CN103388022A - 检测家蝇对杀虫剂靶标抗性的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测家蝇对杀虫剂靶标抗性的方法和一种用于家蝇对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性检测的试剂盒。采用根据家蝇钠离子通道基因的敏感与抗性基因型设计的特异性引物，以单头家蝇的基因组DNA为模板，进行钠离子通道基因片段的PCR扩增，再用限制性内切酶消化PCR产物，根据酶切产物的电泳检测结果来区分家蝇个体钠离子通道基因的基因型。该方法具有快速、简便和准确性高的优点，可用于家蝇对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的监测与预测。
Description
技术领域
本发明涉及家蝇钠离子通道杀虫剂抗性基因型的分子检测技术，属于生物技术领域，适合用于家蝇对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的快速检测。
背景技术
家蝇（Musca domestica）是一种重要的疾病传媒，可以传播100多种人畜疾病，包括一些抗生素耐药致病菌。同时，家蝇也是重要的畜牧业害虫，家蝇的侵扰导致畜禽产品产量和质量的降低。因此家蝇种群的控制对于人类的健康和国民经济的发展都具有十分重要的意义。家蝇的防治长期以来主要依赖化学农药，抗药性问题突出。抗药性导致杀虫剂杀虫效率的下降，由此引发诸如杀虫剂使用次数和剂量增加，虫媒人畜疾病的流行等问题己给人类带来巨大损失。
DDT农药和拟除虫菊酯杀虫剂（如溴氰菊酯）已广泛用于家蝇的防治，许多报告表明，我国家蝇种群对这些杀虫剂普遍产生了抗性。家蝇抗药性的治理以及抗药性的检测是科学制定有效的防治措施的前提，对减少化学药剂对环境的污染和合理制定抗药性治理具有重要的指导意义。
以往，家蝇对拟除虫菊酯类的抗性的检测常采用生物测定，这种方法存在如下缺点：（1）试验周期长：一般需要24小时以上才能得到生测结果；（2）对试虫的数量和质量要求高：为保证生测结果的准确性，需要使用特定生理状态的试虫；（3）难于检测早期抗性和预测抗性的发展趋势：生物测定的方法只能记录杀虫剂剂量和试虫死亡率的信息，而无法测定个体的基因型。这些缺点给家蝇抗性的监测带来了很大的困难。
近年来，随着对家蝇抗药性抗性分子机制的了解以及分子生物学技术的发展和相关仪器设备的普及，国内外开始建立和推广家蝇抗药性的分子检测技术。经过多年的研究发现，家蝇对拟除虫菊酯类及DDT抗性的主要机制之一是钠离子通道基因的点突变导致家蝇对农药的敏感性下降（即靶标不敏感性）。
当前通过分子生物学机制检测家蝇抗药性的方法主要为检测家蝇钠离子通道蛋白在1014位点的氨基酸变异（参见参考文献1-9），具体地，检测在此位点上亮氨酸（L）变为苯丙氨酸（F）的变异（称为kdr）。在我国，家蝇钠离子通道蛋白在1014位点的氨基酸变异还包括由亮氨酸（L）变为组氨酸（H）（称为kdr-his）。在我国，L1014H变异比1014F抗性突变的频率更高、分布更广（参见参考文献10）。单独对此位点上亮氨酸（L）变为苯丙氨酸（F）的变异（称为kdr）进行检测时，无法对家蝇种群的抗药性进行准确的评价，从而选择合适的杀虫方案。
发明内容
本发明根据我们对我国各地家蝇抗药性机制的研究结果，提出了家蝇抗药性的分子检测方法，包括L1014F和L1014H这两个抗性相关基因突变的检测方法。同时本发明还提供了用于检测家蝇抗药性的试剂盒。
在本发明的一个方面，公开了一种检测家蝇对杀虫剂靶标抗性的方法，所述杀虫剂为DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂，其特征在于所述的方法包含步骤：（1）提取单头家蝇基因组DNA；（2）检测家蝇钠离子通道基因1014位上的L1014F突变和L1014H突变。
在本发明的一个优选的方面，所述的家蝇钠离子通道基因的序列选自SEQ ID NO:５（钠离子通道基因1014L）、SEQ ID NO:6（钠离子通道基因1014F）和SEQ ID NO:7（钠离子通道基因1014H）。
在本发明的一个优选的方面，所述的分子检测是通过PCR方法进行的；优选地，所述的PCR使用下列引物：
P1：GTGCTGTGCGGAGAGTGG（SEQ ID NO:1）、
P2：GAAGCCTCCATCCTGGGAG（SEQ ID NO:2）、
P3：AGCTGTATACCCTTCTTCT（SEQ ID NO:3）、以及
P4：CGAAGTTGGACAAAAGCAAA（SEQ ID NO:4）。
在本发明的一个优选的方面，上述方法还包括步骤：将PCR产物使用DNA限制性内切酶Tsp509I或Nla III进行切割，并对切割后的核酸片段进行检测。
在本发明的一个优选的方面，检测家蝇钠离子通道基因1014位的表型包括执行以下的步骤：a）使用引物P1和P2对家蝇基因组DNA进行PCR；
b）使用引物P3和P4对家蝇基因组DNA进行PCR；c）使用DNA限制性内切酶Tsp509Ｉ将步骤a）得到的PCR产物进行酶切；d）使用DNA限制性内切酶Nla III将步骤b）得到的PCR产物进行酶切；以及e）将步骤c）和d）步骤中得到的酶切产物进行电泳检测；优选地，所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳。
在本发明的一个进一步优选的方面，在步骤a）和步骤b）中的PCR条件为94℃，4分钟，35个周期；94℃，30s；52℃，30s；72℃，30s；72℃，10分钟。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于家蝇对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性检测的试剂盒，该试剂盒包括：（1）用于提取单头家蝇基因组DNA的试剂；（2）用于检测家蝇钠离子通道基因1014位的表型的试剂。
在本发明的一个优选的方面，所述的用于检测家蝇钠离子通道基因1014位的表型的试剂包含下列引物：
P1：GTGCTGTGCGGAGAGTGG（SEQ ID NO:1）、
P2：GAAGCCTCCATCCTGGGAG（SEQ ID NO:2）、
P3：AGCTGTATACCCTTCTTCT（SEQ ID NO:3）、以及
P4：CGAAGTTGGACAAAAGCAAA（SEQ ID NO:4）。
在本发明的一个优选的方面，所述的用于检测家蝇钠离子通道基因1014位的表型的试剂包含DNA限制性内切酶Tsp509Ｉ和DNA限制性内切酶NlaIII。
在本发明的技术方案中，L1014F突变和L1014H突变是家蝇kdr和kdr-his抗性相关变异。其中，kdr抗性相关变异为钠离子通道基因产生了L1014F突变，kdr-his抗性相关变异为钠离子通道基因产生了L1014H突变；1014H和1014F对应的基因型为1014L（表型为杀虫剂敏感型）；所述家蝇钠离子通道基因序列对应于SEQ ID NO:5(钠离子通道基因型1014L)、６(钠离子通道基因型1014F)、7(钠离子通道基因型1014H)。
本发明相比现有技术有如下优点：
1．本发明建立的分子检测技术与传统生物测定相比具有如下优点：
（1）需要生物材料少，数量在50-200头就可以满足检测要求；
（2）对材料的要求低：可以采用任何发育阶段的样品，可以用活体，也可以用保存的样品，可以用整头家蝇，也可以用虫体的某一部位（如双翅、足等）；
（3）可以区分种群的杂/纯合状态：有利预测种群抗性基因频率的变化趋势，便于抗性的早期诊断；
（4）快速：从DNA的提取到PCR产物的检测，数小时就可以完成；
（5）准确性高：充分利用DNA内切酶的对核苷酸序列的选择性。
2．本发明与其它文献报道的用于家蝇抗性检测的分子检测方法（参见参考文献12）相比，优点在于：
（1）覆盖面更广：不仅可以检测1014F,还可以检测1014H这一在我国自然种群家蝇中普遍存在的抗性基因型；
（2）准确性更高:利用特定限制性内切酶对序列的高度选择性，具有很高的准确性；
（3）该发明所用引物，是通过优化而选择，特异性强，效率高；扩增的产物只包含一个基因型特异性酶切位点，且产物大小适合电泳检测，便于基因型的准备准确识别。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
图1显示了家蝇钠离子通道六种基因型家蝇钠离子通道PCR产物的Tsp509I DNA内切酶的酶切结果，其中，M代表DNA分子量标记(50bpDNA ladder,天根公司)；
图２家蝇钠离子通道六种基因型家蝇钠离子通道PCR产物的NlaIIIDNA内切酶的酶切结果。其中，M代表DNA分子量标记(50bp DNA ladder,天根公司)。
具体实施方式
本发明所使用的不同基因型的家蝇均采自北京朝阳区奥林匹克公园垃圾站，保存于中国科学院动物研究所。
本发明所使用的试剂配制方法如下：
（1）溶液A：含100mM Tris HCl pH 8.0，10mM EDTA，50mM NaCl（高压灭菌，室温保存）；
（2）0.15M精胺（spermine）（过滤灭菌，分装保存在-20℃）(Fluka公司)；
（3）0.5M亚精胺（spermidine）（过滤灭菌，分装保存在-20℃）（Fluka公司）；
（4）20mg/ml蛋白酶K(过滤灭菌，分装保存在-20℃)（Merck公司）；
（5）10%SDS，用溶液A配制，无须灭菌；
（6）8M醋酸钾（室温保存，100ml水中溶解醋酸钾78.51g）；
（7）裂解缓冲液（现配现用）：为溶液A含1%SDS，0.15mM精胺，0.5mM亚精胺和0.1mg/ml(20U/mg)蛋白酶K。
实施例1单头家蝇基因组DNA的提取方法
采用Rinkevich FD et al.Frequencies of the pyrethroid resistance alleles ofVssc1and CYP6D1in house f1ies from the eastern United States.Insect MolecularBiology(2006),15(2),157–167（参考文献11）的方法进行以下试验。
（1）取单头家蝇（去腹部）置于1.5ml体积的离心管(eppendorf管)中，加入0.5ml裂解缓冲液,碾磨将虫体捣碎，置60℃温浴，20分钟后取出；
（2）加75μl的8M醋酸钾，混匀，置冰上10分钟；
（3）14000g离心5min，取400μl上清液（避免取到沉淀）转至新的离心管；
（4）在上清液中加入800μl（上清液的2倍体积）100%冰冷乙醇，室温放置10min；
（5）在14,000g的转速下离心10分钟，弃上清，沉淀用0.5ml 70%乙醇清洗；
（6）在14,000g的转速下离心5分钟，沉淀干燥后，加入50μl水重溶。
制备的DNA样品可直接用于后续的PCR，也可以将样品保存在4℃下备用，或在-20℃条件下长期保存。
实施例2家蝇kdr和kdr-his抗性突变的分子检测
１．酶切反应A的设置和酶切产物的电泳检测：
（1）PCR引物：
一共有2个引物(委托Invitrogen公司合成)，其中
P1：为正向引物，序列为：GTGCTGTGCGGAGAGTGG（SEQ ID NO:1）；
P2：为反向引物，序列为：GAAGCCTCCATCCTGGGAG(SEQ ID NO:2）。
（2）PCR反应设置：
PCR反应体系为30μl，含:
10×PCR缓冲液(Takara公司，100mM Tris-HCL,500mM KCL,15mMMgCL2)3.0μl，
dNTP（2.5mM）3.0μl，
引物P1（10mM）和P2（10mM）各0.8μl，
按照实施1的方法得到的DNA 2.0μl，
Taq酶(Takara公司，r-Taq，5U/μl)0.4μl，
灭菌水：20μl。
（3）PCR反应程序：
94℃，4分钟，
94℃30s，63℃30s，72℃30s，进行35个循环，
72℃10分钟。
（4）PCR产物的电泳检测：
将PCR产物在2.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在160V，电泳18min后在紫外光下检测，为一条156bp大小的目的条带。
(5)酶切反应A设置和电泳检测：
设置20μl的酶切反应A，其中含缓冲液1（可购自New England Biolabs，商品名为“Buffer 1”）2μl，DNA限制性内切酶Tsp509Ｉ（可购自New EnglandBiolabs，浓度为10U/μl）0.3μl，步骤2）中得到的PCR产物10μl，用灭菌水补齐至20μl，在65℃下温育３小时。之后取10μl酶切后产物在2.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在160V，电泳18min后在紫外光下检测。检测结果如图1所示。
２．酶切反应B的设置和酶切产物的电泳检测
（1）PCR引物：
一共有2个引物(委托Invitrogen公司合成)，其中
P3：为正向引物，序列为AGCTGTATACCCTTCTTCT（SEQ ID NO:3）；
P4：为反向引物，序列为CGAAGTTGGACAAAAGCAAA（SEQ ID NO:4）。
（2）PCR反应设置：
PCR反应体系为30μl，其含：
10×PCR缓冲液(Takara公司，100mM Tris-HCL,500mM KCL,15mMMgCL2)3.0μl，
dNTP（2.5mM）3.0μl，
引物P3（10mM）和P4（10mM）各0.8μl，
按照实施1的方法得到的DNA 2.0μl，
Taq酶(Takara公司，r-Taq，5U/μl)0.4μl,
灭菌水：20μl。
（3）PCR反应程序：
94℃,4分钟，
94℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环，
72℃10分钟。
（4）PCR产物的电泳检测：
将PCR产物在2.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在160v,电泳18min后在紫外光下检测，为一条220bp的目的条带。
（5）酶切反应Ｂ设置和电泳检测：
设置20μl的酶切反应B，其中含缓冲液4（可购自New England Biolabs，商品名为“Buffer 4”）2μl,DNA限制性内切酶Nla III（可购自New EnglandBiolabs，浓度为10U/μl）0.3μl，步骤2）中得到的PCR产物10μl，100X BSA（可购自New England Biolabs）0.2μl，用灭菌水补齐至20μl，在37℃下温育３小时。之后取10μl酶切后产物在2.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在160V，电泳18min后在紫外光下检测。检测结果如图２所示。
3.基因型的判别
钠离子通道1014位点有三种非同义突变(L、F和H)，因此理论上家蝇个体可以有６种不同的基因型，基因型可以根据酶切反应后的电泳检测显示的产物条带数和大小来区分，见下表，表中的数值为条带的大小，单位为碱基对（bp）。
表1不同基因型中电泳条带的理论值
| L/L | L/F | F/F | L/H | H/H | F/H | |
| 反应A | 156 | 156,96,60 | 96,60 | 156 | 156 | 156,96,60 |
| 反应B | 220 | 220 | 220 | 220,170,50 | 170,50 | 220,170,50 |
在本实施例中，针对多个样品进行了观测，并且得到了电泳表现不同的六种类型，六种类型的电泳检测结果分别见图1和图2中。参考不同基因型中电泳条带的理论值，分别推断了其基因型的种类。其中反应B所得到的50bp条带在电泳胶的底部（图2），不容易看到，从理论上该条带与170bp条带相伴产生，在结果判读中，只需根据220bp和170bp出现与否足于判断基因型。
从电泳图中可以看出，采用本申请所述的引物和检测条件，能够清楚地对家蝇在钠离子通道1014位点上的表型进行判断。
参考文献
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Claims (10)
1.一种检测家蝇对杀虫剂靶标抗性的方法，所述杀虫剂为DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂，其特征在于所述的方法包含步骤：
（1）提取单头家蝇基因组DNA；
（2）检测家蝇钠离子通道基因1014位上的L1014F突变和L1014H突变。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的家蝇钠离子通道基因的序列选自SEQ ID NO:５、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7。
3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述的检测是通过PCR方法进行的。
4.权利要求3所述的方法，其中所述的PCR方法使用下列引物：
P1：GTGCTGTGCGGAGAGTGG（SEQ ID NO:1）、
P2：GAAGCCTCCATCCTGGGAG（SEQ ID NO:2）、
P3：AGCTGTATACCCTTCTTCT（SEQ ID NO:3）、以及
P4：CGAAGTTGGACAAAAGCAAA（SEQ ID NO:4）。
5.权利要求4所述的方法，其中还包括步骤：将PCR产物使用DNA限制性内切酶Tsp509I或Nla III进行切割，并对切割后的核酸片段进行检测。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于检测家蝇钠离子通道基因1014位的表型包括执行以下的步骤：
a）使用引物P1和P2对家蝇基因组DNA进行PCR；
b）使用引物P3和P4对家蝇基因组DNA进行PCR；
c）使用DNA限制性内切酶Tsp509I将步骤a）得到的PCR产物进行酶切；
d）使用DNA限制性内切酶Nla III将步骤b）得到的PCR产物进行酶切；以及
e）将步骤c）和d）步骤中得到的酶切产物进行电泳检测；
优选地，所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于在步骤a）和步骤b）中的PCR条件为94℃，4分钟，35个周期；94℃，30s；52℃，30s；72℃，30s；72℃，10分钟。
8.一种用于家蝇对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性检测的试剂盒，该试剂盒包括：
（1）用于提取单头家蝇基因组DNA的试剂；
（2）用于检测家蝇钠离子通道基因1014位的表型的试剂。
9.权利要求8所述的试剂盒，其中所述的用于检测家蝇钠离子通道基因1014位的表型的试剂包含下列引物：
P1：GTGCTGTGCGGAGAGTGG（SEQ ID NO:1）、
P2：GAAGCCTCCATCCTGGGAG（SEQ ID NO:2）、
P3：AGCTGTATACCCTTCTTCT（SEQ ID NO:3）、以及
P4：CGAAGTTGGACAAAAGCAAA（SEQ ID NO:4）。
10.权利要求8或9所述的试剂盒，其中所述的用于检测家蝇钠离子通道基因1014位的表型的试剂包含DNA限制性内切酶Tsp509Ｉ和DNA限制性内切酶Nla III。
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Also Published As
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|---|---|
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