CN102373281A - 中华按蚊抗药性TaqMan PCR检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种中华按蚊抗药性TaqMan PCR检测试剂盒及其应用。本发明提供的引物，由引物1和引物2组成，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。所述突变位点为L1014F或L1014C。本发明的实验证明，本发明提供的了一种快捷、简便、灵敏的中华按蚊kdr突变等位基因检测试剂盒，用来掌握中华按蚊与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的kdr等位基因的状况。

Description

中华按蚊抗药性TaqMan PCR检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种中华按蚊抗药性TaqMan PCR检测试剂盒及其应用。 
背景技术
中华按蚊(Anopheles sinensis)分布于我国除青海和新疆以外的所有省市，是我国平原水网和水稻种植地区的优势蚊种，家野两栖，白天多栖息在村庄四周的作物植棵和芦苇丛、灌木丛中，部分栖息在牛房畜舍，偏嗜畜血(以牛、马、猪等大牲畜为主)，兼吸人血，以成蚊越冬。中华按蚊是我国疟疾的重要传播媒介，尤其在北纬34°以北的地区，它是主要的或唯一的传播媒介。目前，疟疾尚无有效疫苗可用，控制疟疾媒介的种群数量是防治疟疾的重要手段。化学防治因其易操作，能够迅速、有效地控制害虫种群，在媒介昆虫防制规划中占有重要地位。过去几十年来，针对中华按蚊的生活习性，用拟除虫菊酯类杀虫剂，采用滞留喷洒和浸泡蚊帐等灭蚊防疟措施，取得了显著效果。然而，化学防治在充分发挥其优势的同时，也带来了负面效果，导致了中华按蚊抗药性的产生。九十年代以来，国内各地报道的中华按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性越来越明显。1993年重庆中华按蚊对溴氰菊酯和DDT达到初级抗性，1998年在云南采集的10个中华按蚊种群有5个对DDT产生抗性，1999年浙江温州、宁波等地的中华按蚊种群达到高抗种群(R/S＝15-20)，2009年，江苏部分地区的中华按蚊对溴氰菊酯产生了高度抗性。 
害虫对杀虫剂产生抗性以后，化学防治的效果就会随着抗药性的升高而下降，害虫的防治也会受到严重的影响。为了应对害虫种群的抗性，为了克服抗性达到预期的防治效果，杀虫剂的使用量，包括单位面积的施药量和施药次数，就不得不持续增加，这无异于在持续增加杀虫剂对媒介昆虫抗性的选择压力，而且这种抗药性还可向远距离扩散，间接地还可能造成某些媒介疾病的发生与流行。从这些年对害虫抗药性的监测来看，抗药性增长的速度远大于新农药、新剂型研发的速度。因此，如何加强媒介昆虫的抗药性治理、延缓抗药性的产生和发展、延长现有杀虫剂的使用寿命是害虫治理中的重要内容。 
昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性主要是击倒抗性(knockdown resistance，kdr)，kdr基因在中华按蚊对拟除虫菊酯的抗性中具有重要作用。拟除虫菊酯的作用靶标主要是昆虫电压依赖性神经细胞膜上的钠离子通道，离子通道上的作用靶点对杀虫剂降低了敏感性而产生击倒抗性，因此击倒抗性不同于代谢抗性，不能被酯酶或多功能氧化酶的抑制剂所降低。通过比较敏感、抗性中华按蚊的部分钠通道序列，发现para 型钠通道基因中的kdr的L1014F(亮氨酸到苯丙氨酸)即TTG→TTT的突变及L1014C(亮氨酸到半胱氨酸)即TTG-TGT的突变和击倒抗性相关。这是我国关于中华按蚊击倒抗性及其基因突变的首次报道。 
kdr基因可以作为昆虫对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态。谭伟龙等(2011)用特异性等位基因PCR方法，对采江苏、安徽的11个中华按蚊种群进行致死中浓度(LC50)和kdr基因频率的测定，并且发现LC50为代表的高效氯氰菊酯抗性与中华按蚊kdr等位基因频率之间存在正相关关系。研究说明Kdr基因可以作为中华按蚊对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态，可以预测抗性的发生和发展。 
目前我国还没有成型的针对中华按蚊的kdr抗性分子检测方法和试剂盒。 
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的专用引物。 
本发明提供的专用引物，由引物1和引物2组成，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。 
所述突变位点为L1014F或L1014C。 
本发明的另一个目的是提供一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂。 
本发明提供的试剂，由试剂1和试剂2组成， 
所述试剂1由所述专用引物、探针2和探针3组成； 
所述试剂1由所述专用引物、探针1和探针3组成； 
所述探针1的核苷酸序列为序列表中的序列3； 
所述探针2的核苷酸序列为序列表中的序列4； 
所述探针3的核苷酸序列为序列表中的序列5； 
所述探针1、探针2和探针3的3’末端均标记MGB基团； 
所述探针1和探针2的5’末端均标记FAM基团； 
所述探针3的5’末端标记VIC基团。 
所述专用引物、探针1、探针2和探针3均为独立包装。 
本发明的第三个目的是提供一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的反应试剂。 
本发明提供的反应试剂，由试剂A和试剂B组成，所述试剂A包括所述试剂1；所述试剂B包括所述试剂2。 
所述试剂A由所述试剂1和TaqMan反应缓冲液组成；所述试剂B由所述试剂2和TaqMan反应缓冲液组成； 
所述试剂中的各引物在对应的所述试剂中的浓度均为9μM； 
TaqMan Universal Master Mix为5μl/10μl，购自上海基康公司，Cogene Biotech：1008757； 
所述试剂中的各条探针在所述对应的试剂中的浓度均为5μM； 
所述试剂A和所述试剂B均为独立包装。 
本发明的第四个目的是提供一种制备检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂盒。 
本发明提供的试剂盒，包括所述的反应试剂； 
所述突变位点为L1014F或L1014C。 
所述专用引物或所述试剂或所述反应试剂或所述试剂盒在检测中华按蚊中kdr基因突变位点、检测中华按蚊抗药性或制备检测中华按蚊抗药性产品中的应用也是本发明保护的范围；所述突变位点具体为L1014F或L1014C，所述抗药性为抗菊酯类药物；所述菊酯类药物具体为溴氰菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。 
本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的突变位点的方法。 
本发明提供的方法，包括如下步骤： 
用所述反应试剂中的所述试剂A和所述试剂B分别对待测中华按蚊进行TaqMan PCR扩增，得到A反应产物和B反应产物； 
检测反应产物，若A反应产物在FAM和VIC通道均无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因不含或候选不含有所述突变位点，突变位点所在位置的碱基为TTG/TTG； 
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物在FAM和VIC通道均无信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014C，突变位点所在位置的碱基为TGT/TGT； 
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014F，突变位点所在位置的碱基为TTT/TTT； 
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014C，突变位点所在位置的碱基为TTG/TGT； 
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014F，突变位点所在位置的碱基为TTG/TTT； 
若A反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014F和L1014C；突变位点所在位置的碱基为TTT/TGT。 
本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的基因型的方法。 
本发明提供的方法，包括如下步骤： 
用所述的反应试剂中的所述试剂A和所述试剂B分别对待测中华按蚊进行TaqManPCR扩增，得到A反应产物和B反应产物； 
检测反应产物，若A反应产物在FAM和VIC通道均无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因为不含或候选不含有所述突变位点的纯合型基因； 
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物在FAM和VIC通道均无信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014C的纯合型基因； 
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F的纯合型基因； 
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014C的杂合型基因； 
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F的杂合型基因； 
若A反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F和L1014C的杂合型基因。 
所述PCR扩增中，以待测中华按蚊的基因组DNA为模板； 
所述PCR扩增的退火温度为60℃-65℃，退火温度具体为60℃。 
本发明的实验证明，本发明提供的了一种快捷、简便、灵敏的中华按蚊kdr突变等位基因检测试剂盒，用来掌握中华按蚊与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的kdr等位基因的状况。 
附图说明
图1为TaqMan-MGB探针检测kdr等位基因示意图 
图2为各种基因型频率与生物抗性表型的相关性 
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 
实施例1、引物和探针的设计 
1、引物及MGB探针设计 
针对抗性中华按蚊钠通道kdr的两种点突变三种等位基因(未突变的kdr在GENBANK的登录号为JN002364，也为序列表中的序列6，其中包含L1014位点kdr基因为序列表中序列6的第1224-1226位、突变为L1014F为将序列表中序列6的第1224-1226位TTG突变为TTT、突变为L1014C为将序列表中序列6的第1224-1226位TTG突变为TGT)的情况，根据序列特征，利用Express2.0软件设计了三条探针，分别针对三种等位基因类型，为了提高退火温度，增加序列的特异性，在探针3’末端增加MGB基团提高探针序列的退火温度。 
在定量PCR仪的48孔板上，每个样本设计平行的两管扩增，第一管加探针P1、P3和非特异引物F及R，第二管加探针P2、P3和非特异引物F及R，按照Stepone realtime-PCR仪的操作规程，第一管的FAM基团设计为棕色，VIC基团设计为绿色，第二管的FAM基团设计为红色，VIC基团设计为绿色，运行结束后读取两管的扩增曲线，根据两管显示的颜色可以轻松读出扩增的等位基因类型，见图1(检测L1014和L1014C等位基因的探针1和探针2在5’标记FAM发光基团，检测L1014F等位基因的探针3在5’标记VIC发光基团。检测时将第一管中的FAM设为红色，第二管的FAM设为棕色，VIC均设为绿色。)。TaqMan Universal Master Mix由上海基康生物公司提供。探针1-3分别对应于TGT、TTG和TTT密码子。 
表1为涉及的引物及MGB探针 
Figure BDA0000105250960000051
Figure BDA0000105250960000061
2、反应体系设计 
为了即节约又能检测目的序列，设计了双管法来检测中华按蚊双突变等位基因，探针2，3和引物F及R组成一组，用来检测等位基因L(TTG)和F(TTT)；探针Probe1和探针Probe3及引物F、R组成一组，用来检测等位基因C(TGT)和F(TTT)突变。 
反应体系(1)A组： 
反应体系(2)B组： 
Figure BDA0000105250960000063
反应条件： 
Figure BDA0000105250960000064
Figure BDA0000105250960000071
实施例2、TaqMan-MGB探针检测中华按蚊钠通道三种突变类型的等位基因 
提取野外捕获的中华按蚊自然种群50个样品的基因组DNA，得到编号为1-50的样品DNA，将上述样品DNA分别按照实施例1的反应体系进行双管同时进行A组合B组的TaqMan PCR检测。 
L1014F为在kdr基因的第1014位氨基酸的等位基因含有TTT； 
L1014C为在kdr基因的第1014位氨基酸的等位基因含有TGT； 
若第一管中无FAM基团、VIC基团信号，且第二管中仅有FAM基团信号，则为则样品为L1014纯合子，突变位点碱基为TTG； 
若第一管中有FAM基团、无VIC基团信号，且第二管中无FAM基团和VIC基团信号，则样品为L1014C纯合子，碱基为TGT； 
若第一管中无FAM基团、有VIC基团信号，且第二管中只有VIC基团信号，则为则样品为L1014F纯合子，突变位点碱基为TTT； 
若第一管中有FAM基团、无VIC基团信号，且第二管中有FAM基团、无VIC基团信号，则样品为L1014C杂合子，突变位点碱基为TTG/TGT； 
若第一管中无FAM基团、有VIC基团信号，且第二管中有FAM基团和VIC基团信号，则样品为L1014F杂合子，突变位点碱基为TTG/TGT； 
若第一管中有FAM基团和VIC基团信号，且第二管中只有VIC基团信号，则样品为L1014F和L1014C突变，突变位点碱基为TTT/TGT； 
检测结果如下表2所示， 
表2为TaqMan-MGB探针平行双管法对中华按蚊kdr基因突变等位基因分型结果 
Figure BDA0000105250960000072
Figure BDA0000105250960000081
注：第一管TGT密码子用FAM1标记为红色，TTT密码子用VIC标记为绿色；第二管TTG密码子用FAM2标记为综色，TTT密码子用VIC2标记为绿色。 
经过测序，编号1(TTG)PCR扩增产物A管/B管的核苷酸序列为序列表中序列6的自5’末端第1178-1335位核苷酸，第1224-1226位的核苷酸为TTG； 
编号2(TGT)PCR扩增产物A管/B管的核苷酸序列为将序列表中序列6的自5’末端第1178-1335位核苷酸中第1224-1226位的核苷酸替换为TGT； 
编号14(TTT/TGT)PCR扩增产物A管/B管的核苷酸序列为将序列表中序列6的自5’末端第1178-1335位核苷酸中的第1224-1226位的核苷酸替换为TTT/TGT； 
编号20(TTT/TTG)PCR扩增产物A管/B管的核苷酸序列为序列表中序列6的自5’末端第1178-1335位核苷酸中的第1224-1226位的核苷酸为TTT/TTG； 
其余样本测序结果也与本发明的方法一致，说明本发明方法正确。 
实施例2、抗性试验 
中华按蚊实验室敏感品系((susceptible(Ss)mosquito)strain，记载在Song，F.L.，X.M.Cao，T.Y.Zhao，Y.D.Dong and B.L.Lu.2007.Pyrethroid resistance and distribution of kdr allele in Culex pipiens pallens in north China.Int J Pest Manag 53：25-34.，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得)：来自军事医学科学院微生物流行病研究所昆虫饲养室，隔离养殖十年以上，从未接触过任何杀虫剂。 
中华按蚊自然种群包括：中华按蚊幼虫抗性组，采自江苏省的徐州、淮阴、常熟、南京、苏州等5个地区；现场采集的幼虫数量较多时，直接进行幼虫生测，数量不够的带回实验室繁殖，利用第一代幼虫进行生物测试。 
1、用于幼虫致死中浓度测试的按蚊成蚊 
5个自然种群中华按蚊品系及编号分别是：江苏徐州品系(XZ)，江苏淮阴品系(HY)，江苏南京品系(NJ)，江苏苏州品系(SZ)和江苏常熟品系(CS)(表3)。这5个自然种群中华按蚊采自2009年7月至9月和2010年7月至9月。中华按蚊成蚊自现场采集后带回实验室昆虫饲养室饲养，蚊虫养殖均在相对稳定温度(26±1℃)、 相对湿度80±5％、光照12h/d的条件下饲养。 
将实验室敏感品系及5个地方采集自然种群尖音库蚊的幼虫做毒力测定。采用浸渍法，将杀虫剂原药(溴氰菊酯(95％，江苏扬农化工股份有限公司)；Es-生物丙烯菊酯(93％，法国罗素-优克福公司)；氯菊酯(92％，南京军区军事医学研究所)；高效氯氰菊酯(97％，天津农药股份有限公司)用丙酮配制成5-7个浓度，容器中加199ml过夜清水，放入25头4龄初期幼虫，加1ml不同梯度浓度的药液。1ml丙酮作对照，重复3次，24h观察结果，以幼虫不能逃避机械刺激为死亡。 
本研究使用高效氯氰菊酯对5个自然种群的中华按蚊及实验室敏感品系的致死中浓度(LC50)进行了测定。以敏感品系为参照，野外种群LC50除以敏感种群LC50即为抗药性指数(R/S)。 
表3为幼虫相关抗性组中华按蚊种群现场采样点的分布 
Figure BDA0000105250960000091
数据收集后用log剂量-死亡率机值曲线分析(Raymond et al.1993；Finney et al.1971)。各自然种群中华按蚊幼虫对高效氯氰菊酯均有不同程度的抗性(表4)，抗药性指数从677至2076倍不等，抗性最高的江苏常熟种群，达2076倍，抗性最低的是江苏苏州种群，抗药性指数为677倍。 
表4为5个中华按蚊种群对高效氯氰菊酯的致死中浓度测定及抗药性指数 
Figure BDA0000105250960000092
Figure BDA0000105250960000101
2、中华按蚊LC50抗药性指数与kdr等位基因频率和基因型频率的关系分析 
中华按蚊LC50抗药性指数与kdr等位基因频率构建的指数关系图形如图2，抗药性指数与F、C总的突变频率相关性明显，R＝0.981，与F突变频率的相关性指数为0.9548，与C突变的相关系数为0.9548(表5)。从以下相关性图可以看出，检测中华按蚊点突变频率也可以间接推导出种群的抗性表型。 
表5高效氯氰菊酯LC50抗药性指数与kdr基因频率、基因型频率的相关性 
Figure BDA0000105250960000102
Figure IDA0000105251050000011
Figure IDA0000105251050000021
Figure IDA0000105251050000031

Claims (10)

1.一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的专用引物，由引物1和引物2组成，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：
所述突变位点为L1014F或L1014C。
3.一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂，由试剂1和试剂2组成，
所述试剂1由权利要求1所述专用引物、探针2和探针3组成；
所述试剂1由权利要求1所述专用引物、探针1和探针3组成；
所述探针1的核苷酸序列为序列表中的序列3；
所述探针2的核苷酸序列为序列表中的序列4；
所述探针3的核苷酸序列为序列表中的序列5；
所述探针1、探针2和探针3的3’末端均标记MGB基团；
所述探针1和探针2的5’末端均标记FAM基团；
所述探针3的5’末端标记VIC基团。
4.一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的反应试剂，由试剂A和试剂B组成，所述试剂A包括权利要求3所述试剂中的所述试剂1；所述试剂B包括权利要求3所述试剂中的所述试剂2。
5.根据权利要求4所述的反应试剂，其特征在于：
所述试剂A由权利要求3所述试剂中的所述试剂1和TaqMan反应缓冲液组成；所述试剂B由权利要求3所述试剂中的所述试剂2和TaqMan反应缓冲液组成；
所述试剂中的各引物在对应的所述试剂中的浓度均为9μM；
所述试剂中的各条探针在所述对应的试剂中的浓度均为5μM；
所述试剂A和所述试剂B均为独立包装。
6.一种制备检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂盒，为包括权利要求4或5所述的反应试剂的试剂盒；
所述突变位点为L1014F或L1014C。
7.权利要求1或2所述专用引物或权利要求3所述的试剂或权利要求4或5所述反应试剂或权利要求6所述试剂盒在检测中华按蚊中kdr基因突变位点、检测中华按蚊抗药性或制备检测中华按蚊抗药性产品中的应用；所述突变位点具体为L1014F或L1014C，所述抗药性为抗菊酯类药物；所述菊酯类药物具体为溴氰菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。
8.一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的突变位点的方法，包括如下步骤：
用权利要求4或5所述的反应试剂中的所述试剂A和所述试剂B分别对待测中华按蚊进行TaqMan PCR扩增，得到A反应产物和B反应产物；
检测反应产物，若A反应产物在FAM和VIC通道均无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因不含或候选不含有所述突变位点；
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物在FAM和VIC通道均无信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014C；
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014F；
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014C；
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014F；
若A反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014F和L1014C。
9.一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的基因型的方法，包括如下步骤：
用权利要求4或5所述反应试剂中的所述试剂A和所述试剂B分别对待测中华按蚊进行TaqMan PCR扩增，得到A反应产物和B反应产物；
检测反应产物，若A反应产物在FAM和VIC通道均无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因为不含或候选不含有所述突变位点的纯合型基因；
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物在FAM和VIC通道均无信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014C的纯合型基因；
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F的纯合型基因；
若A反应产物在FAM通道有信号且在VIC通道无信号，且B反应产物仅在FAM通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014C的杂合型基因；
若A反应产物在FAM通道无信号且在VIC通道有信号，且B反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F的杂合型基因；
若A反应产物在FAM通道和VIC通道均有信号，且B反应产物仅在VIC通道有信号，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F和L1014C的杂合型基因。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于：
所述PCR扩增中，以待测中华按蚊的基因组DNA为模板；
所述PCR扩增的退火温度为60℃-65℃，退火温度具体为60℃。
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