatgag ccttcctctc gaggagaaca 180

tatttgaatg gcagttcgca ataagagggc caagagactc ggagttcgag ggaggaatat 240

atcatggaag aattcagttg cctgctgaat acccctttaa gccaccttca tttatgttat 300

tgacgccaaa tggtagattt gaaacccaaa ccaagatatg cttgagcatt tcaaatcatc 360

accctgaaca ctggcaacca tcctggagtg ttcgaactgc gctggttgca ttgattgcat 420

ttatgcctac tagcccaaat ggtgcgctag gatctttgga ttacacaaaa gaagagaggc 480

gagctcttgc agtaaaatct cgcgaagcag ctccaaaatt tggatcacct gaaaggcaaa 540

ggctgattga tgagattcat gagtatatgc tcagcaaagc gctgcctgtg cctcaaggca 600

acctcacctc tgaagcacac actgggagtg aaaaaatcca gcagaccacc caagacaatg 660

ttgaggaagt tacagaagca cctccccaca cagctgaaga cgacgggatc atacaagaac 720

caagtgaagc agtagcacct tctactaata caaatgttgc tcagacatcg cagcctgttc 780

ctcccgggcc gacgacgagc cagcagcagc tgttgcataa gcccgaacca agggttccta 840

aaccagcaga tgatcgtctc ttcacatggg ctgctttcgg gctcaccata gctatagtag 900

ttcttctgtt gaagaagttc ttgaaggcta atgggcacgg tgctgtcttt atgaatgagt 960

cgtaagtggg acctggtatg ttgtttatgc tgatgcagaa ggtgaatgag gggaaaacct 1020

gctttctgta atggagtgcc ttaaatttta aggggaacat atctatatat atattatacg 1080

tatacttatc tttctactta tggagtatat tgtatagttt aaataattgt taggggtaat 1140

gttctgaagc tttttaagaa gctgaactat tttaatagaa gcagttctgt aattattgct 1200

tgcatttgtg agag 1214

<210> 13

<211> 2673

<212> DNA

<213> 海州常山的AP-2基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 13

ttaatcaccg atgtcttcag aaccaatacg caactaattg acaaacagat gctgtaattg 60

ttacaaaggg tgcagttttc attatgtcac ttgcattaca gaaaccaatg aagaagggtg 120

tatttggcaa gcgctaaata aagaggaaaa aaaatctcac caaggcacaa tctgattgtg 180

cgaaagaatt atcaaaactt caaatccaaa ttctaacact atgccgatta catacaaaat 240

tacaaattca ccctccgact cccccagctc ttgcaccata ttagcgggga tccctccagt 300

acatacgagc aggtgctata tgaacattgg ttaaacaatt ttgaacagcc ttgggtttgt 360

tttatcactc aaagcaaacc agcaagaata gctccaggat ctgatgtaga tgtaggtgga 420

ggcgttagtt gtggttgtgg ttgaggttga ggttgaggtt gaggttgagg tggcgtaggt 480

gcaggtgctc gagaagggat gggaatggtg attaattgtt ctttaatgaa ttctttcaat 540

tcgtatgtta gttttggatc tccagatgcg atggtcatcc gtaattgcgt tctatctgct 600

gggtctgtct cgattcttat caaacataac atggctcgtg tactttcaga gtagaaagtt 660

gtgctcgcaa ccaaattatt agcatttgga tcaagcccag ggcaaaccat caggtgcaaa 720

ctgctaaata agtttgccat ctctgctagc agcattggtc ttacacctct aaccacttct 780

tgcagtttca atggaggtcc tgatagtgat ctccattgtg ggaaaaattc ttcagcagaa 840

actgtaattg actgaagaaa tttgttcaaa acagcaggaa ggcgaagttt tacattgacc 900

aaatgggttc caaacttgta cgagaagtcc agtactgcta aatctctgct cggttggagg 960

atgattactt caagtgggca ttgaacctgt gcccttggag gaatagtctc aggtactaaa 1020

gatagttcca tctttagatg tgatggaggc aatattaaag cttgaactga aacgagtgga 1080

gcagtatttt tatttcccaa gaagagaaca actcgcccat gatgggttcg ccattcagct 1140

tttatgccaa tctggatata ggcatcttca tatagcacac cactatcctt caggcacaaa 1200

acacgaaatc tttccactat atcaccaatc ggctggaccg tattaacttg ctcttcaaca 1260

ggtgctatgg ctaatgcatc tgtttccaaa ccggaagcaa cccttggatc agtttgggga 1320

gcaatgcctg gtgggccctc aatagccagt ggccctaaaa gatctccaag gagatcagga 1380

gaaggtgcac tgtgtggttg aggatccact acactcaggg caccattagc acgagtcaac 1440

ccttgctcag cagtgctctg atccgcatta ctcatactag gcaccttgac aagaccaagc 1500

tgggtcccag atggtgttcc atttgcaggg cgttgatgat cggtaagtac caaagcatta 1560

gaattctgct gctgtgcccg taattttatt gcactttgct cagcagtatc agcttcagca 1620

tcttccgctt tttttatcaa tgatgactgt ctctcaggga atttcggcat ttcagcaagt 1680

atatccacta gagcagcacc tttcatgctc agagcaagat actcaacagc tcgttgctgt 1740

atttcagcat caatgcaact ttcatacttt ttgaatatca cccatatttg cttctgtagc 1800

tcctggctgg gtggttgagt gtgcatcaaa atttttgcat atgtggaaag aaggatagga 1860

attgttgatg tcgagacagt gggaagcttc tcatgtatca agttgaaaat ttcctttgga 1920

ctgcacccag gtcgcctagc tagaagatga ctgtattctc caaggatata tgcactcacc 1980

ttcaccatgg tctcgtgaat cgcaggctta tcaagatact ctttggcttt cagagctgca 2040

taaggctgta aatcctcgtt gtttgtaacg aactgcacga ctcgaaacca aatgtcatca 2100

ccgacaaaat cccctgcctt gtcaattagc tgaagaatca catccacata ccatgacagg 2160

tcgggggcaa acttctctgc gagaatagca gctttaagtg acaattcttc ccgcatagca 2220

aagtcagctg agctcagata ctgtaataat tcttcaacta tgtcctttgc atttgaaaca 2280

tcacacattc catatagcaa atcaagggca cgccttctga tactgatatc aggatccttc 2340

agggaagtaa tgatctgagc ttgatgtctt ttgataattt catgcacatc ggcgaccatc 2400

aacattcgag tcatgttctc caagccaagg tatcgtatat taggttcacg aacagcaata 2460

aattttccca gcaaagcaac acactgagac atcatttctt tctctgcatc aagatgcatg 2520

acaagagcaa gagcttcaaa aagaacagca tgtgatgcat tattcttgtt cacatttttc 2580

accacatcag ttcccatgag tatccgttgc agaacctcaa acaatgatct tcttgtattt 2640

ggatcctcaa ctgttggaaa atactggaga gcc 2673

<210> 14

<211> 2071

<212> DNA

<213> 海州常山的HSP70基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 14

tgttagtttt atttcattat tgttctttga cttgagcaaa attctctggt cgatttagat 60

ctgcgattag ttttgcgagc aatggccgga aaaggagaag gtccagcgat cgggattgat 120

ctcggaacga cgtactcttg tgttggcgtt tggcaacacg accgtgttga aatcatcgcg 180

aatgaccagg gtaacagaac gacgccgtct tatgttggct tcaccgattc agagaggctt 240

attggtgatg ccgctaaaaa tcaggtcgcc atgaacccga cgaacactgt ttttgatgcc 300

aagaggttga ttggaaggcg atttagcgat gcttctgttc aaagcgacat caaactatgg 360

cccttcaagg tcattgccgg acctggtgag aaacccatga ttgttgtcaa ctataagggt 420

gaagacaagc agtttgcagc tgaggagatt tcatctatgg tcctgatgaa aatgaaggaa 480

atagcagagg cctaccttgg ttccacaata aagaatgctg tcgtcaccgt tcctgcatac 540

ttcaacgact cccagcgtca agccaccaaa gacgctggcg taatttcagg tctcaatgtt 600

atgcgtatca tcaacgaacc tacagctgcc gccattgctt atggtcttga caagaaggcc 660

tcgagtgtag gtgagaagaa tgtcttgatt tttgatcttg gtgggggcac ttttgacgtc 720

tctctgttga cgatcgagga gggtattttc gaagtgaagg ccactgctgg cgacacccat 780

cttggaggtg aggactttga caacagaatg gtgaaccact ttgttcagga attcaagagg 840

aagagcaaga aggatatcac cggtaacgct agagctctac gaaggctgag aactgcttgt 900

gagagagcaa agagaaccct ttcatccaca gcccaaacaa caatcgagat agactctcta 960

tacgaaggaa tcgatttcta ctccaccatc acccgtgcaa ggttcgagga gcttaacatg 1020

gatctgttcc gcaagtgtat ggaaccagtt gagaagtgcc tgcgcgatgc caagatggac 1080

aagagcacgg tgcatgacgt tgtgctcgtc ggtgggtcca cccgtatccc caaggtgcaa 1140

cagctgcttc aggacttctt caacgggaag gagctttgca agagcatcaa cccggatgaa 1200

gccgtggcct acggcgccgc cgtccaagcc gccattttga gtggtgaggg taacgagaag 1260

gttcaagacc tattgcttct cgatgtcact cccctctccc ttggtttgga aactgccgga 1320

ggtgtaatga ctgttttgat tcccaggaac accaccattc ctactaagaa agagcaggtg 1380

ttctctacct actcggacaa ccaacccggc gtcttgatcc aggtctacga gggtgagcgt 1440

acgaggacga gggacaacaa cctgctcggg aagtttgagc tctccggcat tccccccgcc 1500

cctcgtgggg tcccgcagat cactgtgtgc ttcgacatcg atgctaacgg cattctaaac 1560

gtgtcggccg aggacaagac gacgggccaa aagagcaaga tcacaattac aaacgacaag 1620

gggaggctgt caaaagacga gatagagaag atggtacagg aggcggagaa gtacaagtcg 1680

gaggacgagg agcataagaa gaaggtggaa gcgaagaatg cgctggagaa ctatgcgtac 1740

aacatgagga acacggttaa ggatgaaaag atcgggtcga agctgcccgg tgctgataag 1800

aagaagattg aggatgcggt tgagtcgacg attcaatggc tcgatgggaa ccagctcgcg 1860

gagtcggatg agtttgagga taagatgaag gagttggagg gcatttgtaa cccgattatt 1920

gccaagatgt atcagggtgc ggggggtgcg gcggctatgg atgacgatga cggtctggcg 1980

gcggcgcctg gtggtgctgg tcctaagatt gaagaggttg actaagttgt ggcccctttt 2040

ttggtggttt tttttttttt tttttttttt g 2071

<210> 15

<211> 1802

<212> DNA

<213> 海州常山的TUA基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 15

atctgagccc tagagagaga aagtgaaatt acaccttcat tttctaccaa ctgctcttat 60

aaaatcccct ttcaccacga attaagaact acctattttc atccagagac gtcttcgtat 120

acgccctggt atttctctcc tttgatctcc gatcgaaatc catttcagat tttaatcttt 180

caaacaaaaa gcgaaaatga gagagtgcat ttcgatccac attggacaag ccggaatcca 240

ggtcggcaat gcctgttggg agctgtactg ccttgaacat ggcatccagc ctgatggaca 300

aatgcctggt gatcacactg tcggaggagg tgatgatgcc ttcaacacat tcttcagcga 360

aactggcgcc gggaagcatg ttccccgtgc agtgttcgtc gatctggagc ctactgtgat 420

tgatgaggtg cgcactggta cataccgtca gctattccac cctgaacaac taatcagcgg 480

caaagaagac gctgccaaca actttgccag aggtcattac actattggca aagaaatcgt 540

ggatctgtgc cttgatagga tccgcaaact cgctgacaac tgtactgggt tgcaaggctt 600

cctcgttttc catgctgtgg gtggtggtac cggatctggc ctcggatctc tgttgctcga 660

gaggctctcc gtcgattatg gtaaaaagtc gaagctgggt ttcactatct acccttcccc 720

tcaagtctca actgccgttg ttgagcctta taactctgtg ctttcaactc attcccttct 780

tgaacacact gatgttgctg ttcttcttga taatgaggcc atctatgata tttgccgcaa 840

atctctggac atcgagaggc ctacatacac caatttgaac aggctcattt ctcaggtgat 900

ttcctcctta actgcatccc tgagatttga cggagcattg aacgtcgatg taaacgaatt 960

ccaaaccaac ctcgtcccat acccaagaat ccacttcatg ctttcatcat acgcccccgt 1020

aatctcagct gagaaagcct accacgagca gctctccgtc gctgagatca ccaacaccgc 1080

ctttgagcca tcttccatga tggtgaagtg cgatccgcgc cacggcaagt acatggcgtg 1140

ctgcctcatg tacagaggcg atgttgtccc caaagatgtg aacgcggccg ttgccacaat 1200

caagacaaag aggacgatcc agtttgtcga ctggtgccca actggcttca agtgtggcat 1260

caactaccag ccgccgactg tggtccctgg tggtgatctt gctaaggtgc agagggcagt 1320

ttgcatgatt tcaaactcga ctagtgttgc tgaggtgttc tcgaggatcg atcataagtt 1380

tgatttgatg tatgctaaga gggctttcgt gcattggtat gtgggtgagg gtatggagga 1440

aggggagttc tcggaggcga gggaggattt ggctgctttg gagaaggatt atgaggaagt 1500

tggggctgaa tctgctgaag gtgaagatga tgagaatgaa gagtactaga gtagggacca 1560

attggctcgt tggtttagtg ctgaactttt ttccttatgg ttgaacttct tgtctggtgt 1620

tgaactgctt atggattctc tgtgtgtagt tcgtattgat tatggtatgt gttgaaaagg 1680

ggctttatgt tcatttcgta ttgattatgc ttgtgtaatt cgtatgtgtt gattattagt 1740

tattccctag gtcatactcg tattttatat gtttaaaatg ccaagataat tttttttttt 1800

tt 1802

<210> 16

<211> 1670

<212> DNA

<213> 海州常山的UBQ基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 16

gaattgttct cataaatttt cagttttttc gtctctcaat cgtcaagatg caaatcttcg 60

tgaaaactct caccggcaag accatcaccc ttgaggttga aagctccgat accattgaca 120

acgtcaaggc taagatccag gacaaggaag gtatcccccc agaccagcaa aggctgatct 180

tcgcaggaaa acagcttgag gatggccgta ccctcgccga ctacaatatt cagaaggaat 240

caactctcca cctggtcctc cgtctccgtg gaggtatgca gatattcgtg aagaccctaa 300

cgggcaagac catcaccctc gaggttgaaa gctccgacac gatcgataac gtgaaggcca 360

agatccagga caaggagggt attcccccag accagcagag gctgatcttc gccggcaagc 420

agctcgagga cggacgtacc ctcgccgact acaatatcca gaaggagtcc accctccatt 480

tggtcctccg tctccgtggt ggtatgcaga tctttgtcaa gaccctcacc ggcaagacca 540

tcaccctcga ggttgaaagc tccgacacga tcgataacgt gaaggccaag atccaggaca 600

aggagggtat tcccccagac cagcagaggc tgatcttcgc tgggaagcaa ctcgaggatg 660

gacgcacgct tgctgattac aacatacaaa aggaaagcac acttcatttg gttctgaggt 720

tgagaggtgg aatgcaaatc tttgtcaaga ctctcacggg gaagaccatc accttggagg 780

ttgagagttc cgacaccatt gataatgtga aagccaagat acaagacaag gaaggtatcc 840

caccagacca gcagaggctc atatttgcag ggaagcagct ggaggatgga cgcaccttgg 900

ctgattacaa cattcagaag gagtctactc ttcatttggt gttgaggttg aggggaggga 960

tgcagatatt tgtcaagaca ttgactggga agaccatcac tttggaggtg gagagttcag 1020

acactattga taatgtgaag gccaagatcc aggataagga gggcatccca cccgaccagc 1080

agaggttgat cttcgccggg aaacagctgg aggatgggag gactctcgct gattacaata 1140

tccagaagga atccaccctt caccttgtcc tcaggctccg tggtggtttc tagagcttct 1200

ggttttcttg ttgtttgaat gttctggttt tatgttctgt ttgttgattt tacatgattc 1260

ctgttttccc gtgtgtgtgt gcgtgtgttg aaacttaagt atggtactgt tatgttgtcg 1320

tcttgctgac attctcagtt gtcattggaa taaaattggg attttatccc ccctataata 1380

aatttccggt gagtgcataa ttggctgtaa tagttttttc aatattgttg ctgttgagaa 1440

ggtgctacgt aatgttctac cttcttcatc ggttgctttt ctggagattc ttgtatgcct 1500

cggtaatgtt tggtgattat atttatcttc tttaattact gaaagaagtt ggatccgatg 1560

cactatccca ggagaggtcg aagcgatgta ttcctaggtg tttttctgtt agtggagttt 1620

acttcgttgc atgttgtccc gtcaaccatt ttcgtaaggg attaatgttt 1670

<210> 17

<211> 588

<212> DNA

<213> 海州常山的H3基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 17

actgatcagt tttactacaa aacagacaaa ggttaaacat tcaaagccac aagtgacacc 60

tcgaaacaac cacatattta ccatcggaaa aaactatccc ttagacccaa atcatccaga 120

ttacaagtta agccctttca cccctaattc tcctcgcaag ctggatatct ttgggcataa 180

ttgtaaccct cttagcatga atggcacaga ggttagtatc ctcaaacaat ccaacaagat 240

aggcctccgc tgcctcttga agagccgcca cagcagagct ctggaacctc agatccgtct 300

tgaaatcctg agcaatctca cggacaagcc tctggaaagg aagttttcgg atcaaaagct 360

cagtggattt ctggtacttg cgaatttcac ggagagcgac ggttcccggg cgaaaacggt 420

gaggcttctt cactccgccg gtggcggggg ctgatttcct agcggctttg gtggccaact 480

gcttccgcgg tgccttgcct ccggtggatt tgcgggcggt ttgcttagtg cgagccattt 540

ctagggtatc gatagaaagt atggaaaaaa agtgctaatt tggaattg 588

<210> 18

<211> 514

<212> DNA

<213> 海州常山的ClNHX1基因(Clerodendrum trichotomum Thunb)

<400> 18

gccaataatt tctcagcaat ggagggctta ttttaccgtc ttctccttct tacagttcca 60

ttaatggcca tgcaagtgct tccttcttct tcatcatcca atacaaagat gtttcagttt 120

aatgttgaat ggaagagtat aacaagactt tgcaatagaa agacagtatt gacagtaaat 180

gggaagtacc cagggccaac cattgctgtg aatgaaggtg acagtgttca agtaacggtc 240

actaattggg ttgcaagaaa caccaccatc cattggcatg gagtaaggca gatgagaagg 300

ggttgggcag atggggcagc atacataaca caatgcccga ttggaggagg caaaagctat 360

agatacaact ttagtgtaga ggatcagagg ggtacactgt ggtggcatgc tcatatcggc 420

tggcaacgtg cttcggttta tggcgctttt atcatttacc ctcgcacgcc ttttccattc 480

tctctccaac tccacccact tcagattcct ctca 514

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> Actin引物序列(Artificial)

<400> 19

cgattcttgc ttccctcagt a 21

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> Actin下游引物序列(Artificial)

<400> 20

accattttcg ccgcctta 18

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> PP2A上游引物序列(Artificial)

<400> 21

ggacaagcac caagacgcc 19

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> PP2A下游引物序列(Artificial)

<400> 22

tcagcacttc taaaaccgca tc 22

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> RPL上游引物序列(Artificial)

<400> 23

agtcaatggt ggcgatgtag c 21

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> RPL下游引物序列(Artificial)

<400> 24

cccttggtca ctccgataat gt 22

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> PK上游引物序列(Artificial)

<400> 25

ctgaaggtgg tgtactcctg ctc 23

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> PK下游引物序列(Artificial)

<400> 26

cgaaactgcc ccaacaagat a 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 18S上游引物序列(Artificial)

<400> 27

acaatcaccg aacaaagcag c 21

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 18S下游引物序列(Artificial)

<400> 28

cgagaagtaa tcttggaacg cc 22

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> RAN上游引物序列(Artificial)

<400> 29

ggagacgaca gtttgggtgc 20

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> RAN下游引物序列(Artificial)

<400> 30

tgccatactt gcgggtgaa 19

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> APT上游引物序列(Artificial)

<400> 31

ccacgcattc aagccattc 19

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> APT下游引物序列(Artificial)

<400> 32

gagcctctat cccagcaacg 20

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> SAND上游引物序列(Artificial)

<400> 33

gaccagtcgc ttgatgccc 19

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> SAND下游引物序列(Artificial)

<400> 34

ggatgctcca ggtactgctc tt 22

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> PROF上游引物序列(Artificial)

<400> 35

gaatgtggtg ttttgagtga gagg 24

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> PROF下游引物序列(Artificial)

<400> 36

atgtgaagtt ttggggga 18

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> MDH上游引物序列(Artificial)

<400> 37

acctggaatg acgagggatg 20

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> MDH下游引物序列(Artificial)

<400> 38

gccacaaacg tattagctct gact 24

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> EF-1A上游引物序列(Artificial)

<400> 39

aggatggaca gacccgtgag 20

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> EF-1A下游引物序列(Artificial)

<400> 40

aaaaccagaa atggggacaa at 22

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> UBC-E2上游引物序列(Artificial)

<400> 41

gcaaaggctg attgatgaga ttc 23

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> UBC-E2下游引物序列(Artificial)

<400> 42

cctcaacatt gtcttgggtg g 21

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> AP-2上游引物序列(Artificial)

<400> 43

ccacaactaa cgcctccacc 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> AP-2下游引物序列(Artificial)

<400> 44

aaattcaccc tccgactccc 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> HSP70上游引物序列(Artificial)

<400> 45

gccattttga gtggtgaggg 20

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> HSP70下游引物序列(Artificial)

<400> 46

ggttggttgt ccgagtaggt aga 23

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> TUA上游引物序列(Artificial)

<400> 47

gtccccaaag atgtgaacgc 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> TUA下游引物序列(Artificial)

<400> 48

aagcagccaa atcctccctc 20

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> UBQ上游引物序列(Artificial)

<400> 49

tgctgttgag aaggtgctac g 21

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> UBQ下游引物序列(Artificial)

<400> 50

cgaaaatggt tgacgggac 19

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> H3上游引物序列(Artificial)

<400> 51

caagttaagc cctttcaccc c 21

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> H3下游引物序列(Artificial)

<400> 52

tgctcaggat ttcaagacgg a 21

Claims

1.海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因，其特征在于，为MDH、UBC-E2和UBQ基因，其中，MDH基因的基因序列如SEQ ID NO.10所示，UBC-E2基因的基因序列如SEQ ID NO.12所示，UBQ基因的基因序列如SEQ ID NO.16所示。

2.权利要求1所述的海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因的专用引物，其特征在于，MDH基因的引物序列如下：

MDH正向引物5’-ACCTGGAATGACGAGGGATG-3’

MDH反向引物5’-GCCACAAACGTATTAGCTCTGACT-3’。

3.权利要求1所述的海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因的专用引物，其特征在于，UBC-E2基因的引物序列如下：

UBC-E2正向引物5’-GCAAAGGCTGATTGATGAGATTC-3’

UBC-E2反向引物5’-CCTCAACATTGTCTTGGGTGG-3’。

4.权利要求1所述的海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因的专用引物，其特征在于，UBQ基因的引物序列如下：

UBQ正向引物5’-TGCTGTTGAGAAGGTGCTACG-3’

UBQ反向引物5’-CGAAAATGGTTGACGGGAC-3’。

5.权利要求1所述的海州常山涝害胁迫下荧光定量内参基因在海州常山荧光定量中的应用。

6.权利要求2所述的MDH基因的引物序列在海州常山荧光定量中的应用。

7.权利要求3所述的UBC-E2基因的引物序列在海州常山荧光定量中的应用。

8.权利要求4所述的UBQ基因的引物序列在海州常山荧光定量中的应用。