CN109337989A - 一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法 - Google Patents

一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法。本发明提供的引物、TaqMan‑MGB探针和检测方法，可实现快捷、简便、灵敏、准确的监测kdr等位基因类型、基因型频率等，即可快速准确的掌握淡色库蚊与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的kdr等位基因的状况，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态。因此，本发明提供的引物、TaqMan‑MGB探针、试剂盒和检测方法，是一种能准确、方便预测淡色库蚊抗药性发生和发展的新产品和新方法。

Description

一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法。
背景技术
淡色库蚊(Culex pipienspallens)是淋巴丝虫病的主要传播媒介，同时作为流行性乙型脑炎的次要传播媒介，其危害不容视。由于近年来全球气候的变化，城市及区域间的贸易和人员交流繁，生态环境的变迁和化学杀虫剂的过量使用等，使得病媒生物的种群密度和分布发生新的变化，并伴随着新发病媒生物性传染病出现，针对病媒生物密度和抗药性的调查研究对于发现病媒生物的异常变化，减少病媒生物对于人群的骚扰和危害，指导化学杀虫剂的科学使用，防控病媒生物性疾病的发生和流行意义重大。
目前，蚊类抗药性的检测方法，一致沿用1970世界卫生组织推荐的生物测定法，测出害虫对药剂的敏感毒力基线和LD50或LC50值。再从测试地区采集同种害虫种群，采用与测定敏感品系相同的生物测定方法和控制条件，得出待测种群的LD50或LC50值，以待测种群与民敏感种群品系的LD50或LC50值之间的比值来表示抗性水平。但该方法对所获得资料有严格的统计要求，必须严格控制实验条件，需反复多次实验，而且在实践中也显示出较明显的局限性。传统的生物测定法比较繁琐，从虫源、饲养到测定难于做到真正的标准化，而且由LD-p线求出的LD50或LC50值的重复性和精确性较低，当群体抗性较低和抗性种群多样时很难准确测定，因此测得的抗性水平往往具有滞后性，不适合早起抗性检测，不利于制定相应的防治对策。
鉴于目前许多抗性对策依赖于抗性的早期检测，因此抗性监测与检测技术的研究尤为重要。随着抗性监测和检测目的的多元化，抗性监测手段和方法也朝着多元化方向发展。害虫抗药性分子检测技术是基于对害虫抗药性机制了解的基础上建立起来的，即利用分子生物学技术检测杀虫剂作用靶标的抗性位点或解毒代谢酶基因的增强表达。基于可操作性、实用性和经济等方面的原因，目前几乎所有的抗性检测研究都集中于靶标抗性方面，即检测靶标基因的突变。
kdr基因可以作为昆虫对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态。多项数据表明发现LC50为代表的高效氯氰菊酯抗性与淡色库蚊kdr等位基因频率之间存在正相关关系。研究说明Kdr基因可以作为淡色库蚊对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态，可以预测抗性的发生和发展。
发明内容
本发明提供了一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法，可实现快捷、简便、灵敏、准确的监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态，是一种准确、方便预测淡色库蚊抗药性发生和发展的新方法。
本发明的一个目的是提供一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的专用引物对，所述引物对由F和R组成，所述F具有序列表中SEQ ID№：1所示核苷酸序列，所述R具有序列表中SEQ ID№：2所示核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的探针，所述探针包括下述1)-6)中的至少一种：
1)探针P1具有序列表中SEQ ID№：3所示核苷酸序列；
2)探针P2具有序列表中SEQ ID№：4所示核苷酸序列；
3)探针P3具有序列表中SEQ ID№：5所示核苷酸序列；
4)探针P1为将具序列表中SEQ ID№：3所示核苷酸序列的核苷酸的3’末端增加MGB基团、5’端标记FAM发光基团后制备得到；
5)探针P2为将具序列表中SEQ ID№：4所示核苷酸序列的核苷酸的3’末端增加MGB基团、5’端标记FAM发光基团后制备得到；
6)探针P3为将具序列表中SEQ ID№：5所示核苷酸序列的核苷酸的3’末端增加MGB基团、5’端标记VIC发光基团后制备得到。
本发明的再一个目的是提供一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的专用引物对和/或本发明所述的至少一种探针。
具体的，所述试剂盒包括下述1)-3)中的至少一种：
1)试剂A，所述试剂A包括本发明所述的专用引物对、本发明5)所述的探针P2和本发明6)所述的探针P3；
2)试剂B，所述试剂B包括本发明所述的专用引物对、本发明4)所述的探针P1和本发明6)所述的探针P3；
3)TaqMan反应缓冲液。
本发明的再一个目的是提供一种检测或辅助检测淡色库蚊中kdr基因的突变位点的方法，所述方法包括使用本发明所述的专用引物对、本发明所述的至少一种探针和/或本发明所述的至少一种试剂盒进行检测。
具体的，所述方法包括：
使用本发明所述的试剂A对待测淡色库蚊进行TaqMan PCR扩增反应，得到A反应产物；使用本发明所述的试剂B对待测淡色库蚊进行TaqMan PCR扩增反应，得到B反应产物；
检测A反应产物和B反应产物：
若A反应产物在FAM和VIC通道均无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因不含或候选不含有所述突变位点，突变位点所在位置的碱基为TTG/TTG；
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物在FAM和VIC通道均无信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014C，突变位点所在位置的碱基为TGT/TGT；
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014F，突变位点所在位置的碱基为TTT/TTT；
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014C，突变位点所在位置的碱基为TTG/TGT；
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014F，突变位点所在位置的碱基为TTG/TTT；
若A反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014F和L1014C；突变位点所在位置的碱基为TTT/TGT。
再具体的，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：
1)所述TaqMan PCR扩增反应的反应体系中，引物各自的终浓度均为9μM；
2)所述TaqMan PCR扩增反应的反应体系中，探针各自的终浓度均为5μM；
3)所述TaqMan PCR扩增反应的反应体系中，以待测淡色库蚊的基因组DNA为模板；
4)所述TaqMan PCR扩增反应的退火温度为60℃-65℃；优选退火温度为60℃。
本发明的再一个目的是提供一种检测或辅助检测淡色库蚊中kdr基因的基因型的方法，所述方法包括使用本发明所述的专用引物对、本发明所述的至少一种探针和/或本发明所述的至少一种试剂盒进行检测。
具体的，所述方法包括：
使用本发明所述的试剂A对待测淡色库蚊进行TaqMan PCR扩增反应，得到A反应产物；使用本发明所述的试剂B对待测淡色库蚊进行TaqMan PCR扩增反应，得到B反应产物；
检测A反应产物和B反应产物：
若A反应产物在FAM和VIC通道均无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因为不含或候选不含有所述突变位点的纯合型基因；
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物在FAM和VIC通道均无信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014C的纯合型基因；
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F的纯合型基因；
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014C的杂合型基因；
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F的杂合型基因；
若A反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F和L1014C的杂合型基因。
再具体的，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：
1)所述TaqMan PCR扩增反应的反应体系中，引物各自的终浓度均为9μM；
2)所述TaqMan PCR扩增反应的反应体系中，探针各自的终浓度均为5μM；
3)所述TaqMan PCR扩增反应的反应体系中，以待测淡色库蚊的基因组DNA为模板；
4)所述TaqMan PCR扩增反应的退火温度为60℃-65℃；优选退火温度为60℃。
本发明的还一个目的是提供本发明所述的专用引物对、本发明所述的至少一种探针、本发明所述的至少一种试剂盒、和/或本发明任一所述方法的应用。
具体的，所述应用包括下述1)-3)中的至少一种：
1)在检测淡色库蚊中kdr基因突变位点中的应用；
2)在检测淡色库蚊抗药性中的应用；
3)在制备检测淡色库蚊抗药性产品中的应用。
所述任一应用不包括专利法第二十五条所述的疾病的诊断和治疗方法。
具体的，所述突变位点具体为L1014F或L1014C。
具体的，所述抗药性为抗菊酯类药物；所述菊酯类药物具体为溴氰菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。
具体的，所述试剂A和所述试剂B均为独立包装。
具体的，所述专用引物对、探针P1、探针P2和探针P3均为独立包装。
本发明的有益效果包括：
本发明的实验证明，本发明提供了一种快捷、简便、灵敏的淡色库蚊kdr突变等位基因检测引物、探针、试剂盒和方法，可用来掌握淡色库蚊与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的kdr等位基因的状况即监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态，可以快捷、简便、灵敏、准确的预测抗性的发生和发展。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例及其具体说明用于解释和理解本发明，并不构成对本发明的不当限定。
实施例1、引物和探针的设计
1、引物及TaqMan-MGB探针设计
针对抗性淡色库蚊钠通道kdr的两种点突变三种等位基因的情况，根据序列特征，利用PrimerExpress2.0软件设计了三条探针，分别针对三种等位基因类型，为了提高退火温度，增加序列的特异性，在探针3’末端增加MGB基团提高探针序列的退火温度。
在定量PCR仪的48孔板上，每个样本设计平行的两管扩增，第一管加探针P1、P3和非特异引物F及R，第二管加探针P2、P3和非特异引物F及R，按照ABI7500fast real-timePCR仪的操作规程，第一管的FAM基团设计为棕色，VIC基团设计为绿色，第二管的FAM基团设计为红色，VIC基团设计为绿色，运行结束后读取两管的扩增曲线，根据两管显示的颜色可以轻松读出扩增的等位基因类型，即检测L1014和L1014C等位基因的探针1和探针2在5’标记FAM发光基团，检测L1014F等位基因的探针3在5’标记VIC发光基团。检测时将第一管中的FAM设为红色，第二管的FAM设为棕色，VIC均设为绿色。TaqMan Universal Master Mix由Taraka公司提供。探针1-3分别对应于TGT、TTG和TTT密码子。本实施例具体设计的引物及TaqMan-MGB探针如表1所示。
表1
名称 序列 Tm值 长度 序列表中的编号
F 5’TGTCCTTTATCGTGTTCGACCC 3’ 58.4 22 SEQ ID№：1
R 5’ATCGAAAATGTTCCAACCCTCCTG 3’ 59.1 24 SEQ ID№：2
P1 FAM 5’TCCTTTATCGTGTTC 3’MGB 70 15 SEQ ID№：3
P2 FAM 5’TCGTTTATCGTTGTT 3’MGB 69.6 15 SEQ ID№：4
P3 VIC 5’TCATTTATCGTTTTC 3’MGB 68.5 15 SEQ ID№：5
表1中，探针P1、P2分别为将具序列表中SEQ ID№：3、SEQ ID№：4所示核苷酸序列的核苷酸3’末端增加MGB基团、5’端标记FAM发光基团后制备得到。探针P3为将具序列表中SEQ ID№：5所示核苷酸序列的核苷酸3’末端增加MGB基团、5’端标记VIC发光基团后制备得到。
2、反应体系设计
为了即节约又能检测目的序列，设计了双管法来检测淡色库蚊双突变等位基因，探针P2，P3和引物F及R组成一组，用来检测等位基因L(TTG)和F(TTT)；探针P1和探针P3及引物F、R组成一组，用来检测等位基因C(TGT)和F(TTT)突变。
反应体系(1)A组：
反应体系(2)B组：
上述反应体系(1)A组和反应体系(2)B组中的，引物的终浓度均为9μM，探针的终浓度均为5μM。
TaqMan Universal Master Mix为5μl/10μl，购自Takara公司。
反应条件：
实施例2、TaqMan-MGB探针检测淡色库蚊钠通道三种突变类型的等位基因提取野外捕获的淡色库蚊自然种群16个样品的基因组DNA，得到编号为1-16的样品DNA，将上述样品DNA分别用实施例1设计的引物和探针、按照实施例1的反应体系、反应条件进行双管同时进行A组和B组的TaqMan PCR检测。
L1014F为在kdr基因的第1014位氨基酸的等位基因含有TTT；
L1014C为在kdr基因的第1014位氨基酸的等位基因含有TGT；
若第一管中无FAM基团、VIC基团信号，且第二管中仅有FAM基团信号，则样品为L1014纯合子，突变位点碱基为TTG；
若第一管中有FAM基团、无VIC基团信号，且第二管中无FAM基团和VIC基团信号，则样品为L1014C纯合子，碱基为TGT；
若第一管中无FAM基团、有VIC基团信号，且第二管中只有VIC基团信号，则为则样品为L1014F纯合子，突变位点碱基为TTT；
若第一管中有FAM基团、无VIC基团信号，且第二管中有FAM基团、无VIC基团信号，则样品为L1014C杂合子，突变位点碱基为TTG/TGT；
若第一管中无FAM基团、有VIC基团信号，且第二管中有FAM基团和VIC基团信号，则样品为L1014F杂合子，突变位点碱基为TTG/TTT；
若第一管中有FAM基团和VIC基团信号，且第二管中只有VIC基团信号，则样品为L1014F和L1014C突变，突变位点碱基为TTT/TGT。
检测结果如下表2所示。表2为TaqMan-MGB探针平行双管法对淡色库蚊kdr基因突变等位基因分型结果。
表2
注：第一管TGT密码子用FAM1标记为红色，TTT密码子用VIC标记为绿色；第二管TTG密码子用FAM2标记为综色，TTT密码子用VIC2标记为绿色。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 宁波国际旅行卫生保健中心
<120> 一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的引物、探针及方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtcctttat cgtgttcgac cc 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcgaaaatg ttccaaccct cctg 24
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctttatcg tgttc 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgtttatcg ttgtt 15
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcatttatcg ttttc 15

Claims (10)

1.一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的专用引物对，所述引物对由F和R组成，其特征在于，所述F具有序列表中SEQ ID №：1所示核苷酸序列，所述R具有序列表中SEQ ID №：2所示核苷酸序列。
2.一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的探针，其特征在于，所述探针包括下述1)-6)中的至少一种：
1)探针P1具有序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列；
2)探针P2具有序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列；
3)探针P3具有序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列；
4)探针P1为将具序列表中SEQ ID №：3所示核苷酸序列的核苷酸的3’末端增加MGB基团、5’端标记FAM发光基团后制备得到；
5)探针P2为将具序列表中SEQ ID №：4所示核苷酸序列的核苷酸的3’末端增加MGB基团、5’端标记FAM发光基团后制备得到；
6)探针P3为将具序列表中SEQ ID №：5所示核苷酸序列的核苷酸的3’末端增加MGB基团、5’端标记VIC发光基团后制备得到。
3.一种检测淡色库蚊抗药性基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的专用引物对和/或权利要求2所述的至少一种探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括下述1)-3)中的至少一种：
1)试剂A，所述试剂A包括权利要求1所述的专用引物对、权利要求2的5)所述的探针P2和权利要求2的6)所述的探针P3；
2)试剂B，所述试剂B包括权利要求1所述的专用引物对、权利要求2的4)所述的探针P1和权利要求2的6)所述的探针P3；
3)TaqMan反应缓冲液。
5.一种检测或辅助检测淡色库蚊中kdr基因的突变位点的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的专用引物对、权利要求2所述的至少一种探针和/或权利要求3或4所述的至少一种试剂盒进行检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
使用权利要求4所述的试剂A对待测淡色库蚊进行TaqMan PCR扩增反应，得到A反应产物；使用权利要求4所述的试剂B对待测淡色库蚊进行TaqMan PCR扩增反应，得到B反应产物；
检测A反应产物和B反应产物：
若A反应产物在FAM和VIC通道均无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因不含或候选不含有所述突变位点，突变位点所在位置的碱基为TTG/TTG；
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物在FAM和VIC通道均无信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014C，突变位点所在位置的碱基为TGT/TGT；
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014F，突变位点所在位置的碱基为TTT/TTT；
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014C，突变位点所在位置的碱基为TTG/TGT；
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014F，突变位点所在位置的碱基为TTG/TTT；
若A反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014F和L1014C；突变位点所在位置的碱基为TTT/TGT。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：
1)所述TaqMan PCR扩增反应的反应体系中，引物各自的终浓度均为9μM；
2)所述TaqMan PCR扩增反应的反应体系中，探针各自的终浓度均为5μM；
3)所述TaqMan PCR扩增反应的反应体系中，以待测淡色库蚊的基因组DNA为模板；
4)所述TaqMan PCR扩增反应的退火温度为60℃-65℃。
8.一种检测或辅助检测淡色库蚊中kdr基因的基因型的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的专用引物对、权利要求2所述的至少一种探针和/或权利要求3或4所述的至少一种试剂盒进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
使用权利要求4所述的试剂A对待测淡色库蚊进行TaqMan PCR扩增反应，得到A反应产物；使用权利要求4所述的试剂B对待测淡色库蚊进行TaqMan PCR扩增反应，得到B反应产物；
检测A反应产物和B反应产物：
若A反应产物在FAM和VIC通道均无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因为不含或候选不含有所述突变位点的纯合型基因；
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物在FAM和VIC通道均无信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014C的纯合型基因；
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F的纯合型基因；
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014C的杂合型基因；
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F的杂合型基因；
若A反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F和L1014C的杂合型基因。
具体的，所述方法还包括下述1)-4)中的至少一种：
1)所述TaqMan PCR扩增反应的反应体系中，引物各自的终浓度均为9μM；
2)所述TaqMan PCR扩增反应的反应体系中，探针各自的终浓度均为5μM；
3)所述TaqMan PCR扩增反应的反应体系中，以待测淡色库蚊的基因组DNA为模板；
4)所述TaqMan PCR扩增反应的退火温度为60℃-65℃。
10.权利要求1所述的专用引物对、权利要求2所述的至少一种探针、权利要求3或4所述的至少一种试剂盒、和/或权利要求5、6、7、8或9任一所述方法的应用。
具体的，所述应用包括下述1)-3)中的至少一种：
1)在检测淡色库蚊中kdr基因突变位点中的应用；
2)在检测淡色库蚊抗药性中的应用；
3)在制备检测淡色库蚊抗药性产品中的应用。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102242215A (zh) * 2011-07-13 2011-11-16 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 尖音库蚊抗药性检测试剂盒及其专用引物
CN102373282A (zh) * 2011-11-03 2012-03-14 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 中华按蚊抗药性pcr-rflp检测试剂盒及其专用引物
CN102373280A (zh) * 2011-11-03 2012-03-14 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 中华按蚊抗药性as-pcr检测试剂盒及其专用引物
CN102373281A (zh) * 2011-11-03 2012-03-14 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 中华按蚊抗药性TaqMan PCR检测试剂盒及其应用
CN103146834A (zh) * 2013-03-25 2013-06-12 江苏省血吸虫病防治研究所 基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102242215A (zh) * 2011-07-13 2011-11-16 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 尖音库蚊抗药性检测试剂盒及其专用引物
CN102373282A (zh) * 2011-11-03 2012-03-14 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 中华按蚊抗药性pcr-rflp检测试剂盒及其专用引物
CN102373280A (zh) * 2011-11-03 2012-03-14 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 中华按蚊抗药性as-pcr检测试剂盒及其专用引物
CN102373281A (zh) * 2011-11-03 2012-03-14 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 中华按蚊抗药性TaqMan PCR检测试剂盒及其应用
CN103146834A (zh) * 2013-03-25 2013-06-12 江苏省血吸虫病防治研究所 基于Allglo探针的中华按蚊击倒抗性基因突变位点的检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANA PAULA B SILVA等: "Mutations in the voltage-gated sodium channel gene of anophelines and their association with resistance to pyrethroids - a review", 《PARASIT VECTORS》 *
HONG-MEI LIU ET AL.: "Identification of TCT, a novel knockdown resistance allele mutation and analysis of resistance detection methods in the voltage-gated Na+ channel of Culex pipiens pallens from Shandong Province, China", 《MOLECULAR MEDICINE REPORTS》 *
JEFFREY G. SCOTT ET AL.: "Pyrethroid resistance in Culex pipiens mosquitoes", 《PESTICIDE BIOCHEMISTRY AND PHYSIOLOGY》 *
景晓等: "《蚊媒传染病监测技术及应用》", 31 August 2017 *
白亮，高琪等: "TaqMan⁃MGB探针实时荧光定量PCR用于中华按蚊kdr基因突变检测的研究", 《中华血吸虫病防治杂志》 *

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