CN109337848B - 一种同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明公开的同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌，通过对受体菌进行如下改造得到：敲除受体菌的xylB基因、glcD基因、aceB基因、glcB基因、gcl基因、aceEF基因；增加受体菌中dte基因、fucK基因、fucA基因、aldA基因、ackA基因、pta基因编码蛋白质的含量。本发明获得的工程菌株，有利于简化PLGA的合成步骤，同时生产乙醇酸和乳酸两种单体，并且重组菌在摇瓶培养中的乙醇酸和乳酸的产量能达到理想水平，具有较好的应用前景。

Description

一种同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌及其构建方法和 应用
技术领域
本发明属于生物技术、基因工程和发酵工程领域，涉及一种利用木糖、葡萄糖和乙酸三种底物进行发酵同时生产乙醇酸和乳酸两种产物的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
乙醇酸又称羟基乙酸，是最简单的α-羟基羧酸。作为重要的化工产品和有机合成中间体，乙醇酸在化工、医药、纺织和冶金等多个领域有广泛应用。例如，2％乙醇酸和1％甲酸的混合酸是一种高效低成本的清洗剂，可用于锅炉、管道、冷凝器和热交换器等的清洗；乙醇酸分子小，能有效渗透毛孔，解决皮肤老化、皱纹和暗疮等问题，常用作化妆品添加剂；纺织行业中常用乙醇酸作为染整羊毛纤维及纤维素织品的交联耦合剂；另外，乙醇酸还可用作杀菌剂、粘接剂、石油破乳剂、焊接剂以及化学助剂等。2011年，乙醇酸市场利润为9330万美元，预计2018年可能超过2亿美元。
在自然界中，乙醇酸存在于甘蔗、甜菜以及未成熟的葡萄汁中，含量低且与多种物质共存，分离纯化较为困难。工业上普遍采用化学合成的方法获得乙醇酸，例如氯乙酸法、甲醛羰基化法和氰化法等。化学法生产乙醇酸虽然工艺较为成熟，但是普遍存在原料毒性大(甲醛、一氧化碳和氰化物等)、生产条件苛刻(强酸或强碱、高温高压等)、反应设备要求高、分离纯化复杂和环境污染等问题，不符合当前低碳环保的可持续发展理念，迫切需要开发新的绿色合成工艺。通过微生物发酵的方法利用可再生生物质资源来获得乙醇酸，能够避免化学法合成的弊端，符合绿色化工发展的要求。
乳酸又名2-羟基丙酸，是比乙醇酸多一个碳原子的羟基羧酸。乳酸在自然界中普遍存在，根据其旋光性不同，有D-乳酸、L-乳酸和D,L-乳酸三种形式，其中L-乳酸对人体无毒害作用，广泛应用于食品、饮料、医药和化妆品等领域。此外，乳酸能够通过化学法聚合为聚乳酸，可作为生物可降解材料使用。2015年，全球乳酸产量约为50万吨，用于食品和饮料领域的占比接近50％，用于聚乳酸领域的占比超过30％。
乳酸的制备方法有化学法、酶法和微生物发酵法。微生物发酵法具有生产成本低、原料来源广、产物光学纯度高等优点，是目前工业上生产乳酸的主要方法。发酵使用的菌种有乳杆菌Lactobacillus、芽孢杆菌Bacillus、米根霉Rhizopus、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae和大肠杆菌Escherichia coli等，主要生产企业有荷兰Corbion-Purac、美国Cargill与Archer Daniels Midland、比利时Galactic和日本武藏野等。利用非粮廉价原料例如纤维素、木薯、糖蜜和菊芋等发酵生产乳酸已有若干研究，但是玉米淀粉仍是目前大规模使用的原料，由此导致乳酸价格偏高，限制了其广泛应用。
乳酸和乙醇酸可以通过化学法共聚合成聚乳酸-乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)。PLGA具有良好的生物相容性和生物可降解性，可作为生物医用材料使用。与聚乳酸(polylactic acid，PLA)或者聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)相比，PLGA共聚物具有更加多样的材料学性能。PLGA是少数几种美国食品药品管理局(FDA)批准的生物可降解医用材料之一，常用作手术缝合线、药物缓释载体、骨科固定及组织修复材料等。在药物缓释领域，PLGA是近年来文献报导最多的微球包覆材料之一，涉及的药物包括紫杉醇、阿霉素等小分子，重组生长激素、胰岛素等多肽和蛋白质大分子，以及多种疫苗等。PLGA的合成需要分别制备乳酸和乙醇酸单体，再进行化学法聚合。乳酸主要通过发酵法生产，乙醇酸主要通过氯乙酸法、甲醛羰基化法和氰化法等化学法生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何利用木糖、葡萄糖和乙酸同时生产出乙醇酸和乳酸。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了重组菌的构建方法，所述方法包括对受体菌进行下述A1-A12的改造，得到所述重组菌；
A1、敲除所述受体菌的木酮糖激酶基因(xylB基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：948133)或抑制所述xylB基因的表达或抑制所述xylB基因编码的蛋白质的活性；
A2、敲除所述受体菌的乙醇酸氧化酶基因(glcD基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：947353)或抑制所述glcD基因的表达或抑制所述glcD基因编码的蛋白质的活性；
A3、敲除所述受体菌的苹果酸合酶A基因(aceB基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：948512)或抑制所述aceB基因的表达或抑制所述aceB基因编码的蛋白质的活性；
A4、敲除所述受体菌的苹果酸合酶G基因(glcB，GeneBank号：NC_000913.3，GeneID：948857)基因或抑制所述glcB基因的表达或抑制所述glcB基因编码的蛋白质的活性；
A5、敲除所述受体菌的羟丙二酸半醛合酶基因(gcl基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：945394)或抑制所述gcl基因的表达或抑制所述gcl基因编码的蛋白质的活性；
A6、敲除所述受体菌的丙酮酸脱氢酶基因(aceE基因和aceF基因，记为aceEF基因；aceE基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：944834；aceF基因，GeneBank号：NC_000913.3，Gene ID：944794)或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性；
A7、增加所述受体菌中磷酸戊糖异构酶基因(dte基因)编码蛋白质的含量或增强所述dte基因编码蛋白质的活性；
A8、增加所述受体菌中墨角藻糖激酶基因(fucK基因)编码蛋白质的含量或增强所述fucK基因编码蛋白质的活性；
A9、增加所述受体菌中墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶基因(fucA基因)编码蛋白质的含量或增强所述fucA基因编码蛋白质的活性；
A10、增加所述受体菌中醛脱氢酶基因(aldA基因)编码蛋白质的含量或增强所述aldA基因编码蛋白质的活性；
A11、增加所述受体菌中乙酸激酶基因(ackA基因)编码蛋白质的含量或增强所述ackA基因编码蛋白质的活性；
A12、增加所述受体菌中磷酸转乙酰酶基因(pta基因)编码蛋白质的含量或增强所述pta基因编码蛋白质的活性；
所述受体菌为含有所述xylB基因、所述glcD基因、所述aceB基因、所述glcB基因、所述gcl基因和所述aceEF基因的细菌或真菌。
上述方法中，所述受体菌为1)或2)：
1)大肠杆菌；
2)大肠杆菌MG1655。
上述方法中，所述dte基因编码蛋白质为下述a1)或a2)的蛋白质：
a1)序列表中序列12所示的蛋白质；
a2)将序列表中序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述fucK基因编码蛋白质为下述b1)或b2)的蛋白质：
b1)序列表中序列13所示的蛋白质；
b2)将序列表中序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述fucA基因编码蛋白质为下述c1)或c2)的蛋白质：
c1)序列表中序列14所示的蛋白质；
c2)将序列表中序列14的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述aldA基因编码蛋白质为下述d1)或d2)的蛋白质：
d1)序列表中序列15所示的蛋白质；
d2)将序列表中序列15的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述ackA基因编码蛋白质为下述e1)或e2)的蛋白质：
e1)序列表中序列16所示的蛋白质；
e2)将序列表中序列16的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述pta基因编码蛋白质为下述f1)或f2)的蛋白质：
f1)序列表中序列17所示的蛋白质；
f2)将序列表中序列17的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
上述方法中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述方法中，A1通过向所述受体菌中导入含有所述xylB基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A2通过向所述受体菌中导入含有所述glcD基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A3通过向所述受体菌中导入含有所述aceB基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A4通过向所述受体菌中导入含有所述glcB基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A5通过向所述受体菌中导入含有所述gcl基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A6通过向所述受体菌中导入含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A7通过向所述受体菌中导入含有所述dte基因的dte基因表达盒实现；
和/或，A8通过向所述受体菌中导入含有所述fucK基因的fucK基因表达盒实现；
和/或，A9通过向所述受体菌中导入含有所述fucA基因的fucA基因表达盒实现；
和/或，A10通过向所述受体菌中导入含有所述aldA基因的aldA基因表达盒实现；
和/或，A11通过向所述受体菌中导入含有所述ackA基因的ackA基因表达盒实现；
和/或，A12通过向所述受体菌中导入含有所述pta基因的pta基因表达盒实现。
向所述受体菌中导入各表达盒均可通过将含有相应表达盒的表达载体导入所述受体菌中实现。
所述表达载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为质粒pBBR1MCS-2。
上述方法中，各基因的敲除均可通过λ-red同源重组方式实现。
上述方法中，所述含有所述xylB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列6所示的DNA分子；
所述含有所述glcD基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列7所示的DNA分子；
所述含有所述aceB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列8所示的DNA分子；
所述含有所述glcB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列9所示的DNA分子；
所述含有所述gcl基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列10所示的DNA分子；
所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列11所示的DNA分子；
和/或，所述dte基因表达盒、所述fucK基因表达盒、所述fucA基因表达盒、所述aldA基因表达盒、所述ackA基因表达盒和所述pta基因表达盒中启动子为下述j1)或j2)：
j1)序列表中序列1的第9-51位所示的DNA分子；
j2)与j1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；
和/或，所述dte基因表达盒中所述dte基因为下述k1)或k2)：
k1)序列表中序列1的第70-942位所示的DNA分子；
k2)与k1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
和/或，所述fucK基因表达盒中所述fucK基因为下述l1)或l2)：
l1)序列表中序列2的第70-1518位所示的DNA分子；
l2)与l1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
和/或，所述fucA基因表达盒中所述fucA基因为下述m1)或m2)：
m1)序列表中序列3的第70-717位所示的DNA分子；
m2)与m1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
和/或，所述aldA基因表达盒中所述aldA基因为下述n1)或n2)：
n1)序列表中序列4的第70-1509位所示的DNA分子；
n2)与n1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
和/或，所述ackA基因表达盒中所述ackA基因为下述o1)或o2)：
o1)序列表中序列5的第70-1272位所示的DNA分子；
o2)与o1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；
和/或，所述pta基因表达盒中所述pta基因为下述p1)或p2)：
p1)序列表中序列5的第1347-3491位所示的DNA分子；
p2)与p1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
上述方法中，所述75％或75％以上同一性均可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述方法中，所述dte基因表达盒为序列表中序列1的第9-942位所示的DNA分子；
所述fucK基因表达盒为序列表中序列2的第9-1518位所示的DNA分子；
所述fucA基因表达盒为序列表中序列3的第9-717位所示的DNA分子；
所述aldA基因表达盒为序列表中序列4的第9-1509位所示的DNA分子；
所述ackA基因表达盒和所述pta基因表达盒为序列表中序列5的第9-3491位所示的DNA分子。
本发明还提供了利用所述方法制备的重组菌。
本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂由所述含有所述xylB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述glcD基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述aceB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述glcB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述gcl基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段、所述dte基因表达盒、所述fucK基因表达盒、所述fucA基因表达盒、所述aldA基因表达盒、所述ackA基因表达盒和所述pta基因表达盒组成。
所述成套试剂可用于生产乙醇酸和乳酸，也可用于降解木糖和/或葡萄糖。
本发明还提供了所述成套试剂或所述重组菌的下述任一应用：
X1、生产乙醇酸和乳酸；
X2、制备生产乙醇酸和乳酸产品；
X3、降解木糖和/或葡萄糖；
X4、制备降解木糖和/或葡萄糖产品。
本发明还提供了生产乙醇酸和乳酸的方法，所述方法包括：以乙酸、木糖和葡萄糖为碳源，利用所述重组菌进行生物转化，制备得到乙醇酸和乳酸。
其中，进行所述生物转化可利用MM液体培养基进行。
所述MM液体培养基的组成如下：每升培养基含5g木糖、5g葡萄糖、5g乙酸、2gNH4Cl、5g(NH4)2SO4、6g KH2PO4、8g 3-吗啉丙磺酸、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.05g卡那霉素、2g酵母粉，余量为水。
所述微量元素溶液的组成如下：每升微量元素溶液含3.6g FeCl2·4H2O、5gCaCl2·2H2O、1.3g MnCl2·2H2O、0.38g CuCl2·2H2O、0.5g CoCl2·6H2O、0.94g ZnCl2、0.03g H3BO3、0.4g Na2EDTA·2H2O、1g thiamine-HCl，其余为0.5M HCl。
所述生物转化的条件可为：30-37℃(如37℃)摇瓶振荡培养24-72h(如48h)。摇瓶的转速具体可调整。
本发明的有益效果：本发明通过在大肠杆菌中表达6个代谢途径相关的基因和敲除7个内源基因，获得了能够以木糖、葡萄糖和乙酸为碳源，同时获得乙醇酸和乳酸的工程菌株，有利于简化PLGA的合成步骤，并且重组菌在摇瓶培养中的乙醇酸和乳酸的产量和得率能达到较高的水平，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为pMCS-GALA1载体图谱。
图2为pMCS-GALA2载体图谱。
图3为pMCS-GALA3载体图谱。
图4为pMCS-GALA4载体图谱。
图5为pMCS-GALA5载体图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中涉及分子生物学操作所用的酶，均为NEB(New England Biolabs，http://www.neb-china.com/)公司产品；质粒提取和DNA片段回收所用的试剂盒，均为北京博迈德基因技术有限公司(http://www.biomed168.com/)产品；实施例中涉及的DNA合成和测序工作，由北京博迈德基因技术有限公司完成。
E.coli MG1655：来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center(http://cgsc2.biology.yale.edu/)，编号CGSC#6300。
E.coli NEB 5-alpha：来源于NEB(New England Biolabs)，货号C2987I。
质粒pKD13：来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center，编号CGSC#7633。
质粒pKD46：来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center，编号CGSC#7739。
质粒pCP20：来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center，编号CGSC#7637。
质粒pBBR1MCS-2：公众可根据NCBI accession number U23751.1的序列自行提交基因合成公司获得，该质粒记载在如下文献中：Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistancecassettes,1995,Gene,166:175-176。
MM液体培养基的组成如下：每升培养基含5g木糖、5g葡萄糖、5g乙酸、2g NH4Cl、5g(NH4)2SO4、6g KH2PO4、8g 3-吗啉丙磺酸、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.05g卡那霉素、2g酵母粉，余量为水。
微量元素溶液的组成如下：每升微量元素溶液含3.6g FeCl2·4H2O、5g CaCl2·2H2O、1.3g MnCl2·2H2O、0.38g CuCl2·2H2O、0.5g CoCl2·6H2O、0.94g ZnCl2、0.03gH3BO3、0.4g Na2EDTA·2H2O、1g thiamine-HCl，其余为0.5M HCl。
实施例1、构建重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA5)和E.coli GALA6(pMCS-GALA4)
一、重组表达载体pMCS-GALA5的构建
1、人工合成序列表中序列1所示的DNA，含有dte表达盒，上游为SacI位点，下游为XbaI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-942位核苷酸为dte基因序列。
2、人工合成序列表中序列2所示的DNA，含有fucK表达盒，上游为XbaI位点，下游为HindIII位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1518位核苷酸为fucK基因序列。
3、人工合成序列表中序列3所示的DNA，含有fucA表达盒，上游为HindIII位点，下游为XhoI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-717位核苷酸为fucA基因序列。
4、人工合成序列表中序列4所示的DNA，含有aldA表达盒，上游为XhoI位点，下游为ApaI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1509位核苷酸为aldA基因序列。
5、人工合成序列表中序列5所示的DNA，含有ackA和pta表达盒，上游为ApaI位点，下游为KpnI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1272位核苷酸为ackA基因序列，第1347-3491位核苷酸为pta基因序列。
6、用SacI和XbaI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小约为936bp的DNA片段；用SacI和XbaI双酶切质粒pBBR1MCS-2，回收大小约为5124bp的DNA片段；将上述约936bp和5124bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB5-alpha中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用SacI和XbaI进行酶切验证，得到的酶切产物大小约为936bp和5124bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GALA1。将得到的重组质粒pMCS-GALA1进行测序验证，结果表明：pMCS-GALA1为将质粒pBBR1MCS-2的SacI和XbaI的识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1的第9-942位所示的dte表达盒得到的重组质粒。
7、用XbaI和HindIII双酶切步骤2中合成的DNA序列，回收大小约为1516bp的DNA片段；用XbaI和HindIII双酶切步骤6中得到的质粒pMCS-GALA1，回收大小约为6018bp的DNA片段；将上述约1516bp和6018bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用XbaI和HindIII进行酶切验证，酶切产物大小约为1516bp和6018bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GALA2。将得到的重组质粒pMCS-GALA2进行测序验证，结果表明：pMCS-GALA2为将质粒pMCS-GALA1的XbaI和HindIII的识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2的第9-1518位所示的fucK表达盒得到的重组质粒。
8、用HindIII和XhoI双酶切步骤3中合成的DNA序列，回收大小约为715bp的DNA片段；用HindIII和XhoI双酶切步骤7中得到的质粒pMCS-GALA2，回收大小约为7513bp的DNA片段；将上述约715bp和7513bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用HindIII和XhoI进行酶切验证，酶切产物大小约为715bp和7513bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GALA3。将得到的重组质粒pMCS-GALA3进行测序验证，结果表明：pMCS-GALA3为将质粒pMCS-GALA2的HindIII和XhoI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列3的第9-717位所示的fucA表达盒得到的重组质粒。
9、用XhoI和ApaI双酶切步骤4中合成的DNA序列，回收大小约为1511bp的DNA片段；用XhoI和ApaI双酶切步骤8中得到的质粒pMCS-GALA3，回收大小约为8215bp的DNA片段；将上述约1511bp和8215bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用XhoI和ApaI进行酶切验证，酶切产物大小约为1511bp和8215bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GALA4。将得到的重组质粒pMCS-GALA4进行测序验证，结果表明：pMCS-GALA4为将质粒pMCS-GALA3的XhoI和ApaI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列4的第9-1509位所示的aldA表达盒得到的重组质粒。
10、用ApaI和KpnI双酶切步骤5中合成的DNA序列，回收大小约为3489bp的DNA片段；用ApaI和KpnI双酶切步骤9中得到的质粒pMCS-GALA4，回收大小约为9720bp的DNA片段；将上述约3489bp和9720bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用ApaI和KpnI进行酶切验证，酶切产物大小约为3489bp和9720bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-GALA5。将得到的重组质粒pMCS-GALA5进行测序验证，结果表明：pMCS-GALA5为将质粒pMCS-GALA4的ApaI和KpnI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列5的第9-3491位所示的ackA和pta表达盒得到的重组质粒。
二、大肠杆菌E.coli GALA6的构建
1、敲除xylB基因
1)合成xylB基因敲除所用的引物xylBF和xylBR，序列如下：
xylBF：5’-ATGTATATCGGGATAGATCTTGGCACCTCGGGCGTAAAAGTTATTTTGCTCAACGAGCAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
xylBR：5’-TTACGCCATTAATGGCAGAAGTTGCTGATAGAGGCGACGGAACGTTTCTCGTCGTGGCTGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’。
2)以质粒pKD13为模板，采用引物xylBF和xylBR进行PCR扩增得到1500bp左右的DNA片段，命名为xylB同源重组片段，琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化。经过测序，xylB同源重组片段的核苷酸序列为序列6，其中，第1-60位为xylB基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为xylB基因下游同源臂。
3)利用电转化的方法将质粒pKD46转化至受体菌株E.coli MG1655中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，30℃培养24h，得到转化子，提质粒验证，获得含有pKD46的重组菌，记为E.coli MG1655(pKD46)。
4)将E.coli MG1655(pKD46)接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃培养1h，加入阿拉伯糖至终浓度5g/L，继续培养1.5h，接下来制备E.coli MG1655(pKD46)的感受态细胞，将步骤2)中获得的DNA片段转入E.coli MG1655(pKD46)的感受态细胞中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h，得到转化子。
5)利用菌落PCR的方法，以xylBF和xylBR为引物进行PCR，将PCR产物纯化之后测序，筛选正确的xylB基因已经被替换为Kan抗性基因的克隆，记为E.coli MG1655xylB-K(pKD46)。
6)将E.coli MG1655xylB-K(pKD46)接种于LB液体培养基中，42℃培养传代三次，除去pKD46质粒，得到E.coli MG1655xylB-K；E.coli MG1655xylB-K是xylB基因被Kan基因替换了的E.coli MG1655。
7)将E.coli MG1655xylB-K接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养24h，转接到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h，制备E.coli MG1655xylB-K感受态细胞。
8)利用电转化的方法将质粒pCP20转化到E.coli MG1655xylB-K感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB固体培养基，30℃培养48h，得到转化子。利用菌落PCR的方法验证转化子，以xylBF和xylBR为引物，得到202bp片段的为阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli MG1655基因组上的xylB基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli GALA1。
2、敲除glcD基因
与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：
glcD基因敲除所用引物如下：
glcDF：
5’-ATGAGCATCTTGTACGAAGAGCGTCTTGATGGCGCTTTACCCGATGTCGACCGCACATCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
glcDR：
5’-TCAGAAACGCTCCAGTTCAGGGAAAGGTAAATGACCGTGATGCACATGCATGGCACCAAAATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；
利用glcD基因敲除引物得到的glcD同源重组片段的核苷酸序列为序列7，其中，第1-60位为glcD基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为glcD基因下游同源臂。所用转化受体菌株为上述步骤1得到的突变体E.coli GALA1。利用菌落PCR的方法验证转化子，以glcDF和glcDR为引物，得到202bp的片段的菌为阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli GALA1基因组上的glcD基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli GALA2。
3、敲除aceB基因
与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：
aceB基因敲除引物序列如下：
aceBF：
5’-ATGACTGAACAGGCAACAACAACCGATGAACTGGCTTTCACAAGGCCGTATGGCGAGCAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
aceBR：
5’-TTACGCTAACAGGCGGTAGCCTGGCAGGGTCAGGAAATCAATTAACTCATCGGAAGTGGTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’。
利用aceB基因敲除引物得到的aceB同源重组片段的核苷酸序列为序列8，其中，第1-60位为aceB基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为aceB基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤2得到的突变体E.coli GALA2。利用菌落PCR的方法验证转化子，以aceBF和aceBR为引物，得到202bp的片段的菌为阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli GALA2基因组上的aceB基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli GALA3。
4、敲除glcB基因
与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：
glcB基因敲除引物序列如下：
glcBF：
5’-ATGAGTCAAACCATAACCCAGAGCCGTTTACGCATTGACGCCAATTTTAAACGTTTTGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
glcBR：
5’-TTAATGACTTTCTTTTTCGCGTAAACGCCAGGCGTGTAATAACGGTTCGGTATAGCCGTTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；
利用glcB基因敲除引物得到的glcB同源重组片段的核苷酸序列为序列9，其中，第1-60位为glcB基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为glcB基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤3得到的突变体E.coli GALA3。利用菌落PCR的方法验证转化子，以glcBF和glcBR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli GALA3基因组上的glcB基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli GALA4。
5、敲除gcl基因
与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：
gcl基因敲除引物序列如下：
gclF：
5’-ATGGCAAAAATGAGAGCCGTTGACGCGGCAATGTATGTGCTGGAGAAAGAAGGTATCACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
gclR：
5’-TTATTCATAGTGCATGAAGCAGGTTTCAGTCGGTGCGTCCGCTGCGTTATCGGCGATATCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；
利用gcl基因敲除引物得到的gcl同源重组片段的核苷酸序列为序列10，其中，第1-60位为gcl基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为gcl基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤4得到的突变体E.coli GALA4。利用菌落PCR的方法验证转化子，以gclF和gclR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli GALA4基因组上的gcl基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli GALA5。
6、敲除aceEF基因
与上述步骤1的方法基本相同，不同的是如下：
aceEF基因敲除引物序列如下：
aceEFF：
5’-ATGTCAGAACGTTTCCCAAATGACGTGGATCCGATCGAAACTCGCGACTGGCTCCAGGCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；
aceEFR：
5’-TTACATCACCAGACGGCGAATGTCAGACAGCGTGTTGTTAATGATGGTAATGAAACGGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；
利用aceEF基因敲除引物得到的aceEF同源重组片段的核苷酸序列为序列11，其中，第1-60位为aceEF基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为aceEF基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤5得到的突变体E.coli GALA5。利用菌落PCR的方法验证转化子，以aceEFF和aceEFR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli GALA5基因组上的aceEF基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，将得到的菌株命名为突变体E.coli GALA6。
三、重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA5)的构建
1、将上述步骤一得到的重组质粒pMCS-GALA5通过电转化的方法转化到上述步骤二得到的大肠杆菌E.coli GALA6，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证菌株，将含有pMCS-GALA5的重组菌记为E.coli GALA6(pMCS-GALA5)。
E.coli GALA6(pMCS-GALA5)为敲除E.coli MG1655染色体基因xylB、glcD、aceB、glcB、gcl、aceEF，并且含有基因dte、fucK、fucA、aldA、ackA、pta的外源表达盒的重组菌。
四、对照重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA4)的构建
1、将上述步骤一得到的重组质粒pMCS-GALA4通过电转化的方法转化到上述步骤二得到的大肠杆菌E.coli GALA6，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒，验证菌株，得到含有pMCS-GALA4的重组菌记为E.coliGALA6(pMCS-GALA4)。
E.coli GALA6(pMCS-GALA4)为敲除E.coli MG1655染色体基因xylB、glcD、aceB、glcB、gcl、aceEF，并且含有基因dte、fucK、fucA、aldA的外源表达盒的重组菌。
实施例2、重组菌在生产乳酸和乙醇酸中的应用
一、重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA5)和E.coli GALA6(pMCS-GALA4)的摇瓶培养条件
1、将实施例1中制备的E.coli GALA6(pMCS-GALA5)和E.coli GALA6(pMCS-GALA4)分别在含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。
2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到MM液体培养基中进行发酵，选用250ml摇瓶，装液量为50ml，转速为75rpm或150rpm，37℃培养48h，分别在培养24h和48h收集发酵液。
3、通过高效液相色谱对重组菌的乙醇酸和乳酸生产以及木糖、葡萄糖和乙酸消耗进行定量检测。具体条件如下：
仪器：岛津公司Essentia LC系列HPLC仪，配有DGU-20A脱气机，LC-16送液泵，SIL-16型自动进样器，RID-20A检测器。
色谱条件：Bio-Rad
Figure BDA0001834457090000111
HPX-87H(7.8×300mm)；流速0.60mL/min；柱温55℃；流动相为5mM硫酸水溶液。
检测方法：取乙醇酸浓度分别为0、1、2、3、4、5g/L的乙醇酸标准品水溶液(乙醇酸，Sigma-Aldrich，产品编号420581)，取乳酸浓度分别为0、1、2、3、4、5g/L的乳酸的标准品水溶液(乳酸，Sigma-Aldrich，产品编号69785)，取葡萄糖浓度分别为0、1、2、3、4、5g/L的葡萄糖标准品水溶液(葡萄糖，Sigma-Aldrich，产品编号G8270)，取木糖浓度分别为0、1、2、3、4、5g/L的木糖标准品水溶液(木糖，Sigma-Aldrich，产品编号X1500)，取乙酸浓度分别为0、1、2、3、4、5g/L的乙酸标准品水溶液(Sigma-Aldrich，产品编号A6283)，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测，用不同浓度的乙醇酸、乳酸、葡萄糖、木糖、乙酸标准溶液的色谱峰面积为纵坐标，不同物质的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
取2mL的发酵液，先用紫外分光光度计测定菌液在600nm的OD值，再于12000rpm离心10min，将其发酵上清液转移到新的离心管内，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测。将待测样品发酵上清液的乙醇酸、乳酸的色谱峰面积代入相应标准曲线中，计算得到待测样品发酵上清液的乙醇酸、乳酸含量。将待测样品发酵上清液的葡萄糖、木糖、乙酸色谱峰面积代入相应标准曲线中，计算得到待测样品发酵上清液残留的葡萄糖、木糖、乙酸含量，将接种后初始的葡萄糖、木糖、乙酸含量分别减去发酵上清液残留的葡萄糖、木糖、乙酸含量，得到重组菌的葡萄糖、木糖、乙酸消耗量。
二、重组菌在不同条件下生产乙醇酸和乳酸
1、将重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA5)按照上述一中的条件进行摇瓶发酵，所用250ml摇瓶装液量为50ml,分别在发酵24h、48h收集发酵液检测产物生产和底物消耗情况，如表1所示。
表1 E.coli GALA6(pMCS-GALA5)的产物生产和底物消耗情况
Figure BDA0001834457090000121
由结果可以看出，本发明构建的重组菌株E.coli GALA6(pMCS-GALA5)能够在添加木糖、葡萄糖和乙酸为碳源的培养基中，发酵获得乙醇酸和乳酸，75rpm条件下发酵48h乙醇酸和乳酸的产量分别为0.98g/L和2.74g/L，150rpm条件下发酵48h乙醇酸和乳酸的产量分别为1.96g/L和3.21g/L。
2、将重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA4)按照上述步骤一中的条件进行摇瓶发酵，所用250ml摇瓶装液量为50ml,分别在发酵24h、48h收集发酵液检测产物生产和底物消耗情况，如表2所示。
表2 E.coli GALA6(pMCS-GALA4)的产物生产和底物消耗情况
Figure BDA0001834457090000122
由结果可以看出，本发明构建的重组菌株E.coli GALA6(pMCS-GALA4)能够在添加木糖、葡萄糖和乙酸为碳源的培养基中，发酵获得乙醇酸和乳酸，75rpm条件下发酵48h乙醇酸和乳酸的产量分别为0.88g/L和1.11g/L，150rpm条件下发酵48h乙醇酸和乳酸的产量分别为1.22g/L和1.34g/L。
综合表1和表2的结果，重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA5)与重组菌E.coli GALA6(pMCS-GALA4)相比，细菌的OD值、乙醇酸和乳酸的产量、以及乙酸的利用量均显著增加。
<110> 北京化工大学
<120> 一种同时生产乙醇酸和乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 950
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagagctctt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60
aaatatacca tgaacaaagt tggcatgttc tacacctact ggtcgactga gtggatggtc 120
gactttccgg cgacggcgaa gcgcatcgcc ggactcggct ttgacatgat ggaaatttcg 180
ctcggcgagt ttcacaatct tccggacgcg aagaagcgtg agctgaagtc ggtcgccgac 240
gatctgggcc tcacggtgat gtgctgtatc ggactgaagt ccgaatacga ctttgcttcg 300
ccggacaaga gcgttagaga tgccggcacg gaatacgtga agcgcctgct cgacgattgc 360
catctgctcg gcgcaccggt ttttgccggc ctcacattct gcgcgtggcc gcaatcccca 420
ccgctcgaca tgaaggacaa gcgcccctac gtcgaccgcg caatcgacag cgttcgccgt 480
gtcatcaagg tcgctgaaga ctacggcatc atttatgcac tggaggtggt gaatcgcttc 540
gagcagtggc tgtgcaatga cgcgaaggaa gcgcttgcct tcgccgacgc ggtcgacagt 600
ccggcgtgca aggttcagct cgacacgttc cacatgaata tcgaagagag ttccttccgc 660
gatgcaatcc tcgcctgcaa gggcaagatg ggccattttc atctgggcga agcgaatcgc 720
ctgccgccgg gtgagggtcg cctgccgtgg gatgagatct tcggggcgct gaaggaaatc 780
gaatacgacg gcactatcgt catggaaccg ttcatgcgca agggcggttc ggtcagccgc 840
gcggtgggcg tgtggcggga catgtcgaac ggtgcgacgg acgaacagat ggacgagcgc 900
gctcgtcgct cgctgcagtt tgttcgtgag aaactggcgt gatctagaaa 950
<210> 2
<211> 1526
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aatctagatt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60
aaatatacca tgttatccgg ctatattgca ggagcgatta tgaaacaaga agttatcctg 120
gtactcgact gtggcgcgac caatgtcagg gccatcgcgg ttaatcggca gggcaaaatt 180
gttgcccgcg cctcaacgcc taatgccagc gatatcgcga tggaaaacaa cacctggcac 240
cagtggtctt tagacgccat tttgcaacgc tttgctgatt gctgtcggca aatcaatagt 300
gaactgactg aatgccacat ccgcggtatc gccgtcacca cctttggtgt ggatggcgct 360
ctggtagata agcaaggcaa tctgctctat ccgattatta gctggaaatg tccgcgaaca 420
gcagcggtta tggacaatat tgaacggtta atctccgcac agcggttgca ggctatttct 480
ggcgtcggag cctttagttt caatacgtta tataagttgg tgtggttgaa agaaaatcat 540
ccacaactgc tggaacgcgc gcacgcctgg ctctttattt cgtcgctgat taaccaccgt 600
ttaaccggcg aattcactac tgatatcacg atggccggaa ccagccagat gctggatatc 660
cagcaacgcg atttcagtcc gcaaatttta caagccaccg gtattccacg ccgactcttc 720
cctcgtctgg tggaagcggg tgaacagatt ggtacgctac agaacagcgc cgcagcaatg 780
ctcggcttac ccgttggcat accggtgatt tccgcaggtc acgataccca gttcgccctt 840
tttggcgctg gtgctgaaca aaatgaaccc gtgctctctt ccggtacatg ggaaatttta 900
atggttcgca gcgcccaggt tgatacttcg ctgttaagtc agtacgccgg ttccacctgc 960
gaactggata gccaggcagg gttgtataac ccaggtatgc aatggctggc atccggcgtg 1020
ctggaatggg tgagaaaact gttctggacg gctgaaacac cctggcaaat gttgattgaa 1080
gaagctcgtc tgatcgcgcc tggcgcggat ggcgtaaaaa tgcagtgtga tttattgtcg 1140
tgtcagaacg ctggctggca aggagtgacg cttaatacca cgcgggggca tttctatcgc 1200
gcggcgctgg aagggttaac tgcgcaatta cagcgcaatc tacagatgct ggaaaaaatc 1260
gggcacttta aggcctctga attattgtta gtcggtggag gaagtcgcaa cacattgtgg 1320
aatcagatta aagccaatat gcttgatatt ccggtaaaag ttctcgacga cgccgaaacg 1380
accgtcgcag gagctgcgct gttcggttgg tatggcgtag gggaatttaa cagcccggaa 1440
gaagcccgcg cacagattca ttatcagtac cgttatttct acccgcaaac tgaacctgaa 1500
tttatagagg aagtgtgaaa gcttaa 1526
<210> 3
<211> 725
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaaagctttt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60
aaatatacca tggaacgaaa taaacttgct cgtcagatta ttgacacttg cctggaaatg 120
acccgcctgg gactgaacca ggggacagcg gggaacgtca gtgtacgtta tcaggatggg 180
atgctgatta cgcctacagg cattccatat gaaaaactga cggagtcgca tattgtcttt 240
attgatggca acggtaaaca tgaggaagga aagctcccct caagcgaatg gcgtttccat 300
atggcagcct atcaaagcag accggatgcc aacgcggttg ttcacaatca tgccgttcat 360
tgcacggcag tttccattct taaccgatcg atccccgcta ttcactacat gattgcggcg 420
gctggcggta attctattcc ttgcgcgcct tatgcgacct ttggaacacg cgaactttct 480
gaacatgttg cgctggctct caaaaatcgt aaggcaactt tgttacaaca tcatgggctt 540
atcgcttgtg aggtgaatct ggaaaaagcg ttatggctgg cgcatgaagt tgaagtgctg 600
gcgcaacttt acctgacgac cctggcgatt acggacccgg tgccagtgct gagcgatgaa 660
gagattgccg tagtgctgga gaaattcaaa acctatgggt tacgaattga agagtaactc 720
gagaa 725
<210> 4
<211> 1517
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aactcgagtt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60
aaatatacca tgtcagtacc cgttcaacat cctatgtata tcgatggaca gtttgttacc 120
tggcgtggag acgcatggat tgatgtggta aaccctgcta cagaggctgt catttcccgc 180
atacccgatg gtcaggccga ggatgcccgt aaggcaatcg atgcagcaga acgtgcacaa 240
ccagaatggg aagcgttgcc tgctattgaa cgcgccagtt ggttgcgcaa aatctccgcc 300
gggatccgcg aacgcgccag tgaaatcagt gcgctgattg ttgaagaagg gggcaagatc 360
cagcagctgg ctgaagtcga agtggctttt actgccgact atatcgatta catggcggag 420
tgggcacggc gttacgaggg cgagattatt caaagcgatc gtccaggaga aaatattctt 480
ttgtttaaac gtgcgcttgg tgtgactacc ggcattctgc cgtggaactt cccgttcttc 540
ctcattgccc gcaaaatggc tcccgctctt ttgaccggta ataccatcgt cattaaacct 600
agtgaattta cgccaaacaa tgcgattgca ttcgccaaaa tcgtcgatga aataggcctt 660
ccgcgcggcg tgtttaacct tgtactgggg cgtggtgaaa ccgttgggca agaactggcg 720
ggtaacccaa aggtcgcaat ggtcagtatg acaggcagcg tctctgcagg tgagaagatc 780
atggcgactg cggcgaaaaa catcaccaaa gtgtgtctgg aattgggggg taaagcacca 840
gctatcgtaa tggacgatgc cgatcttgaa ctggcagtca aagccatcgt tgattcacgc 900
gtcattaata gtgggcaagt gtgtaactgt gcagaacgtg tttatgtaca gaaaggcatt 960
tatgatcagt tcgtcaatcg gctgggtgaa gcgatgcagg cggttcaatt tggtaacccc 1020
gctgaacgca acgacattgc gatggggccg ttgattaacg ccgcggcgct ggaaagggtc 1080
gagcaaaaag tggcgcgcgc agtagaagaa ggggcgagag tggcgttcgg tggcaaagcg 1140
gtagagggga aaggatatta ttatccgccg acattgctgc tggatgttcg ccaggaaatg 1200
tcgattatgc atgaggaaac ctttggcccg gtgctgccag ttgtcgcatt tgacacgctg 1260
gaagatgcta tctcaatggc taatgacagt gattacggcc tgacctcatc aatctatacc 1320
caaaatctga acgtcgcgat gaaagccatt aaagggctga agtttggtga aacttacatc 1380
aaccgtgaaa acttcgaagc tatgcaaggc ttccacgccg gatggcgtaa atccggtatt 1440
ggcggcgcag atggtaaaca tggcttgcat gaatatctgc agacccaggt ggtttattta 1500
cagtcttaag ggcccaa 1517
<210> 5
<211> 3499
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aagggccctt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60
aaatatacca tgtcgagtaa gttagtactg gttctgaact gcggtagttc ttcactgaaa 120
tttgccatca tcgatgcagt aaatggtgaa gagtaccttt ctggtttagc cgaatgtttc 180
cacctgcccg aagcacgtat caaatggaaa atggacggca ataaacagga agcggcttta 240
ggtgcaggcg ccgctcacag cgaagcgctc aactttatcg ttaatactat tctggcacaa 300
aaaccagaac tgtctgcgca gctgactgct atcggtcacc gtatcgtaca cggcggcgaa 360
aagtatacca gctccgtagt gatcgatgag tctgttattc agggtatcaa agatgcagct 420
tcttttgcac cgctgcacaa cccggctcac ctgatcggta tcgaagaagc tctgaaatct 480
ttcccacagc tgaaagacaa aaacgttgct gtatttgaca ccgcgttcca ccagactatg 540
ccggaagagt cttacctcta cgccctgcct tacaacctgt acaaagagca cggcatccgt 600
cgttacggcg cgcacggcac cagccacttc tatgtaaccc aggaagcggc aaaaatgctg 660
aacaaaccgg tagaagaact gaacatcatc acctgccacc tgggcaacgg tggttccgtt 720
tctgctatcc gcaacggtaa atgcgttgac acctctatgg gcctgacccc gctggaaggt 780
ctggtcatgg gtacacgttc tggtgatatc gatccggcga tcatcttcca cctgcacgac 840
accctgggca tgagcgttga cgcaatcaac aaactgctga ccaaagagtc tggcctgctg 900
ggtctgaccg aagtgaccag cgactgccgc tatgttgaag acaactacgc gacgaaagaa 960
gacgcgaagc gcgcaatgga cgtttactgc caccgcctgg cgaaatacat cggtgcctac 1020
actgcgctga tggatggtcg tctggacgct gttgtattca ctggtggtat cggtgaaaat 1080
gccgcaatgg ttcgtgaact gtctctgggc aaactgggcg tgctgggctt tgaagttgat 1140
catgaacgca acctggctgc acgtttcggc aaatctggtt tcatcaacaa agaaggaacc 1200
cgtcctgcgg tggttatccc aaccaacgaa gaactggtta tcgcgcaaga cgcgagccgc 1260
ctgactgcct gatttcacac cgccagctca gctggcggtg ctgttttgta acccgccaaa 1320
tcggcggtaa cgaaagagga taaaccgtgt cccgtattat tatgctgatc cctaccggaa 1380
ccagcgtcgg tctgaccagc gtcagccttg gcgtgatccg tgcaatggaa cgcaaaggcg 1440
ttcgtctgag cgttttcaaa cctatcgctc agccgcgtac cggtggcgat gcgcccgatc 1500
agactacgac tatcgtgcgt gcgaactctt ccaccacgac ggccgctgaa ccgctgaaaa 1560
tgagctacgt tgaaggtctg ctttccagca atcagaaaga tgtgctgatg gaagagatcg 1620
tcgcaaacta ccacgctaac accaaagacg ctgaagtcgt tctggttgaa ggtctggtcc 1680
cgacacgtaa gcaccagttt gcccagtctc tgaactacga aatcgctaaa acgctgaatg 1740
cggaaatcgt cttcgttatg tctcagggca ctgacacccc ggaacagctg aaagagcgta 1800
tcgaactgac ccgcaacagc ttcggcggtg ccaaaaacac caacatcacc ggcgttatcg 1860
ttaacaaact gaacgcaccg gttgatgaac agggtcgtac tcgcccggat ctgtccgaga 1920
ttttcgacga ctcttccaaa gctaaagtaa acaatgttga tccggcgaag ctgcaagaat 1980
ccagcccgct gccggttctc ggcgctgtgc cgtggagctt tgacctgatc gcgactcgtg 2040
cgatcgatat ggctcgccac ctgaatgcga ccatcatcaa cgaaggcgac atcaatactc 2100
gccgcgttaa atccgtcact ttctgcgcac gcagcattcc gcacatgctg gagcacttcc 2160
gtgccggttc tctgctggtg acttccgcag accgtcctga cgtgctggtg gccgcttgcc 2220
tggcagccat gaacggcgta gaaatcggtg ccctgctgct gactggcggt tacgaaatgg 2280
acgcgcgcat ttctaaactg tgcgaacgtg ctttcgctac cggcctgccg gtatttatgg 2340
tgaacaccaa cacctggcag acctctctga gcctgcagag cttcaacctg gaagttccgg 2400
ttgacgatca cgaacgtatc gagaaagttc aggaatacgt tgctaactac atcaacgctg 2460
actggatcga atctctgact gccacttctg agcgcagccg tcgtctgtct ccgcctgcgt 2520
tccgttatca gctgactgaa cttgcgcgca aagcgggcaa acgtatcgta ctgccggaag 2580
gtgacgaacc gcgtaccgtt aaagcagccg ctatctgtgc tgaacgtggt atcgcaactt 2640
gcgtactgct gggtaatccg gcagagatca accgtgttgc agcgtctcag ggtgtagaac 2700
tgggtgcagg gattgaaatc gttgatccag aagtggttcg cgaaagctat gttggtcgtc 2760
tggtcgaact gcgtaagaac aaaggcatga ccgaaaccgt tgcccgcgaa cagctggaag 2820
acaacgtggt gctcggtacg ctgatgctgg aacaggatga agttgatggt ctggtttccg 2880
gtgctgttca cactaccgca aacaccatcc gtccgccgct gcagctgatc aaaactgcac 2940
cgggcagctc cctggtatct tccgtgttct tcatgctgct gccggaacag gtttacgttt 3000
acggtgactg tgcgatcaac ccggatccga ccgctgaaca gctggcagaa atcgcgattc 3060
agtccgctga ttccgctgcg gccttcggta tcgaaccgcg cgttgctatg ctctcctact 3120
ccaccggtac ttctggtgca ggtagcgacg tagaaaaagt tcgcgaagca actcgtctgg 3180
cgcaggaaaa acgtcctgac ctgatgatcg acggtccgct gcagtacgac gctgcggtaa 3240
tggctgacgt tgcgaaatcc aaagcgccga actctccggt tgcaggtcgc gctaccgtgt 3300
tcatcttccc ggatctgaac accggtaaca ccacctacaa agcggtacag cgttctgccg 3360
acctgatctc catcgggccg atgctgcagg gtatgcgcaa gccggttaac gacctgtccc 3420
gtggcgcact ggttgacgat atcgtctaca ccatcgcgct gactgcgatt cagtctgcac 3480
agcagcagta aggtacctt 3499
<210> 6
<211> 1424
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgtatatcg ggatagatct tggcacctcg ggcgtaaaag ttattttgct caacgagcag 60
gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120
ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 180
tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 240
agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 300
agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 360
caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 420
gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 480
agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 540
gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 600
ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 660
agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 720
gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg 780
tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 840
gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 900
ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct 960
tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt 1020
actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt 1080
gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 1140
tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg 1200
ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg 1260
cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct 1320
agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg gaatcagcca cgacgagaaa 1380
cgttccgtcg cctctatcag caacttctgc cattaatggc gtaa 1424
<210> 7
<211> 1424
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgagcatct tgtacgaaga gcgtcttgat ggcgctttac ccgatgtcga ccgcacatcg 60
gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120
ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 180
tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 240
agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 300
agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 360
caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 420
gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 480
agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 540
gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 600
ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 660
agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 720
gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg 780
tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 840
gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 900
ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct 960
tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt 1020
actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt 1080
gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 1140
tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg 1200
ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg 1260
cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct 1320
agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg gaattttggt gccatgcatg 1380
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<210> 8
<211> 1424
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgactgaac aggcaacaac aaccgatgaa ctggctttca caaggccgta tggcgagcag 60
gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120
ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 180
tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 240
agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 300
agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 360
caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 420
gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 480
agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 540
gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 600
ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 660
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tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 840
gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 900
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taattgattt cctgaccctg ccaggctacc gcctgttagc gtaa 1424
<210> 9
<211> 1424
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgagtcaaa ccataaccca gagccgttta cgcattgacg ccaattttaa acgttttgtg 60
gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120
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gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 900
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gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 1140
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<211> 1424
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Met Asn Lys Val Gly Met Phe Tyr Thr Tyr Trp Ser Thr Glu Trp Met
1 5 10 15
Val Asp Phe Pro Ala Thr Ala Lys Arg Ile Ala Gly Leu Gly Phe Asp
20 25 30
Met Met Glu Ile Ser Leu Gly Glu Phe His Asn Leu Pro Asp Ala Lys
35 40 45
Lys Arg Glu Leu Lys Ser Val Ala Asp Asp Leu Gly Leu Thr Val Met
50 55 60
Cys Cys Ile Gly Leu Lys Ser Glu Tyr Asp Phe Ala Ser Pro Asp Lys
65 70 75 80
Ser Val Arg Asp Ala Gly Thr Glu Tyr Val Lys Arg Leu Leu Asp Asp
85 90 95
Cys His Leu Leu Gly Ala Pro Val Phe Ala Gly Leu Thr Phe Cys Ala
100 105 110
Trp Pro Gln Ser Pro Pro Leu Asp Met Lys Asp Lys Arg Pro Tyr Val
115 120 125
Asp Arg Ala Ile Asp Ser Val Arg Arg Val Ile Lys Val Ala Glu Asp
130 135 140
Tyr Gly Ile Ile Tyr Ala Leu Glu Val Val Asn Arg Phe Glu Gln Trp
145 150 155 160
Leu Cys Asn Asp Ala Lys Glu Ala Leu Ala Phe Ala Asp Ala Val Asp
165 170 175
Ser Pro Ala Cys Lys Val Gln Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Ser Ser Phe Arg Asp Ala Ile Leu Ala Cys Lys Gly Lys Met Gly
195 200 205
His Phe His Leu Gly Glu Ala Asn Arg Leu Pro Pro Gly Glu Gly Arg
210 215 220
Leu Pro Trp Asp Glu Ile Phe Gly Ala Leu Lys Glu Ile Glu Tyr Asp
225 230 235 240
Gly Thr Ile Val Met Glu Pro Phe Met Arg Lys Gly Gly Ser Val Ser
245 250 255
Arg Ala Val Gly Val Trp Arg Asp Met Ser Asn Gly Ala Thr Asp Glu
260 265 270
Gln Met Asp Glu Arg Ala Arg Arg Ser Leu Gln Phe Val Arg Glu Lys
275 280 285
Leu Ala
290
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<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Met Leu Ser Gly Tyr Ile Ala Gly Ala Ile Met Lys Gln Glu Val Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Asp Cys Gly Ala Thr Asn Val Arg Ala Ile Ala Val Asn
20 25 30
Arg Gln Gly Lys Ile Val Ala Arg Ala Ser Thr Pro Asn Ala Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Met Glu Asn Asn Thr Trp His Gln Trp Ser Leu Asp Ala Ile
50 55 60
Leu Gln Arg Phe Ala Asp Cys Cys Arg Gln Ile Asn Ser Glu Leu Thr
65 70 75 80
Glu Cys His Ile Arg Gly Ile Ala Val Thr Thr Phe Gly Val Asp Gly
85 90 95
Ala Leu Val Asp Lys Gln Gly Asn Leu Leu Tyr Pro Ile Ile Ser Trp
100 105 110
Lys Cys Pro Arg Thr Ala Ala Val Met Asp Asn Ile Glu Arg Leu Ile
115 120 125
Ser Ala Gln Arg Leu Gln Ala Ile Ser Gly Val Gly Ala Phe Ser Phe
130 135 140
Asn Thr Leu Tyr Lys Leu Val Trp Leu Lys Glu Asn His Pro Gln Leu
145 150 155 160
Leu Glu Arg Ala His Ala Trp Leu Phe Ile Ser Ser Leu Ile Asn His
165 170 175
Arg Leu Thr Gly Glu Phe Thr Thr Asp Ile Thr Met Ala Gly Thr Ser
180 185 190
Gln Met Leu Asp Ile Gln Gln Arg Asp Phe Ser Pro Gln Ile Leu Gln
195 200 205
Ala Thr Gly Ile Pro Arg Arg Leu Phe Pro Arg Leu Val Glu Ala Gly
210 215 220
Glu Gln Ile Gly Thr Leu Gln Asn Ser Ala Ala Ala Met Leu Gly Leu
225 230 235 240
Pro Val Gly Ile Pro Val Ile Ser Ala Gly His Asp Thr Gln Phe Ala
245 250 255
Leu Phe Gly Ala Gly Ala Glu Gln Asn Glu Pro Val Leu Ser Ser Gly
260 265 270
Thr Trp Glu Ile Leu Met Val Arg Ser Ala Gln Val Asp Thr Ser Leu
275 280 285
Leu Ser Gln Tyr Ala Gly Ser Thr Cys Glu Leu Asp Ser Gln Ala Gly
290 295 300
Leu Tyr Asn Pro Gly Met Gln Trp Leu Ala Ser Gly Val Leu Glu Trp
305 310 315 320
Val Arg Lys Leu Phe Trp Thr Ala Glu Thr Pro Trp Gln Met Leu Ile
325 330 335
Glu Glu Ala Arg Leu Ile Ala Pro Gly Ala Asp Gly Val Lys Met Gln
340 345 350
Cys Asp Leu Leu Ser Cys Gln Asn Ala Gly Trp Gln Gly Val Thr Leu
355 360 365
Asn Thr Thr Arg Gly His Phe Tyr Arg Ala Ala Leu Glu Gly Leu Thr
370 375 380
Ala Gln Leu Gln Arg Asn Leu Gln Met Leu Glu Lys Ile Gly His Phe
385 390 395 400
Lys Ala Ser Glu Leu Leu Leu Val Gly Gly Gly Ser Arg Asn Thr Leu
405 410 415
Trp Asn Gln Ile Lys Ala Asn Met Leu Asp Ile Pro Val Lys Val Leu
420 425 430
Asp Asp Ala Glu Thr Thr Val Ala Gly Ala Ala Leu Phe Gly Trp Tyr
435 440 445
Gly Val Gly Glu Phe Asn Ser Pro Glu Glu Ala Arg Ala Gln Ile His
450 455 460
Tyr Gln Tyr Arg Tyr Phe Tyr Pro Gln Thr Glu Pro Glu Phe Ile Glu
465 470 475 480
Glu Val
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Met Glu Arg Asn Lys Leu Ala Arg Gln Ile Ile Asp Thr Cys Leu Glu
1 5 10 15
Met Thr Arg Leu Gly Leu Asn Gln Gly Thr Ala Gly Asn Val Ser Val
20 25 30
Arg Tyr Gln Asp Gly Met Leu Ile Thr Pro Thr Gly Ile Pro Tyr Glu
35 40 45
Lys Leu Thr Glu Ser His Ile Val Phe Ile Asp Gly Asn Gly Lys His
50 55 60
Glu Glu Gly Lys Leu Pro Ser Ser Glu Trp Arg Phe His Met Ala Ala
65 70 75 80
Tyr Gln Ser Arg Pro Asp Ala Asn Ala Val Val His Asn His Ala Val
85 90 95
His Cys Thr Ala Val Ser Ile Leu Asn Arg Ser Ile Pro Ala Ile His
100 105 110
Tyr Met Ile Ala Ala Ala Gly Gly Asn Ser Ile Pro Cys Ala Pro Tyr
115 120 125
Ala Thr Phe Gly Thr Arg Glu Leu Ser Glu His Val Ala Leu Ala Leu
130 135 140
Lys Asn Arg Lys Ala Thr Leu Leu Gln His His Gly Leu Ile Ala Cys
145 150 155 160
Glu Val Asn Leu Glu Lys Ala Leu Trp Leu Ala His Glu Val Glu Val
165 170 175
Leu Ala Gln Leu Tyr Leu Thr Thr Leu Ala Ile Thr Asp Pro Val Pro
180 185 190
Val Leu Ser Asp Glu Glu Ile Ala Val Val Leu Glu Lys Phe Lys Thr
195 200 205
Tyr Gly Leu Arg Ile Glu Glu
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<210> 15
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Met Ser Val Pro Val Gln His Pro Met Tyr Ile Asp Gly Gln Phe Val
1 5 10 15
Thr Trp Arg Gly Asp Ala Trp Ile Asp Val Val Asn Pro Ala Thr Glu
20 25 30
Ala Val Ile Ser Arg Ile Pro Asp Gly Gln Ala Glu Asp Ala Arg Lys
35 40 45
Ala Ile Asp Ala Ala Glu Arg Ala Gln Pro Glu Trp Glu Ala Leu Pro
50 55 60
Ala Ile Glu Arg Ala Ser Trp Leu Arg Lys Ile Ser Ala Gly Ile Arg
65 70 75 80
Glu Arg Ala Ser Glu Ile Ser Ala Leu Ile Val Glu Glu Gly Gly Lys
85 90 95
Ile Gln Gln Leu Ala Glu Val Glu Val Ala Phe Thr Ala Asp Tyr Ile
100 105 110
Asp Tyr Met Ala Glu Trp Ala Arg Arg Tyr Glu Gly Glu Ile Ile Gln
115 120 125
Ser Asp Arg Pro Gly Glu Asn Ile Leu Leu Phe Lys Arg Ala Leu Gly
130 135 140
Val Thr Thr Gly Ile Leu Pro Trp Asn Phe Pro Phe Phe Leu Ile Ala
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Arg Lys Met Ala Pro Ala Leu Leu Thr Gly Asn Thr Ile Val Ile Lys
165 170 175
Pro Ser Glu Phe Thr Pro Asn Asn Ala Ile Ala Phe Ala Lys Ile Val
180 185 190
Asp Glu Ile Gly Leu Pro Arg Gly Val Phe Asn Leu Val Leu Gly Arg
195 200 205
Gly Glu Thr Val Gly Gln Glu Leu Ala Gly Asn Pro Lys Val Ala Met
210 215 220
Val Ser Met Thr Gly Ser Val Ser Ala Gly Glu Lys Ile Met Ala Thr
225 230 235 240
Ala Ala Lys Asn Ile Thr Lys Val Cys Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ala
245 250 255
Pro Ala Ile Val Met Asp Asp Ala Asp Leu Glu Leu Ala Val Lys Ala
260 265 270
Ile Val Asp Ser Arg Val Ile Asn Ser Gly Gln Val Cys Asn Cys Ala
275 280 285
Glu Arg Val Tyr Val Gln Lys Gly Ile Tyr Asp Gln Phe Val Asn Arg
290 295 300
Leu Gly Glu Ala Met Gln Ala Val Gln Phe Gly Asn Pro Ala Glu Arg
305 310 315 320
Asn Asp Ile Ala Met Gly Pro Leu Ile Asn Ala Ala Ala Leu Glu Arg
325 330 335
Val Glu Gln Lys Val Ala Arg Ala Val Glu Glu Gly Ala Arg Val Ala
340 345 350
Phe Gly Gly Lys Ala Val Glu Gly Lys Gly Tyr Tyr Tyr Pro Pro Thr
355 360 365
Leu Leu Leu Asp Val Arg Gln Glu Met Ser Ile Met His Glu Glu Thr
370 375 380
Phe Gly Pro Val Leu Pro Val Val Ala Phe Asp Thr Leu Glu Asp Ala
385 390 395 400
Ile Ser Met Ala Asn Asp Ser Asp Tyr Gly Leu Thr Ser Ser Ile Tyr
405 410 415
Thr Gln Asn Leu Asn Val Ala Met Lys Ala Ile Lys Gly Leu Lys Phe
420 425 430
Gly Glu Thr Tyr Ile Asn Arg Glu Asn Phe Glu Ala Met Gln Gly Phe
435 440 445
His Ala Gly Trp Arg Lys Ser Gly Ile Gly Gly Ala Asp Gly Lys His
450 455 460
Gly Leu His Glu Tyr Leu Gln Thr Gln Val Val Tyr Leu Gln Ser
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<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Met Ser Ser Lys Leu Val Leu Val Leu Asn Cys Gly Ser Ser Ser Leu
1 5 10 15
Lys Phe Ala Ile Ile Asp Ala Val Asn Gly Glu Glu Tyr Leu Ser Gly
20 25 30
Leu Ala Glu Cys Phe His Leu Pro Glu Ala Arg Ile Lys Trp Lys Met
35 40 45
Asp Gly Asn Lys Gln Glu Ala Ala Leu Gly Ala Gly Ala Ala His Ser
50 55 60
Glu Ala Leu Asn Phe Ile Val Asn Thr Ile Leu Ala Gln Lys Pro Glu
65 70 75 80
Leu Ser Ala Gln Leu Thr Ala Ile Gly His Arg Ile Val His Gly Gly
85 90 95
Glu Lys Tyr Thr Ser Ser Val Val Ile Asp Glu Ser Val Ile Gln Gly
100 105 110
Ile Lys Asp Ala Ala Ser Phe Ala Pro Leu His Asn Pro Ala His Leu
115 120 125
Ile Gly Ile Glu Glu Ala Leu Lys Ser Phe Pro Gln Leu Lys Asp Lys
130 135 140
Asn Val Ala Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Met Pro Glu Glu
145 150 155 160
Ser Tyr Leu Tyr Ala Leu Pro Tyr Asn Leu Tyr Lys Glu His Gly Ile
165 170 175
Arg Arg Tyr Gly Ala His Gly Thr Ser His Phe Tyr Val Thr Gln Glu
180 185 190
Ala Ala Lys Met Leu Asn Lys Pro Val Glu Glu Leu Asn Ile Ile Thr
195 200 205
Cys His Leu Gly Asn Gly Gly Ser Val Ser Ala Ile Arg Asn Gly Lys
210 215 220
Cys Val Asp Thr Ser Met Gly Leu Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met
225 230 235 240
Gly Thr Arg Ser Gly Asp Ile Asp Pro Ala Ile Ile Phe His Leu His
245 250 255
Asp Thr Leu Gly Met Ser Val Asp Ala Ile Asn Lys Leu Leu Thr Lys
260 265 270
Glu Ser Gly Leu Leu Gly Leu Thr Glu Val Thr Ser Asp Cys Arg Tyr
275 280 285
Val Glu Asp Asn Tyr Ala Thr Lys Glu Asp Ala Lys Arg Ala Met Asp
290 295 300
Val Tyr Cys His Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Thr Ala Leu
305 310 315 320
Met Asp Gly Arg Leu Asp Ala Val Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Glu
325 330 335
Asn Ala Ala Met Val Arg Glu Leu Ser Leu Gly Lys Leu Gly Val Leu
340 345 350
Gly Phe Glu Val Asp His Glu Arg Asn Leu Ala Ala Arg Phe Gly Lys
355 360 365
Ser Gly Phe Ile Asn Lys Glu Gly Thr Arg Pro Ala Val Val Ile Pro
370 375 380
Thr Asn Glu Glu Leu Val Ile Ala Gln Asp Ala Ser Arg Leu Thr Ala
385 390 395 400
<210> 17
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Val Ser Arg Ile Ile Met Leu Ile Pro Thr Gly Thr Ser Val Gly Leu
1 5 10 15
Thr Ser Val Ser Leu Gly Val Ile Arg Ala Met Glu Arg Lys Gly Val
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Arg Leu Ser Val Phe Lys Pro Ile Ala Gln Pro Arg Thr Gly Gly Asp
35 40 45
Ala Pro Asp Gln Thr Thr Thr Ile Val Arg Ala Asn Ser Ser Thr Thr
50 55 60
Thr Ala Ala Glu Pro Leu Lys Met Ser Tyr Val Glu Gly Leu Leu Ser
65 70 75 80
Ser Asn Gln Lys Asp Val Leu Met Glu Glu Ile Val Ala Asn Tyr His
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Ala Asn Thr Lys Asp Ala Glu Val Val Leu Val Glu Gly Leu Val Pro
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Thr Arg Lys His Gln Phe Ala Gln Ser Leu Asn Tyr Glu Ile Ala Lys
115 120 125
Thr Leu Asn Ala Glu Ile Val Phe Val Met Ser Gln Gly Thr Asp Thr
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Pro Glu Gln Leu Lys Glu Arg Ile Glu Leu Thr Arg Asn Ser Phe Gly
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Gly Ala Lys Asn Thr Asn Ile Thr Gly Val Ile Val Asn Lys Leu Asn
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Ala Pro Val Asp Glu Gln Gly Arg Thr Arg Pro Asp Leu Ser Glu Ile
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Phe Asp Asp Ser Ser Lys Ala Lys Val Asn Asn Val Asp Pro Ala Lys
195 200 205
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Phe Asp Leu Ile Ala Thr Arg Ala Ile Asp Met Ala Arg His Leu Asn
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Ala Thr Ile Ile Asn Glu Gly Asp Ile Asn Thr Arg Arg Val Lys Ser
245 250 255
Val Thr Phe Cys Ala Arg Ser Ile Pro His Met Leu Glu His Phe Arg
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Ala Gly Ser Leu Leu Val Thr Ser Ala Asp Arg Pro Asp Val Leu Val
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Ala Ala Cys Leu Ala Ala Met Asn Gly Val Glu Ile Gly Ala Leu Leu
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Arg Arg Leu Ser Pro Pro Ala Phe Arg Tyr Gln Leu Thr Glu Leu Ala
385 390 395 400
Arg Lys Ala Gly Lys Arg Ile Val Leu Pro Glu Gly Asp Glu Pro Arg
405 410 415
Thr Val Lys Ala Ala Ala Ile Cys Ala Glu Arg Gly Ile Ala Thr Cys
420 425 430
Val Leu Leu Gly Asn Pro Ala Glu Ile Asn Arg Val Ala Ala Ser Gln
435 440 445
Gly Val Glu Leu Gly Ala Gly Ile Glu Ile Val Asp Pro Glu Val Val
450 455 460
Arg Glu Ser Tyr Val Gly Arg Leu Val Glu Leu Arg Lys Asn Lys Gly
465 470 475 480
Met Thr Glu Thr Val Ala Arg Glu Gln Leu Glu Asp Asn Val Val Leu
485 490 495
Gly Thr Leu Met Leu Glu Gln Asp Glu Val Asp Gly Leu Val Ser Gly
500 505 510
Ala Val His Thr Thr Ala Asn Thr Ile Arg Pro Pro Leu Gln Leu Ile
515 520 525
Lys Thr Ala Pro Gly Ser Ser Leu Val Ser Ser Val Phe Phe Met Leu
530 535 540
Leu Pro Glu Gln Val Tyr Val Tyr Gly Asp Cys Ala Ile Asn Pro Asp
545 550 555 560
Pro Thr Ala Glu Gln Leu Ala Glu Ile Ala Ile Gln Ser Ala Asp Ser
565 570 575
Ala Ala Ala Phe Gly Ile Glu Pro Arg Val Ala Met Leu Ser Tyr Ser
580 585 590
Thr Gly Thr Ser Gly Ala Gly Ser Asp Val Glu Lys Val Arg Glu Ala
595 600 605
Thr Arg Leu Ala Gln Glu Lys Arg Pro Asp Leu Met Ile Asp Gly Pro
610 615 620
Leu Gln Tyr Asp Ala Ala Val Met Ala Asp Val Ala Lys Ser Lys Ala
625 630 635 640
Pro Asn Ser Pro Val Ala Gly Arg Ala Thr Val Phe Ile Phe Pro Asp
645 650 655
Leu Asn Thr Gly Asn Thr Thr Tyr Lys Ala Val Gln Arg Ser Ala Asp
660 665 670
Leu Ile Ser Ile Gly Pro Met Leu Gln Gly Met Arg Lys Pro Val Asn
675 680 685
Asp Leu Ser Arg Gly Ala Leu Val Asp Asp Ile Val Tyr Thr Ile Ala
690 695 700
Leu Thr Ala Ile Gln Ser Ala Gln Gln Gln
705 710

Claims (7)

1.重组菌的构建方法，包括对作为受体菌的大肠杆菌进行下述A1-A12的改造，得到所述重组菌；
A1、敲除所述大肠杆菌的xylB基因或抑制所述xylB基因的表达或抑制所述xylB基因编码的蛋白质的活性；
A2、敲除所述大肠杆菌的glcD基因或抑制所述glcD基因的表达或抑制所述glcD基因编码的蛋白质的活性；
A3、敲除所述大肠杆菌的aceB基因或抑制所述aceB基因的表达或抑制所述aceB基因编码的蛋白质的活性；
A4、敲除所述大肠杆菌的glcB基因或抑制所述glcB基因的表达或抑制所述glcB基因编码的蛋白质的活性；
A5、敲除所述大肠杆菌的gcl基因或抑制所述gcl基因的表达或抑制所述gcl基因编码的蛋白质的活性；
A6、敲除所述大肠杆菌的aceEF基因或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性；
A7、增加所述大肠杆菌中dte基因编码蛋白质的含量；
A8、增加所述大肠杆菌中fucK基因编码蛋白质的含量；
A9、增加所述大肠杆菌中fucA基因编码蛋白质的含量；
A10、增加所述大肠杆菌中aldA基因编码蛋白质的含量；
A11、增加所述大肠杆菌中ackA基因编码蛋白质的含量；
A12、增加所述大肠杆菌中pta基因编码蛋白质的含量；
所述大肠杆菌为含有所述xylB基因、所述glcD基因、所述aceB基因、所述glcB基因、所述gcl基因和所述aceEF基因的大肠杆菌MG1655；
所述dte基因编码蛋白质为序列表中序列12所示的蛋白质；
所述fucK基因编码蛋白质为序列表中序列13所示的蛋白质；
所述fucA基因编码蛋白质为序列表中序列14所示的蛋白质；
所述aldA基因编码蛋白质为序列表中序列15所示的蛋白质；
所述ackA基因编码蛋白质为序列表中序列16所示的蛋白质；
所述pta基因编码蛋白质为序列表中序列17所示的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
A1通过向所述受体菌中导入含有所述xylB基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A2通过向所述受体菌中导入含有所述glcD基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A3通过向所述受体菌中导入含有所述aceB基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A4通过向所述受体菌中导入含有所述glcB基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A5通过向所述受体菌中导入含有所述gcl基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A6通过向所述受体菌中导入含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段实现；
和/或，A7通过向所述受体菌中导入含有所述dte基因的dte基因表达盒实现；
和/或，A8通过向所述受体菌中导入含有所述fucK基因的fucK基因表达盒实现；
和/或，A9通过向所述受体菌中导入含有所述fucA基因的fucA基因表达盒实现；
和/或，A10通过向所述受体菌中导入含有所述aldA基因的aldA基因表达盒实现；
和/或，A11通过向所述受体菌中导入含有所述ackA基因的ackA基因表达盒实现；
和/或，A12通过向所述受体菌中导入含有所述pta基因的pta基因表达盒实现。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述含有所述xylB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列6所示的DNA分子；
所述含有所述glcD基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列7所示的DNA分子；
所述含有所述aceB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列8所示的DNA分子；
所述含有所述glcB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列9所示的DNA分子；
所述含有所述gcl基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列10所示的DNA分子；
所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列11所示的DNA分子；
和/或，所述dte基因表达盒、所述fucK基因表达盒、所述fucA基因表达盒、所述aldA基因表达盒、所述ackA基因表达盒和所述pta基因表达盒中启动子为序列表中序列1的第9-51位所示的DNA分子；
和/或，所述dte基因表达盒中所述dte基因为序列表中序列1的第70-942位所示的DNA分子；
和/或，所述fucK基因表达盒中所述fucK基因为序列表中序列2的第70-1518位所示的DNA分子；
和/或，所述fucA基因表达盒中所述fucA基因为序列表中序列3的第70-717位所示的DNA分子；
和/或，所述aldA基因表达盒中所述aldA基因为序列表中序列4的第70-1509位所示的DNA分子；
和/或，所述ackA基因表达盒中所述ackA基因为序列表中序列5的第70-1272位所示的DNA分子；
和/或，所述pta基因表达盒中所述pta基因为序列表中序列5的第1347-3491位所示的DNA分子。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：
所述dte基因表达盒为序列表中序列1的第9-942位所示的DNA分子；
所述fucK基因表达盒为序列中序列2的第9-1518位所示的DNA分子；
所述fucA基因表达盒为序列表中序列3的第9-717位所示的DNA分子；
所述aldA基因表达盒为序列表中序列4的第9-1509位所示的DNA分子；
所述ackA基因和所述pta基因的表达盒为序列表中序列5的第9-3491位所示的DNA分子。
5.利用权利要求1-4中任一所述方法制备的重组菌。
6.利用权利要求1-4中任一所述方法制备的重组菌的下述任一应用：
X1、生产乙醇酸和乳酸；
X2、制备生产乙醇酸和乳酸产品；
X3、降解木糖和/或葡萄糖；
X4、制备降解木糖和/或葡萄糖产品。
7.生产乙醇酸和乳酸的方法，包括：以乙酸、木糖和葡萄糖为碳源，利用权利要求1-4中任一所述的方法制备的重组菌进行生物转化，制备乙醇酸和乳酸。
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