CN109313191B - 确定细胞培养物的感染部位的数量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种确定细胞培养物的感染部位的数量的方法，包括以下步骤：用病毒感染在样品载体中布置的细胞培养物，通过透射光方法对所述细胞培养物的任何感染区域计数，用荧光标记物标记感染细胞，通过荧光分析方法对细胞培养物的感染区域计数，以及逐个区域地评估两种方法中所确定的区域，以确定感染部位的数量。
Description
本发明涉及一种确定细胞培养物的感染部位的数量的方法。
为了确定细胞培养物的感染部位的数量，已知首先使细胞培养物在样品载体上生长。合适的样品载体特别是滴定板和微量滴定板，其中细胞培养物在单独的孔中生长，使得细胞可附着于孔底。此后，用病毒液感染细胞。通常病毒液是稀释的，将不同稀释度的病毒液添加到不同的孔中。在预定的时间段(特别取决于病毒的类型)之后，移除病毒液，特别是抽出病毒液。病毒液通常作用于细胞培养物数分钟至数小时。移除病毒液后，通常提供培养基以防止稍后释放的病毒颗粒扩散。特别是作为凝胶层引入的这种培养基，用于覆盖细胞培养物。此后，通常进行数天的较长时间的等待。在此期间，受感染的细胞死亡，从中出现的病毒扩散到相邻的细胞中。由此形成相对大的区域，其中死亡细胞不再可见并且被具有仍然存活但已经被感染的细胞的区域包围。在这里，感染部位被定义为样品载体上已经发生病毒初次感染细胞的区域，其中，从相应的感染部位开始，形成其中细胞已经被感染和/或已经被破坏的感染区域。
使用透射光方法，可以对破坏的区域或没有活细胞的区域计数。这种计数通常在由人、摄像或显微镜拍摄相应图像之后进行。如果有必要，可以用染料使样品染色以增加对比度。合适的，特别是非特异性的染料(例如亚甲蓝)标记活细胞，使得没有活细胞存在的区域对于观察者来说更明显是孔。
通过透射光方法确定细胞培养物的感染部位的数量尤其具有以下缺点：例如，稍后感染的细胞或以不同方式与病毒反应的细胞尚未死亡，因此，使用透射光方法没有看到相应的孔。该缺点也适用于例如反应更慢的细胞，这使得相应的孔仍然非常小，因此是不可见或难以看见。透射光方法的另一个缺点是，不是由病毒引起的其他空洞被检测为这样的空洞并且被错误地包括在计数中。这种空洞可以是例如细胞被洗掉或存在污染的区域。例如，当添加病毒液或添加凝胶时，可以被洗掉。此外，在相应地执行透射光方法之前所必须等待的时间段的持续时间难以确定，并且这特别取决于病毒的类型。如果时间太短，则相应的感染区域仅具有少量死亡细胞，从而难以辨别相应的孔或空洞。如果时间太长，则各个区域变得融合，从而难以确定最初只有一个感染部位，还是多个具有细胞培养物的共同感染区域的感染部位。
此外，为了确定细胞培养物的感染部位的数量，已知用特别是标记感染细胞的病毒特异性荧光标记物来处理细胞培养物。然后由于相应区域发出荧光，可以计算感染区域。然而，该方法的缺点在于，相邻的感染区域不能彼此辨别，因此只能被错误地检测为一个原始感染部位。
本发明的目的是提供一种确定细胞培养物的感染部位的数量的方法，利用该方法可以更准确和更可靠地确定感染部位的数量。
根据本发明，该目的通过如权利要求1所限定的方法实现。
在本发明提供的用于确定细胞培养物中感染部位的数量的方法中，首先用病毒感染在样品载体中布置的细胞培养物。这尤其通过添加(如果需要)可以稀释的病毒液来完成。在这里，感染部位被定义为样品载体上已经发生病毒初次感染细胞的区域，其中，从感染的各个部位开始，形成其中细胞已经被感染和/或已经被破坏的感染区域。优选使用滴定板，特别是微量滴定板作为样品载体，细胞培养物优选在孔底部生长。
在下一步骤中，已知的透射光方法用于确定可能感染的区域，该区域中由于病毒感染破坏细胞而已经在细胞培养物中形成孔。因此，使用透射光方法，确定不存在活细胞的所有区域。因此，确定相应的空洞或孔。在这样做时，特别是不仅确定了细胞由于病毒细胞已经死亡的区域，而且还确定了由于污染或因为细胞已经被洗掉而不包含活细胞的区域。
此外，根据本发明，使用特别是特异性的荧光标记物标记感染的细胞。这里，基于病毒和/或基于病毒直接产生的影响来直接标记感染细胞。以这种方式，可以从细胞培养物的未感染区域中辨别感染区域。然后使用荧光分析方法确定细胞培养物的感染区域。在这样做时，大荧光区域至少最初也被计为仅一个区域。
随后，如本发明所提供的那样组合这两种方法，使得对通过两种方法确定的区域逐区域地评估，以确定感染部位的数量。特别地，通过透射光方法或通过荧光分析方法之前所确定的所有区域被连续筛选，并且由所述两种方法的组合可靠地确定所考虑的相应区域的相应感染部位的数量。例如，可以对两种方法中确定的区域求和。在这种情况下，由于个别区域被计数两次，因此可以特别地通过叠加关于所确定区域的透射光方法和荧光分析方法的确定结果来执行匹配，使得两种方法确定的区域只计数一次。因此，例如，只有已被两种方法鉴定为感染部位的这些区域才可以被计数为感染部位。具体地，根据透射光方法包括多个感染部位，而通过荧光分析方法也被检测到的区域可以可靠地表征为多重感染。只要如此，则确定细胞培养物中感染部位的数量的准确性显著提高。
特别地，方法步骤的顺序是任选的，所述方法步骤即应用如上所述的透射光方法、使用如上所述的特定标记物标记感染细胞以及应用如上所述的荧光分析方法，其中，当然，必须总是在荧光分析方法之前进行感染细胞的标记。因此，例如，可以使用特定标记物标记样品的感染细胞，并随后进行透射光方法和荧光分析方法。在这方面，特别优选对样品同时进行透射光方法和荧光分析方法。
在根据本发明的方法的优选的改进方案中，实现了通过两种方法确定的区域的评估，使得通过透射光方法检测到而通过荧光分析方法未检测到的区域不计数为感染部位。通过对两种方法确定的区域的比较，可以确定不是由病毒感染引起的空洞或孔，这是因为这些空洞不被荧光，即病毒感染的细胞包围。因此，使用本发明的方法，可以分别确定例如由洗掉或污染形成的空洞，使得这些空洞不会使感染部位的数量的结果出错。特别地，也可以单独对这些区域计数或评估。这允许对样品进行质量控制。例如，在已经发生预定数量的污染、洗掉细胞等这些缺陷的情况下，可以在评估期间忽略相应的样品。这尤其可以基于相应空洞的数量或大小以自动方式完成。控制这些缺陷的频率和大小对于样品制备的质量控制也是重要的。
在本发明的另一种优选实施方式中，确定的区域是通过荧光方法检测到，而透射光方法检测不到。这些区域被计为细胞培养物的感染部位。这些区域是具有病毒感染的细胞的区域，然而，在该区域中细胞尚未被破坏到存在相应数量的死亡细胞，然后这些死亡细胞也会分解，并且通过透射光方法可以检测为空区域的程度。特别地，还可以对这些区域进行计数甚至称重。该分析对于例如以获得病毒感染速度强烈变化的迹象可能是可行的。此外，由此可以对样品制备的某些方面进行质量控制。
在本发明的另一种优选实施方式中，对特别是通过两种方法检测的区域的大小和/或形状进行分析。具体地，当超过预定的极限大小时，即，当超过感染区域的预定范围或预定表面积时，可以对相应区域进行多次计数。这是基于这样的假设：该区域由多个生长到一起的原始感染部位形成。
优选地，更彻底地分析这些区域。因此，对于通过荧光分析方法检测并超过预定的极限大小的区域，根据大小、形状和/或荧光强度定义感染部位的数量。此外，通过考虑空洞的数量，可以更彻底地分析这些区域。根据荧光的空洞的数量是由死亡细胞引起的，优选地是在该区域中最初感染的感染部位的最小数量。这个数量可能会由于强荧光而增加，因为必须假设初次感染的细胞也存在于尚未死亡的区域中，因此没有形成空洞。
优选地，极限大小根据样品和/或测量结果来定义。例如，可以基于找到的相应区域的大小分布来确定极限大小。例如，还可以与找到的这些区域的中值进行比较。具体地，可以基于不同区域的大小统计来确定极限值。
特别优选将透射光方法和/或荧光分析方法作为自动方法进行。这特别是在成像方法的基础上实现。使用图像处理方法的自动显微镜或读板装置特别适用于此目的。例如，制造商PerkinElmer的读板器EnSight适用于此。
为了增加透射光方法的对比度，可以对细胞培养物染色。这可以使用本身已知的方法和染料，特别是亚甲蓝来完成。具体地，用非特异性染料对细胞培养物染色，所述非特异性染料以相同方式对细胞培养物的所有细胞染色，以使细胞培养物中的空洞清晰可见。有必要考虑荧光法中使用的染料的光谱特性。此外，类似于现有技术的确定细胞培养物的感染部位的数量的方法，细胞的生长、用病毒液感染细胞以及用凝胶覆盖可以如已知的那样进行。特别地，如果有必要，可以使用可以稀释的病毒液来感染细胞培养物。在这方面，在确定感染部位的数量时，优选考虑稀释因子。当使用滴定板，特别是微量滴定板时，进一步优选地在每个孔中存在相同的细胞培养物和/或可以以不同的稀释度添加相同的病毒液。特别地，通过使用具有大量孔的微量滴定板，还可以使用用不同药剂处理的不同病毒液或细胞培养物。
在本发明的优选的改进方案中，用于质量控制的控制值特别是自动地确定的。这可以是对例如由洗去或污染而非由死亡细胞引起的空洞进行更仔细的检查或仅是对其计数空洞。此外，重要的控制值是物体识别的质量，特别是不受病毒感染影响的细胞层的质地，或者样品的特定感染标记物的平均强度。此外，可以使用关于检测到的感染区域的大小或形态的细节来解释测量。
可以使用其他非特定检测方法来代替透射光方法。适用于此目的的方法是无论感染如何都标记细胞，并且随后在显微镜下读数的荧光方法。为了允许与感染特异性标记进行简单区分，出于此目的，优选具有不同特征(例如发射波长)的荧光染料。
同样地，可以实施其他感染特异性检测方法而不是荧光分析方法。这些使用非荧光的感染特异性标记物。例如，这些可以是用于比色法的染料。
利用合适的细胞类型，还可以在没有特定标记物的情况下基于纹理特征来区分感染细胞区域和未感染细胞区域。
此外，可以使用该方法不仅仅用于检测病毒对细胞培养物的感染。例如，可以想到还与感染细胞培养物的细菌使用该方法，或者与以细菌培养物为食的细胞或(单细胞)生物(例如变形虫)使用该方法。
附图示出了滴定板的孔作为示意性实施例。在孔边缘内的区域，布置如前所述地已被病毒感染的细胞培养物。结果，形成了不同的区域。白色所示的区域是例如当添加病毒液等时细胞被洗掉的区域，因此形成没有细胞的区域。深色阴影区域是荧光区域，即存在感染细胞的区域。在这种情况下，可以形成不同的区域。在所示的实施例中，这是没有无细胞中心的区域。这是一个含有感染细胞，但其中没有形成死亡细胞的无细胞中心的区域。
在图的上部，示出了具有无细胞中心或空中心的感染区域。空中心是存在死亡细胞的区域。它们被感染细胞并因此被荧光细胞包围。孔左侧显示的大区域显示了生长到一起的感染部位。该大区域具有被荧光细胞并因此被感染细胞包围的四个空中心。
Claims (20)
1.一种确定细胞培养物的感染部位的数量的方法，包括以下步骤：
用病毒感染在样品载体中布置的细胞培养物；
通过透射光方法确定所述细胞培养物的任何感染区域，从而提供透射光结果；
用荧光标记物标记感染细胞；
通过荧光分析方法确定所标记的感染细胞的感染区域，从而提供荧光分析结果；以及
通过对透射光结果和荧光结果进行叠加使得两种方法都确定的区域只计数一次并基于叠加鉴定感染部位的数量来确定感染部位的数量，其中，所述感染部位的数量通过将由所述透射光方法确定的区域和由所述荧光分析方法确定的区域结合来确定，使得对通过两种方法确定的区域逐区域地评估。
2.权利要求1所述的方法，其中，当通过透射光方法检测到，而荧光方法检测不到时，对通过所述透射光方法鉴定而通过所述荧光分析方法不鉴定的区域不计数。
3.权利要求1所述的方法，其中，当通过荧光方法检测到，而透射光方法检测不到时，对通过所述荧光分析方法鉴定而通过所述透射光方法不鉴定的区域计数。
4.权利要求1所述的方法，其中，对超过预定的极限大小的区域计数数次，其中所述极限大小为感染区域的预定范围或预定表面积。
5.权利要求1所述的方法，其中，根据大小、形状和/或荧光强度，对通过所述荧光分析方法鉴定并超过预定的极限大小的区域定义数量，其中所述极限大小为感染区域的预定范围或预定表面积。
6.权利要求1所述的方法，其中，将通过所述荧光分析方法鉴定并超过预定的极限大小的区域与通过所述透射光方法确定的相应区域进行比较，并至少对在通过所述透射光方法确定的相应区域中鉴定的空洞数目进行计数，其中所述极限大小为感染区域的预定范围或预定表面积。
7.权利要求4所述的方法，其中，根据样品和/或测量结果自动地调整极限大小。
8.权利要求1所述的方法，其中，所述透射光方法和/或所述荧光分析方法是自动执行方法。
9.权利要求1所述的方法，其中，所述透射光方法和/或所述荧光分析方法是基于成像方法的自动执行方法。
10.权利要求1所述的方法，其中，在执行所述透射光方法之前对所述细胞培养物染色。
11.权利要求1所述的方法，其中，自动地确定用于质量控制的控制值。
12.权利要求1所述的方法，其中，使用稀释的病毒液感染所述细胞培养物。
13.权利要求11所述的方法，其中，在确定所述感染部位的数量时考虑稀释度。
14.权利要求1所述的方法，其中，使用滴定板作为所述样品载体。
15.权利要求1所述的方法，其中，使用微量滴定板作为所述样品载体。
16.权利要求14所述的方法，其中，相同的细胞培养物存在于所述滴定板的每个孔中。
17.权利要求15所述的方法，其中，相同的细胞培养物存在于所述微量滴定板的每个孔中。
18.权利要求13所述的方法，其中，在停留时间后移除病毒液并用覆盖物代替，这阻止了随后释放的病毒颗粒的扩散。
19.权利要求13所述的方法，其中，在停留时间后移除病毒液并用凝胶层代替，这阻止了随后释放的病毒颗粒的扩散。
20.权利要求1所述的方法，其中，所述方法的实施在温育时间段后进行。
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