CN109321467B - 瓦氏马尾藻的规模化培养以及提取多糖的工艺 - Google Patents

瓦氏马尾藻的规模化培养以及提取多糖的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明属于藻类培养技术领域，公开了瓦氏马尾藻的规模化培养以及提取多糖的工艺，其包括如下步骤：步骤1）组织繁育，步骤2）规模化培养，步骤3）提取粗多糖。本发明对瓦氏马尾藻进行了规模化培养，提高生物量，并且对多糖进行了提取，具备较好的工业价值。

Description

瓦氏马尾藻的规模化培养以及提取多糖的工艺
技术领域
本发明属于藻类培养以及多糖提取技术领域，具体涉及瓦氏马尾藻的规模化培养以及提取多糖的工艺。
背景技术
海藻是海洋植物的重要组成部分，大型海藻则是海藻场重要的框架生物。马尾藻属是褐藻门中最大的一个属，该属中的许多种类都具有重要的经济和生态价值，也是中国、日本沿海海藻场的重要成员。马尾藻藻体较大，生长迅速，具有高的经济价值。在工农业方面，马尾藻是重要的提取藻胶原料，同时还可以作为农作物的优质肥料。在医药方面，马尾藻可提取多种活性物质，有些还具有良好的抗肿瘤疗效。在养殖业中，马尾藻可作为多种经济动物的天然优质饲料，并且对其免疫力的提高有很好的效果。在生态上马尾藻可大量吸收水体中的营养盐及重金属等成分，能有效改善海水水质。同时马尾藻作为初级生产者对海洋食物链有着重要影响。随着科技的发展，人们对马尾藻价值认识逐渐提高，目前国内外对马尾藻资源的需求量与日俱增，导致大量天然的马尾藻资源被过度开采。自然状态下马尾藻一般以假根发出幼苗的营养繁殖方式和有性繁殖两种方式延续后代，然而有性生殖在野外环境中效率极低。在采集野生马尾藻时，沿岸渔民往往为图方便快捷把马尾藻连“根”拔起，以至于马尾藻藻场得不到假根幼苗的补充而迅速消退。再加以沿海环境的逐步恶化，污染严重，马尾藻藻场在自然状态下不可恢复。所以人工规模化栽培以及通过人工育苗的方法修复马尾藻藻场是解决人类对马尾藻资源大量需求和生态资源保护的一条有效途径。
现有技术已经有一些研究对马尾藻的生长繁殖进行了研究，例如文献“莫氏马尾藻繁殖生物学初步研究，水产科学2012年”公开了莫氏马尾藻的过程，包括受精卵的形成、假根的发育以及孢子体的生长等. 并研究了不同附着基对采苗效果的影响。试验结果表明，莫氏马尾藻的繁殖盛期为4月中旬至5月中旬，其卵子发育属八核一卵型，假根是由基部一个细胞分化发育而来；瓷砖附苗的密度超过40株/cm2，在培育15d后,幼孢子体长度约1-2mm。文献“硇洲马尾藻的繁殖特性及体长生物量的季节变动，水产学报2011年” 研究了硇洲马尾藻的生长特点，发现11月至翌年4月中旬为生长期,4月中旬至6月初是繁殖期，6月初至7月底为衰老期，自然种群的繁衍和维持以假根再生为主，有性繁殖为辅，假根周年各月均可再生小苗，拔除假根，严重破坏种群繁衍，保留假根的剪收可以使第二年相同面积、同一时间的同种藻体的现存生物量明显增加。分布在水深2m以内，宽5-10m的潮间带岩礁上，11月开始加速生长，到5月上旬藻体长度生长达到最大值，原生态藻体的生物量表现出明显的季节变化，基本上与体长生长保持同步增长，最大生物量可达1280g/m2，最大单株藻体长1.73m，最大单株质量可达250g。
马尾藻的生长受多种外界因素的影响，如何控制外界因素，是提高马尾藻生长量的研究重点。文献“莫氏马尾藻对氮和磷的吸收，海洋环境科学2015年”研究了温度、盐度和光照强度对莫氏马尾藻氮和磷吸收速率的影响，结果表明，合适的温度、盐度和光照强度能够提高莫氏马尾藻氮和磷的吸收速率，促进藻类生长。此外，一些外源植物激素对马尾藻的生长影响也较大，但是植物激素类型较多，不同的植物激素对不同的藻类的影响区别较大，并没有统一的经验可以借鉴，不能根据其他藻类进行照搬。可见，外界因素的优化是提高马尾藻生长和增殖的主要因素，也是研究的难点。目前，关于瓦氏马尾藻的生物量和繁殖生物学方面的系统性研究较少，
文献CN103202214A公开了一种瓦氏马尾藻的繁育方法，该方法不仅有效地控制和延长有性繁殖时间，受精率达到95%以上，但是该方法容易受培养条件以及放卵量等客观条件的限制，无法快速大量实现繁育。文献CN103385170A公开了一种瓦氏马尾藻组织培养育苗的方法，以龄幼苗叶子和高日龄幼苗假根进行切段组织培养，获得再生苗，该方法比较容易控制，可以获得更大量的苗种，但是培养时间较长，需要60天左右，而且工艺较为复杂、成本提高。
基于上述技术问题，申请人之前的发明专利提供了“瓦氏马尾藻的快速繁育方法”，该方法实现了瓦氏马尾藻的快速繁育，在此基础上，申请人继续对瓦氏马尾藻进行了规模化培养，并且对有效组分多糖进行了提取。
发明内容
在已有研究的基础上，本发明提供了瓦氏马尾藻的规模化培养以及提取多糖的工艺，实现规模化培养的同时，对多糖进行提取，以获得高附加值产物。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
瓦氏马尾藻的规模化培养以及提取多糖的工艺，其包括如下步骤：
瓦氏马尾藻的规模化培养以及提取多糖的工艺，其包括如下步骤：步骤1）组织繁育，步骤2）规模化培养，步骤3）提取粗多糖。
进一步地，所述工艺包括如下步骤：
步骤1）组织繁育：选择健康的瓦氏马尾藻幼苗，采集叶片，置于碘化钾水溶液中浸泡10-30min，取出，然后置于组织捣碎机中进行处理，得到含有10-50个细胞的微小组织块，将微小组织块置于培养液中，培养10d；更换新的培养液，再往培养液中添加GA3和光合细菌，继续培养，待主叶叶片长度达到5mm以上时，即完成繁育过程；
步骤2）规模化培养：将藻苗接入到培养池中，培养池中注入灭菌海水，培养50-60d，排出液体，收集瓦氏马尾藻；
步骤3）提取粗多糖：将瓦氏马尾藻干燥，粉碎，然后添加5-10倍重量的水作为提取液，超声波破壁，然后加热至80℃，保温条件下水提法提取藻多糖，浸提时间为3-4h，提取后离心，去除沉沉物，收集上清液；加入占上清液1-1.5%重量份的三氯乙酸沉淀蛋白，离心收集上清液，减压蒸发至原体积的三分之一，然后添加2-3倍体积的无水乙醇，离心，收集沉淀部分，最后进行干燥，得到粗藻多糖。
优选地，所述碘化钾水溶液是浓度为10g/L。
优选地，所述步骤1）中，培养10d的条件为：温度22-23℃，光照强度3000-4000lux，光暗比为12:12。
优选地，所述步骤1）中，控制培养液中GA3浓度为30-50mg/L，光合细菌的浓度为（1-5）×108cfu/L。
优选地，所述继续培养条件为：温度19-20℃，光照强度2000-3000lux，光暗比为10:14。
优选地，所述步骤1）中的培养液按照如下工艺制备而得：往灭菌海水中添加硝酸钠1-2g/L，氯化钠0.5-1g/L，碳酸钠0.5-0.8g/L，氯化铵0.2-0.3g/L，6-BA 10-20mg/L以及亚精胺1-5mg/L，即得培养液。
优选地，所述光合细菌为类红球菌，珊瑚红球菌、红平红球菌以及任意二者以上的混合物。
优选地，所述超声波破壁的条件为：超声波脉冲为9.9s，间隔为3.3s，超声波功率为500W，超声波时间为30-45min。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明首先对瓦氏马尾藻进行快速繁育，将叶片置于浓度为10g/L的碘化钾水溶液中浸泡10min，不采用抗生素，以免产生抗生素残留，对后期的工业化应用的造成影响；然后对叶片进行捣碎，获得微小组织块，较常规的裁切叶片的方式相比，可以获得几十倍的组织数目，提高了繁育速率，但是本发明的微小组织块含有细胞数量较少，采用常规的繁育方法成功率较低，需要进行优化改进；
本发明选择6-BA+亚精胺的组合，能够促进细胞分裂和孢子生长，促进组织再生率，可达到97%；培养10d，更换新的培养液后，添加GA3和光合细菌，培养时间为20-30d，能够促进假根的发育，提高叶片数量和叶片长度；
光合细菌以有机酸、氨基酸、氨以及硫化物等作为原料增殖，并且能够释放出多种活性因子，促进马尾藻生成假根和增殖，而马尾藻产生的代谢物也可以供光合细菌使用；
本发明的方法能够实现瓦氏马尾藻的快速繁育，繁育量大且操作方法简便，成本低廉，培养时间短，控制在40d以内，为后期的人工规模化栽培打下了基础；
本发明对瓦氏马尾藻进行了规模化培养，提高生物量，并且对多糖进行了提取，具备较好的工业价值。
说明书附图
图1：培养时间对组织再生率的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
瓦氏马尾藻的规模化培养以及提取多糖的工艺，其包括如下步骤：
选择健康的瓦氏马尾藻幼苗（30-40日龄），采集叶片，置于浓度为10g/L的碘化钾水溶液中浸泡20min，取出，然后置于组织捣碎机中，以10000rpm的转速处理3min，得到含有10-50个细胞的微小组织块，将微小组织块置于培养液中，培养条件为：温度22℃，光照强度3000lux，光暗比为12:12；培养10d，然后更换培养液，再添加GA3（赤霉素）和光合细菌，控制培养液中GA3浓度为30mg/L，光合细菌的浓度为1×108cfu/L，培养条件为：温度19℃，光照强度3000lux，光暗比为10:14，待主叶叶片长度达到5mm以上时，即完成繁育过程；所述光合细菌为红平红球菌为ATCC53968；所述培养液按照如下工艺制备而得：往灭菌海水中添加硝酸钠1g/L，氯化钠1g/L，碳酸钠0.6g/L，氯化铵0.2g/L，6-BA 15mg/L以及亚精胺3mg/L，即得培养液；
将藻苗接入到培养池中，培养池注入灭菌海水，海水深度为60cm，按照每平方米面积接入1kg藻苗的量进行接入，温度22-23℃，光照强度4000-5000lux，光暗比为12:12，培养60d，排出液体，收集瓦氏马尾藻；
将瓦氏马尾藻干燥，粉碎，然后添加5倍重量的水作为提取液，超声波破壁，超声波脉冲为9.9s，间隔为3.3s，超声波功率为500W，超声波作用时间为45min，然后加热至80℃，保温条件下水提法提取藻多糖，浸提时间为4h，提取后离心，去除沉沉物，收集上清液；加入占上清液1.5%重量份的三氯乙酸沉淀蛋白，离心收集上清液，减压蒸发至原体积的三分之一，然后添加2倍体积的无水乙醇，3000rpm离心20min，得到沉淀部分，最后进行干燥，得到粗藻多糖；采用硫酸-苯酚法分析藻多糖含量，计算粗藻多糖中纯品的含量为67.1%，多糖提取率为2.56%。
实施例2
瓦氏马尾藻的规模化培养以及提取多糖的工艺，其包括如下步骤：
选择健康的瓦氏马尾藻幼苗（30-40日龄），采集叶片，置于浓度为10g/L的碘化钾水溶液中浸泡20min，取出，然后置于组织捣碎机中，以10000rpm的转速处理5min，得到含有10-50个细胞的微小组织块，将微小组织块置于培养液中，培养条件为：温度23℃，光照强度4000lux，光暗比为12:12；培养10d，然后更换培养液，再添加GA3（赤霉素）和光合细菌，控制培养液中GA3浓度为50mg/L，光合细菌的浓度为2×108cfu/L，培养条件为：温度20℃，光照强度2000lux，光暗比为10:14，待主叶叶片长度达到5mm以上时，即完成繁育过程；所述光合细菌选用类红球菌；所述培养液按照如下工艺制备而得：往灭菌海水中添加硝酸钠2g/L，氯化钠1g/L，碳酸钠0.5g/L，氯化铵0.2g/L，6-BA 10mg/L以及亚精胺2mg/L，即得培养液；
将藻苗接入到培养池中，培养池注入灭菌海水，海水深度为80cm，按照每平方米面积接入1kg藻苗的量进行接入，温度22-23℃，光照强度4000-5000lux，光暗比为12:12，培养50d，排出液体，收集瓦氏马尾藻；
将瓦氏马尾藻干燥，粉碎，然后添加6倍重量的水作为提取液，超声波破壁，超声波脉冲为9.9s，间隔为3.3s，超声波功率为500W，超声波作用时间为40min，然后加热至80℃，保温条件下水提法提取藻多糖，浸提时间为4h，提取后离心，去除沉沉物，收集上清液；加入占上清液1.2%重量份的三氯乙酸沉淀蛋白，离心收集上清液，减压蒸发至原体积的三分之一，然后添加3倍体积的无水乙醇，3000rpm离心15min，得到沉淀部分，最后进行干燥，得到粗藻多糖；采用硫酸-苯酚法分析藻多糖含量，计算粗藻多糖中纯品的含量为65.8%，多糖提取率为2.51%。
实施例3
瓦氏马尾藻的规模化培养以及提取多糖的工艺，其包括如下步骤：
选择健康的瓦氏马尾藻幼苗（30-40日龄），采集叶片，置于浓度为10g/L的碘化钾水溶液中浸泡30min，取出，然后置于组织捣碎机中，以10000rpm的转速处理4min，得到含有10-50个细胞的微小组织块，将微小组织块置于培养液中，培养条件为：温度22℃，光照强度3000lux，光暗比为12:12；培养10d，然后更换培养液，再添加GA3（赤霉素）和光合细菌，控制培养液中GA3浓度为40mg/L，光合细菌的浓度为3×108cfu/L，培养条件为：温度20℃，光照强度2000lux，光暗比为10:14，待主叶叶片长度达到5mm以上时，即完成繁育过程；所述光合细菌选用珊瑚红球菌；所述培养液按照如下工艺制备而得：往灭菌海水中添加硝酸钠1g/L，氯化钠0.5g/L，碳酸钠0.5g/L，氯化铵0.3g/L，6-BA 20mg/L以及亚精胺5mg/L，即得培养液；
将藻苗接入到培养池中，培养池注入灭菌海水，海水深度为50cm，按照每平方米面积接入1kg藻苗的量进行接入，温度22-23℃，光照强度4000-5000lux，光暗比为12:12，培养60d，排出液体，收集瓦氏马尾藻；
将瓦氏马尾藻干燥，粉碎，然后添加10倍重量的水作为提取液，超声波破壁，超声波脉冲为9.9s，间隔为3.3s，超声波功率为500W，超声波作用时间为30min，然后加热至80℃，保温条件下水提法提取藻多糖，浸提时间为3h，提取后离心，去除沉沉物，收集上清液；加入占上清液1%重量份的三氯乙酸沉淀蛋白，离心收集上清液，减压蒸发至原体积的三分之一，然后添加2倍体积的无水乙醇，3000rpm离心15min，得到沉淀部分，最后进行干燥，得到粗藻多糖；采用硫酸-苯酚法分析藻多糖含量，计算粗藻多糖中纯品的含量为66.2%，多糖提取率为2.49%。
实施例4
瓦氏马尾藻的繁育条件分析：
一、瓦氏马尾藻培养前10天的组织再生率检测：
以实施例1为例，检测了各因素对组织再生率的影响，设置对照组，其中，对照组1：NAA替换6-BA；对照组2：IAA替换6-BA；对照组3：不添加亚精胺，其余同实施例1。各组别待检测的组织数为200个。再生率=（已经开始再生的组织块数/总组织块数）×100%。具体结果见表1：
表1
组别 实施例1 对照组1 对照组2 对照组3
待测组织数 200 200 200 200
再生组织数 194 172 181 165
再生率% 97 86 90.5 82.5
如表1所示，本发明选择6-BA+亚精胺的组合，能够促进细胞分裂和孢子生长，促进组织再生率，而选择常用的植物生长调节剂NAA和IAA则效果较差，组织再生率下降明显。
本发明还检测了首次培养液的培养时间对再生率的影响，如图1所示，随着培养时间的增加，组织再生率提高明显，培养10d时组织再生率达到峰值，继续培养会造成组织再生率的下降，可能原因是培养液的营养成分降低，培养环境变差，因此，选择培养10d，然后更换培养液。
二、更换培养液后，添加GA3和光合细菌，能够促进假根的生成和叶片的生长，本发明检测了GA3和光合细菌对假根和叶片的影响，设置对照组，其中，对照组1：不添加GA3；对照组2：不添加光合细菌；实验组为实施例1。具体见表2：
表2
组别 平均叶片数量 平均叶片长度mm 假根情况
实验组 5.7 4.5 根系丰富
对照组1 3.8 4.1 一般
对照组2 4.3 3.9 一般
如表2所示，本发明在培养液中添加GA3和光合细菌，能够促进假根的发育，提高叶片数量和叶片长度。
综上所示，本发明瓦氏马尾藻的快速繁育方法中，首先将叶片置于浓度为10g/L的碘化钾水溶液中浸泡10min，不采用抗生素，以免产生抗生素残留，对后期的工业化应用的造成影响；然后对叶片进行捣碎，获得微小组织块，较常规的裁切叶片的方式相比，可以获得几十倍的组织数目，提高了繁育速率，但是本发明的微小组织块含有细胞数量较少，采用常规的繁育方法成功率较低，需要进行改进；本发明选择6-BA+亚精胺的组合，能够促进细胞分裂和孢子生长，促进组织再生率，可达到97%；培养10d，更换新的培养液后，添加GA3和光合细菌，培养时间为20-30d，能够促进假根的发育，提高叶片数量和叶片长度；本发明的方法能够实现瓦氏马尾藻的快速繁育，方法简便，成本低廉，培养时间短，控制在40d以内，为后续的人工规模化栽培打下了基础。
需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.瓦氏马尾藻的规模化培养以及提取多糖的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：
步骤1）组织繁育：选择健康的瓦氏马尾藻幼苗，采集叶片，置于碘化钾水溶液中浸泡10-30min，取出，然后置于组织捣碎机中进行处理，得到含有10-50个细胞的微小组织块，将微小组织块置于培养液中，培养10d；更换新的培养液，再往培养液中添加GA3和光合细菌，控制培养液中GA3浓度为30-50mg/L，光合细菌的浓度为（1-5）×108cfu/L，继续培养，待主叶叶片长度达到5mm以上时，即完成繁育过程；所述碘化钾水溶液浓度为10g/L；所述培养液按照如下工艺制备而得：往灭菌海水中添加硝酸钠1-2g/L，氯化钠0.5-1g/L，碳酸钠0.5-0.8g/L，氯化铵0.2-0.3g/L，6-BA 10-20mg/L以及亚精胺1-5mg/L，即得；
所述光合细菌为类红球菌、珊瑚红球菌、红平红球菌或任意二者以上的混合物；
步骤2）规模化培养：将藻苗接入到培养池中，培养池中注入灭菌海水，培养50-60d，排出液体，收集瓦氏马尾藻；
步骤3）提取粗多糖：将瓦氏马尾藻干燥，粉碎，然后添加5-10倍重量的水作为提取液，超声波破壁，再加热至80℃，保温条件下水提藻多糖，水提时间为3-4h，提取后离心，去除沉淀物，收集上清液；加入占上清液1-1.5%重量份的三氯乙酸用来沉淀蛋白，离心收集上清液，减压蒸发至原体积的三分之一，然后添加2-3倍体积的无水乙醇，离心，收集沉淀部分，最后进行干燥，得到粗藻多糖。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤1）中，培养10d的条件为：温度22-23℃，光照强度3000-4000lux，光暗比为12:12。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述继续培养条件为：温度19-20℃，光照强度2000-3000lux，光暗比为10:14。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述超声波破壁的条件为：超声波脉冲为9.9s，间隔为3.3s，超声波功率为500W，时间为30-45min。
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CN102793715A (zh) * 2012-08-14 2012-11-28 华东理工大学 一种马尾藻多糖及其在制备肾脏损伤药物中的应用
CN105746353A (zh) * 2016-03-09 2016-07-13 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种匍枝马尾藻无性种苗繁育的方法

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