CN109312388B - 用于样品制备的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于原位制备样品的方法、装置和系统，例如用于检测此类样品中可凝固纤维蛋白原的存在和/或定量此类样品中可凝固纤维蛋白原。

Description

用于样品制备的装置和方法
技术领域
本发明所公开的主题涉及原位制备样品，例如用于检测此类样品中可凝固纤维蛋白原的存在，和/或定量此类样品中可凝固纤维蛋白原。
背景技术
例如在生产基于纤维蛋白原的产品诸如纤维蛋白原浓缩物和纤维蛋白密封剂时，需要检测和定量可凝固纤维蛋白原。
本发明所公开的主题具体地涉及样品的制备以用于通过根据欧洲药典7.0(还参见：Gaffney P.J.和Wong M.Y.Collaborative study of a proposed InternationalStandard for plasma Fibrinogen measurement.Thrombosis and Heamostasis,68(4),第428-432页,1992)的所谓重力测定方法检测可凝固纤维蛋白原，该方法通常包括以下步骤：
a)将凝血酶溶液和EDTA加入所测试的含有纤维蛋白原的样品，从而形成纤维蛋白凝块。EDTA(Ca++螯合剂)抑制由凝血酶引起的FXIII向FXIIIa(血浆转谷氨酰胺酶)的活化，从而防止非可凝固蛋白与纤维蛋白的γ-谷氨酰基-ε-赖氨酸桥形成；
b)干燥所形成的凝块(例如通过在Whatmann纸上吸收液体)，接着进行若干次洗涤，例如用盐水溶液洗涤，由此除去“非可凝固”蛋白；以及
c)使步骤(b)之后所保留下来的纤维蛋白凝块降解(例如，通过硫酸、或6M尿素和0.2M NaOH的混合物)，从而产生样品，以进一步用于通过任何已知的方法例如分光光度计测量来检测/定量其中的纤维蛋白原。
Dempfle等人(“A 96-well microfiltration assay for measurement of TotalClottable Fibrinogen”；Thromb Haemost,1999,81,264-267)公开了一种重力测定方法，该重力测定方法通常包括以下步骤：
a)将凝血酶溶液加入设置在过滤膜上的含有纤维蛋白原的样品，以便在该膜上形成纤维蛋白凝块；
b)洗涤步骤(a)中的在过滤膜上形成的凝块并且通过在与容纳纤维蛋白凝块相反的一侧上向膜施加真空来干燥该凝块，由此通过过滤膜除去“非可凝固”蛋白，在其上留下干燥的可凝固纤维蛋白；以及
c)将步骤(b)中保留下来的纤维蛋白凝块溶解于溶剂溶液中，从而由此产生样品以进一步用于通过任何已知的方法来检测/定量其中的纤维蛋白原。
在Dempfle等人的方法中，使用了96孔微滤测定，其中每个孔包括1.2μm孔隙大小的亲水性膜，该亲水性膜用洗涤剂预处理。在此方法中，上述步骤(a)和(b)在阵列内执行，同时在步骤(b)之后，从测定中移除其上粘附有纤维蛋白凝块的膜，并且对来自96个膜中的每一个的纤维蛋白凝块的溶解(上述步骤(c))在单独的试管中执行，每个此类试管一个具有粘附纤维蛋白凝块的膜。
发明内容
根据本发明所公开的主题的一个方面，提供了一种用于执行原位制备样品的装置，所述制备包括多个步骤并且涉及至少两种物质，该装置包括：
-物质接收部分，该物质接收部分具有顶部和底部并且具有足以将每个所述步骤所需的预定量的材料通过顶部接收在其中的尺寸；
-膜，该膜具有上表面和下表面，该上表面构成物质接收部分的底部并且面向物质接收部分的内部，该下表面面向物质接收部分的外部，并且该膜具有仅在向其外表面施加真空时为了至少在一个步骤中允许设置在物质接收部分中的流体从其中朝向物质接收部分的外部转移穿过膜的此类结构；以及
-至少一个阻挡构件，所述构件被配置成采取一种位置，在该位置中该构件靠近膜的外表面设置并且覆盖它，以便防止穿过膜在物质接收部分和物质接收部分的外部之间流体连通的可能性，并且所述构件被配置成采取另一种位置，该位置与膜间隔开，以便允许所述流体连通。
该装置的上述结构，并且具体地它包括阻挡构件的事实，允许在其中执行用于检测可凝固纤维蛋白原的样品制备的重力测定的所有步骤。具体地，针对上述结构，纤维蛋白凝块的溶解可在装置的相同腔体中执行，其中已形成凝块，洗涤并且干燥。
该装置可包括细长腔体，该细长腔体具有上开口和下开口以及第一腔体部分和第二腔体部分，该第一腔体部分由在上开口和膜之间延伸的所述物质接收部分构成，该第二腔体部分在所述膜和腔体下开口之间延伸，并且其中所述阻挡构件能够从装置的下开口插入到第二腔体部分中。
为了在向其施加真空时，使膜允许流体从其一侧转移至其另一侧，膜可由多孔材料制成。当将该装置用于样品制备以用于检测纤维蛋白原的存在和/或定量纤维蛋白原时，使用具有在10至40μm范围内，更特别地在20至30μm范围内，并且还更特别地约25μm大小的孔隙的膜，可期望该装置的优异性能。
制成膜的材料还可不含吸收特性，并且至少相对于所述物质是惰性的。此外，该材料可为疏水性的以防止形成纤维蛋白凝块所需的物质在膜上铺展，从而覆盖膜的大部分表面，因而阻塞孔隙。
阻挡构件可具有沿细长腔体轴线的延伸部，该延伸部至少不小于第二腔体部分的对应延伸部。当阻挡构件靠近膜设置时，此结构进一步防止穿过膜在物质接收部分和第二开口端之间流体连通的可能性。
上述装置可包括构成孔的阵列的多个细长腔体或物质接收部分以及对应的多个阻挡构件(如果有的话)，该多个阻挡构件各自被配置成相对于所对应的腔体或物质接收部分采取位置。
根据本发明所公开的主题的另一个方面，提供了一种用于执行原位制备样品的装置，所述制备包括多个步骤并且涉及至少两种物质，该装置包括：
-至少一个物质接收部分，该物质接收部分具有顶部和底部并且具有足以将每个所述步骤所需的预定量的材料通过顶部接收在其中的尺寸；以及
-膜，该膜具有上表面和下表面，该上表面构成物质接收部分的底部并且面向物质接收部分的内部，该下表面面向物质接收部分的外部，并且该膜具有仅在向其下表面施加真空时为了至少在一个步骤中允许设置在物质接收部分中的流体穿过膜从其中转移至物质接收部分的外部的此类结构；
其中膜由疏水性材料制成，该疏水性材料至少相对于所述物质不含吸收特性，从而允许在物质接收部分中通过混合所述物质，并且任选地在腔体中孵育混合物而在其上形成的凝块仅部分地覆盖膜。
具体地，疏水性材料可被选择成相对于所使用的物质，使得凝块在膜上占据的区域不超过物质接收部分底部处的膜区域的80％。更具体地，凝块所占据的区域可在物质接收部分底部处的膜区域的50％和80％之间的范围内。
使用多孔膜是已知的，例如，来自US 2006/0019410和EP 0415983，这些专利公开了将流体混合物放置在多孔膜的一侧上并且将一部分的混合物转移至其另一侧，以进一步用于检测/定量方法。US 2006/0019410还公开了向膜的另一侧施加真空以及膜具有疏水性特性的可能性。然而，这些出版物中描述的方法并没有以本发明所公开的主题中的方式使用膜的疏水性特性。
任何上述方面的装置可构成系统的一部分，该系统包括：
-上板，该上板具有上表面、下表面和在它们之间延伸的多个第一孔部分，该多个第一孔部分各自具有在上表面处的上开口端和在下表面处的下开口端，每个第一孔部分构成所述物质接收部分；以及
-膜片，该膜片被配置为在上板的下表面处与该上板组装，使得最靠近每个第一孔部分的下开口端并且在形状和尺寸上与其对应的膜区域构成第一孔部分的底部。
该系统还可包括下板，该下板具有上表面、下表面和在它们之间延伸的多个第二孔部分，并且该多个第二孔部分具有的横截面形状和尺寸对应于第一孔部分的横截面形状和尺寸，每个第二孔部分具有在下板的上表面处的上开口端和在下板的下表面处的下开口端；上板和下板被配置成彼此固定，其中膜夹在它们之间，使得每对对应的第一孔部分和第二孔部分同轴对准以形成一个孔并且由膜的所述区域隔开。
该系统还可包括用于在膜的上述区域和对应的第一孔部分的下开口端、和/或对应的第二孔部分的上开口端周围形成密封的密封布置，以用于防止流体从孔渗漏到板和膜之间的空间中。
该系统可包括锁，该锁用于将上述板、膜以及上密封片和下密封片牢固地保持在一起，从而由此形成具有开放式孔的组件。另选地，该系统可包括用于此目的的螺栓和螺母。
该系统还可包括具有所述阻挡构件的阻挡底座，阻挡构件各自具有在形状和尺寸上对应于膜的所述区域的阻挡表面。阻挡构件可为从阻挡底座的上表面突出的多个立柱的形式，所述阻挡表面由立柱的上凸缘构成。这些阻挡立柱在靠近膜时可覆盖膜，以防止穿过膜在第一孔部分和第二孔部分之间流体连通的可能性。
该系统可包括在阻挡构件靠近膜时相对于上板和下板将阻挡底座牢固地保持在固定关系中的锁。
该组件可被配置成在所述阻挡构件远离膜时安装在真空歧管上，使得第二孔部分的下开口端暴露以用于向其施加真空。
根据本发明所公开的主题的其它方面，提供了一种使用如上所述的任何装置，用于检测纤维蛋白原的存在和/或定量纤维蛋白原的样品制备的原位方法，该方法包括多个步骤并且涉及至少两种物质，该至少两种物质中的一种包括纤维蛋白原，并且另一种包括蛋白水解酶，该蛋白水解酶能够在其与纤维蛋白原(例如凝血酶)反应时形成纤维蛋白。这些步骤至少包括以下：
(a)通过在物质接收部分中将所述至少两种物质混合在膜上，并且任选地孵育混合物来形成凝块；
(b)在物质接收部分中用液体洗涤凝块；
(c)通过在腔体的下开口处施加真空，由此使液体通过第二开口端穿过膜从物质接收部分抽吸出来而除去液体；
(d)任选地，将步骤(b)和(c)重复多次，所述次数任选地不超过10；
(e)防止穿过膜在物质接收部分和下开口端之间的流体连通；以及
(f)用合适的水性溶液溶解物质接收部分中的凝块。
在一些实施方案中，步骤(a)至(f)在原位或在相同的物质接收部分、腔体部分和/或孔中进行。
该水性溶液可包含碱性物质例如NaOH和/或离液剂例如尿素或胍盐酸盐。
根据本发明所公开的主题的另一个方面，提供了一种用于组装如上所述的系统的套件。具体地，其中该系统包括孔的阵列，这些孔各自具有在第一孔开口端和第二孔开口端之间延伸的细长腔体形式，该套件包括：
-上板，该上板具有上表面、下表面和在它们之间延伸的多个第一孔部分，该多个第一孔部分各自具有在上表面处的上开口端和在下表面处的下开口端，上端构成第一孔开口端；
-膜片，该膜片被配置为在上板的下表面处与该上板组装，使得最靠近每个第一孔部分的下开口端并且在形状和尺寸上与其对应的膜区域构成第一孔部分的底部；以及
-下板，该下板具有上表面、下表面和在它们之间延伸的多个第二孔部分，并且该多个第二孔部分具有的横截面形状和尺寸对应于第一孔部分的横截面形状和尺寸，每个第二孔部分具有在下板的上表面处的上开口端和在下板的下表面处的下开口端；
其中上板和下板被配置成彼此固定，其中膜夹在它们之间，使得第一孔部分和第二孔部分同轴对准以形成所述孔并且由膜的所述区域隔开，每个第二孔部分的下端构成第二孔开口端。
在一个方面，本发明提供了一种用于执行原位制备样品的装置，所述制备包括多个步骤并且涉及至少两种物质，该装置包括：
-物质接收部分(41)，物质接收部分(41)具有顶部(11)和底部并且具有足以将每个所述步骤所需的预定量的材料通过顶部(11)接收在其中的尺寸；
-膜(30)，膜(30)具有上表面(31a)和下表面(31b)，上表面(31a)构成物质接收部分(41)的底部并且面向物质接收部分的内部，下表面(31b)面向物质接收部分的外部，并且膜(30)具有仅在向其底部施加真空时为了至少在一个步骤中允许设置在物质接收部分中的流体从其中朝向物质接收部分的外部转移穿过膜的此类结构；以及
-至少一个阻挡构件(51)，所述构件被配置成采取一种位置，在该位置中构件靠近膜的下表面设置并且覆盖它，以便防止穿过膜在物质接收部分和物质接收部分的外部之间流体连通的可能性，并且所述构件被配置成采取另一种位置，该位置与膜间隔开，以便在向物质接收部分的底部施加真空时允许所述流体连通。
在本发明的一个实施方案中，该装置还包括细长腔体(40)，细长腔体(40)具有上开口和下开口(11,21)、由所述物质接收部分(41)构成的第一腔体部分以及在所述膜(30)和腔体的下开口(21)之间延伸的第二腔体部分(42)，并且其中所述阻挡构件(51)能够从装置的下开口端插入到第二腔体部分中。
在本发明的另一个实施方案中，装置的围绕物质接收部分、膜和阻挡构件的至少一部分耐受碱性物质，更特别地NaOH。
在本发明的另一个实施方案中，该膜由如下材料制成，该材料至少在使用前至少相对于所述物质不含吸收特性。
在本发明的一个实施方案中，所述材料为多孔疏水性材料。
在本发明的另一个实施方案中，所述材料对至少所述物质是惰性的。
在本发明的另一个实施方案中，所述材料具有在10至40μm范围内，更特别地在20至30μm范围内，并且还更特别地约25μm大小的孔隙。
在本发明的另一个实施方案中，该装置被配置成在阻挡构件(51)与膜(30)间隔开时安装在真空歧管上，以便允许向膜的下表面(31b)施加真空。
在本发明的另一个实施方案中，所述阻挡构件具有沿轴线(X)的延伸部，该延伸部至少不小于沿此轴线的第二腔体部分的延伸部。
在本发明的另一个实施方案中，该装置包括构成孔(40)的阵列的多个物质接收部分以及对应的多个阻挡构件，该多个阻挡构件各自被配置成相对于所对应的物质接收部分采取位置。
在本发明的另一个实施方案中，该装置构成系统(3)的一部分，系统(3)包括：
-上板(10)，上板(10)具有上表面(15)、下表面(12)和在它们之间延伸的多个第一孔部分(41)，多个第一孔部分(41)各自具有在上表面处的顶部开口端和在下表面处的底部开口端，每个第一孔部分构成所述物质接收部分(41)；以及
-膜片(30)，膜片(30)被配置为在上板(10)的下表面(12)处与上板(10)组装，使得最靠近每个第一孔部分的下开口端并且在形状和尺寸上与其对应的膜区域构成第一孔部分的底部(32)。
在本发明的另一个实施方案中，所述系统还包括用于在膜的所述区域(32)和对应的第一孔部分的下开口端周围形成密封的密封布置(60)。
在本发明的另一个实施方案中，所述密封布置(60)为任选地由硅制成的上密封片(60a)的形式，上密封片(60a)具有在形状和尺寸上对应于第一孔部分的底部开口端的多个上密封开口(65a)，上密封片被配置成安装在上板(10)和膜(30)之间，其中该上密封片的开口与第一孔部分(41)同轴对准。
在本发明的另一个实施方案中，所述系统还包括下板(20)，下板(20)具有上表面(22)、下表面(25)和在它们之间延伸的多个第二孔部分(42)，并且多个第二孔部分(42)具有的横截面形状和尺寸对应于第一孔部分的横截面形状和尺寸，每个第二孔部分具有在下板的上表面处的顶部开口端和在下板的下表面处的底部开口端；上板(10)和下板(20)被配置成彼此固定，其中膜(30)夹在它们之间，使得每对对应的第一孔部分(41)和第二孔部分(42)同轴对准以形成一个孔并且由膜的所述区域(32)隔开。
在本发明的另一个实施方案中，所述系统还包括在膜的所述区域和第二孔部分的顶部开口端周围形成密封的密封布置。
在本发明的另一个实施方案中，所述密封布置为任选地由硅制成的下密封片(60b)的形式，下密封片(60b)具有在形状和尺寸上对应于第二孔部分的顶部开口端的多个下密封开口(65b)，密封片被配置成安装在下板(20)和膜(30)之间，其中该密封片的开口与第二孔部分(42)同轴对准。
在本发明的另一个实施方案中，第一板和第二板中的一个包括锁(70)，锁(70)用于将上板和下板、膜以及上密封片和下密封片牢固地保持在一起，从而由此形成具有开放式孔的组件(100)。
在本发明的另一个实施方案中，所述系统还包括具有所述阻挡构件(51)的阻挡底座(50)，阻挡构件(51)各自具有在形状和尺寸上对应于膜的所述区域(32)的阻挡凸缘(53)。
在本发明的另一个实施方案中，所述阻挡构件为从阻挡底座的上表面突出的多个立柱的形式，所述阻挡表面由立柱的顶部表面构成。
在本发明的另一个实施方案中，该系统包括在阻挡构件(51)靠近膜(30)时相对于上板(10)和下板(20)将阻挡底座(50)牢固地保持在固定关系中的锁(80)。
在本发明的另一个实施方案中，所述组件(100)被配置成在所述阻挡构件(51)与膜间隔开时安装在真空歧管上，使得第二孔部分的底部开口端(21)暴露以用于向其施加真空。
本发明的另一个方面涉及一种用于检测可凝固纤维蛋白原的存在和/或定量可凝固纤维蛋白原的样品制备的原位方法，该方法包括多个步骤并且涉及至少两种物质，该至少两种物质中的一种包括纤维蛋白原，并且另一种包括蛋白水解酶，该蛋白水解酶能够在其与纤维蛋白原反应时形成纤维蛋白，所述步骤至少如下：
(a)提供根据本发明的装置；
(b)通过在物质接收部分中将所述至少两种物质混合在膜上来形成凝块；
(c)在物质接收部分中用液体洗涤凝块；
(d)通过在阻挡构件(51)与膜(30)间隔开时在物质接收部分的底部处施加真空和/或向腔体的下开口(21)施加真空，由此使液体通过下开口穿过膜从物质接收部分(41)抽吸出来而除去液体；
(e)任选地，将步骤(c)和(d)重复多次；
(f)使阻挡构件(51)的位置靠近膜；以及
(g)用合适的水性溶液溶解物质接收部分中的凝块。
在一些实施方案中，步骤(b)至(g)在原位或在相同的物质接收部分中进行。
在本发明的一个实施方案中，该水性溶液包含碱性物质和/或离液剂。
在本发明的另一个实施方案中，该方法还包括孵育步骤(b)中获得的混合物。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(d)中的所述施加真空通过在所述阻挡构件(51)远离膜时将该装置安装在真空歧管上，使得第二孔部分的底部开口端(21)暴露以用于向其施加真空来执行。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(e)中的所述次数不超过10。
本发明的另一个目的是提供一种用于执行原位制备样品的装置，所述制备包括多个步骤并且涉及至少两种物质，该装置包括：
-至少一个细长腔体(40)，所述腔体具有沿该装置的纵向轴线(X)间隔开的上开口和下开口(11,21)；所述腔体具有物质接收部分(41)，物质接收部分(41)在物质接收部分的顶部开口端和底部之间延伸，并且具有足以将每个所述步骤所需的预定量的材料通过上开口接收在其中的尺寸；以及
-膜(30)，膜(30)构成物质接收部分的底部，并且具有仅在通过下开口向其施加真空时为了至少在一个步骤中允许设置在物质接收部分中的流体从其中朝向腔体的下开口端(21)转移穿过膜的此类结构；
其中膜由疏水性材料制成，该疏水性材料至少相对于所述物质不含吸收特性，从而允许在物质接收部分中通过混合所述物质，并且任选地在物质接收部分中孵育混合物而在其上形成的凝块仅部分地覆盖膜，更特别地仅覆盖50％-80％范围内的膜区域。
在本发明的一个实施方案中，所述细长腔体(40)包括由所述物质接收部分(41)构成的第一腔体部分以及在所述膜(30)和腔体的下开口(21)之间延伸的第二腔体部分(42)。
在本发明的另一个实施方案中，装置的围绕细长腔体和膜的至少一部分耐受碱性物质，更特别地NaOH。
在本发明的另一个实施方案中，所述材料为多孔的。
在本发明的另一个实施方案中，所述材料对至少所述物质是惰性的。
在本发明的另一个实施方案中，所述材料具有在10至40μm范围内，更特别地在20至30μm范围内，并且还更特别地约25μm大小的孔隙。
在本发明的另一个实施方案中，该装置被配置成安装在真空歧管上，以便允许向膜的下表面(31b)施加真空。
在本发明的另一个实施方案中，该装置包括构成孔的阵列的多个细长腔体。
在本发明的另一个实施方案中，该装置构成系统(3)的一部分，系统(3)包括：
-上板(10)，上板(10)具有上表面(15)、下表面(12)和在它们之间延伸的多个第一孔部分(41)，多个第一孔部分(41)各自具有在上表面处的顶部开口端和在下表面处的底部开口端，每个第一孔部分构成所述物质接收部分(41)；以及
-片材形式的膜(30)，膜(30)被配置为在上板(10)的下表面(12)处与上板(10)组装，使得最靠近每个第一孔部分的底部开口端并且在形状和尺寸上与其对应的膜区域构成第一孔部分的底部(32)。
在本发明的一个实施方案中，所述系统还包括用于在膜的所述区域(32)和对应的第一孔部分的底部开口端周围形成密封的密封布置(60)。
在本发明的一个实施方案中，所述密封布置(60)为任选地由硅制成的上密封片(60a)的形式，上密封片(60a)具有在形状和尺寸上对应于第一孔部分的底部开口端的多个上密封开口(65a)，上密封片被配置成安装在上板(10)和膜(30)之间，其中该上密封片的开口与第一孔部分同轴对准。
在本发明的一个实施方案中，所述系统还包括下板(20)，下板(20)具有上表面(22)、下表面和在它们之间延伸的多个第二孔部分(42)，并且多个第二孔部分(42)具有的横截面形状和尺寸对应于第一孔部分的横截面形状和尺寸，每个第二孔部分具有在下板的上表面处的顶部开口端和在下板的下表面处的底部开口端；上板(10)和下板(20)被配置成彼此固定，其中膜(30)夹在它们之间，使得每对对应的第一孔部分(41)和第二孔部分(42)同轴对准以形成一个孔并且由膜的所述区域(32)隔开。
在本发明的一个实施方案中，所述系统还包括在膜的所述区域和第二孔部分的上开口端周围形成密封的密封布置。
在本发明的另一个实施方案中，所述密封布置为任选地由硅制成的下密封片(60b)的形式，下密封片(60b)具有在形状和尺寸上对应于第二孔部分的顶部开口端的多个下密封开口(65b)，密封片被配置成安装在下板(20)和膜(30)之间，其中该密封片的开口与第二孔部分(42)同轴对准。
在本发明的另一个实施方案中，第一板和第二板中的一个包括锁(70)，锁(70)用于将上板和下板、膜以及上密封片和下密封片牢固地保持在一起，从而由此形成具有开放式孔的组件(100)。
在本发明的另一个实施方案中，所述组件(100)被配置成安装在真空歧管上，使得第二孔部分的底部开口端(21)暴露以用于向其施加真空。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测可凝固纤维蛋白原的存在和/或定量可凝固纤维蛋白原的样品制备的原位方法，该方法包括多个步骤并且涉及至少两种物质，该至少两种物质中的一种包括纤维蛋白原，并且另一种包括蛋白水解酶，该蛋白水解酶能够在其与纤维蛋白原反应时形成纤维蛋白，所述步骤至少如下：
(a)提供根据本发明的装置；
(b)通过在物质接收部分中将所述至少两种物质混合在膜上来形成凝块，其中由于膜的疏水性质，凝块仅部分地覆盖膜，更特别地仅覆盖50％-80％范围内的膜区域；
(c)在物质接收部分中用液体洗涤凝块；
(d)通过在腔体的下开口处施加真空且由此使液体从物质接收部分抽吸出来而除去液体；
(e)任选地，将步骤(c)和(d)重复多次；
(f)防止穿过膜在物质接收部分(41)和下开口端(21)之间的流体连通；以及
(g)用合适的水性溶液溶解物质接收部分中的凝块。
在一些实施方案中，步骤(b)至(g)在原位或在相同的物质接收部分、腔体部分和/或孔中进行。
在本发明的一个实施方案中，所述物质的量使得所形成的凝块具有如下尺寸，该尺寸小于构成物质接收部分底部的膜的尺寸，使得凝块不会完全覆盖膜的表面。
在本发明的另一个实施方案中，该水性溶液包含碱性物质和/或离液剂。
在本发明的另一个实施方案中，该方法还包括孵育步骤(b)中获得的混合物。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(d)中的所述施加真空通过将该装置安装在真空歧管上，使得第二孔部分的底部开口端(21)暴露以用于向其施加真空来执行。
在本发明的另一个实施方案中，步骤(e)中的所述次数不超过10。
在另一个方面，本发明涉及一种用于组装包括孔(40)的阵列的系统(1)的套件，这些孔(40)各自具有在顶部孔开口端(11)和底部孔开口端(21)之间延伸的细长腔体形式，该套件包括：
-上板(10)，上板(10)具有上表面(15)、下表面(12)和在它们之间延伸的多个第一孔部分，每个第一孔部分具有在上表面处的顶部开口端和在下表面处的底部开口端；以及
-下板，该下板具有上表面(22)、下表面(25)和在它们之间延伸的多个第二孔部分(42)，并且该多个第二孔部分(42)具有的横截面形状和尺寸对应于第一孔部分(41)的横截面形状和尺寸，每个第二孔部分具有在下板的上表面处的顶部开口端和在下板的下表面处的底部开口端；
其中上板(10)和下板(20)被配置成与膜片(30)一起使用，当板彼此固定时，膜片(30)夹在它们之间，使得第一孔部分和第二孔部分(41,42)同轴对准以形成所述孔(40)并且由膜(30)隔开，每个第一孔部分的顶端构成第一孔开口端(11)，并且每个第二孔部分的底端(21)构成第二孔开口端。
在本发明的一个实施方案中，该套件还包括所述膜片(30)。
在本发明的另一个实施方案中，该套件还包括任选地由硅制成的上密封片(60a)，上密封片(60a)形成为具有对应于第一孔部分(41)的横截面形状和尺寸的形状和尺寸的多个上密封开口(65a)，其中当组装该系统时，上密封开口与第一孔部分同轴对准，上密封片为下列中的一种：
-永久性地附接至上板的下表面并且构成其整体部分；
-在膜的一侧上永久性地附接至膜并且构成膜的整体部分；或者
-在组装该系统时被配置成安装在上板和膜之间。
在本发明的另一个实施方案中，该套件还包括任选地由硅制成的下密封片(60b)，下密封片(60b)形成为具有对应于第二孔部分(42)的横截面形状和尺寸的形状和尺寸的多个下密封开口(65b)，其中当组装该系统时，下密封开口与第二孔部分同轴对准，下密封片为下列中的一种：
-永久性地附接至下板的上表面并且构成其整体部分；
-在膜侧上永久性地附接至膜并且构成膜的整体部分，该膜侧与上密封片附接的一侧相对；或者
-在组装该系统时被配置成安装在下板和膜之间。
在本发明的另一个实施方案中，第一板(10)和第二板(20)中的一个包括锁(70)，锁(70)用于将这些板、膜以及任选地上密封片和下密封片锁定在一起，从而由此形成开放式组件(100)，该上密封片和该下密封片设置在膜和相应的上板和下板之间。
在本发明的另一个实施方案中，该套件还包括具有多个阻挡凸缘(53)的阻挡底座(50)，多个阻挡凸缘(53)各自在形状和尺寸上对应于膜的所述区域的形状和尺寸，阻挡底座被配置成采取一种位置，在该位置中每个阻挡表面靠近膜的对应区域设置并且如果从孔的底部开口端方向看，完全覆盖该对应区域，以便防止穿过膜在第一孔部分和第二孔开口端之间流体连通的可能性，并且阻挡底座被配置成采取另一种位置，在该位置中阻挡表面与底部孔开口端在远离膜的方向上间隔开，以便允许所述流体连通。
在本发明的另一个实施方案中，所述阻挡底座形成为具有从其上表面突出的多个立柱(51)，所述阻挡表面由立柱的顶部表面构成。
在本发明的另一个实施方案中，所述阻挡底座包括在阻挡底座远离膜时将所述开放式组件(100)锁定到其上的锁(80)。
在本发明的另一个实施方案中，所述开放式组件(100)被配置成安装在真空歧管上，使得底部孔开口端暴露以用于向孔(40)施加真空。
在本发明的另一个实施方案中，所述膜由疏水性材料制成。
在本发明的另一个实施方案中，所述膜由不含吸收特性的材料制成。
本发明的另一个方面是提供一种用于定量含纤维蛋白原的样品中可凝固纤维蛋白原的方法，该方法包括如上所公开的步骤(a)至(g)，并且还包括：
(h)将预定部分的步骤(g)的溶解凝块转移至比色皿；
(i)使用分光光度计测量该部分的蛋白质吸光度；以及
(j)确定样品中存在的可凝固纤维蛋白原，纤维蛋白原标准品含有已知量的可凝固纤维蛋白原。
在本发明的一个实施方案中，测量蛋白质吸光度的步骤通过测量在280nm波长处和在320nm波长处的光密度，并且从在280nm处获得的光密度减去在320nm处获得的光密度来执行。
在本发明的另一个实施方案中，纤维蛋白原标准品经受步骤(a)至(i)而作为含纤维蛋白原的样品。在另一个方面，本发明涉及一种用于执行原位制备样品的系统，该系统包括：
-上板(10)，上板(10)具有上表面(15)、下表面(12)和在它们之间延伸的第一孔部分(41)的阵列；
-下板(20)，下板(20)具有上表面(22)、下表面(25)和在它们之间延伸并且对应于第一孔部分(41)的阵列的第二孔部分(42)的阵列；
-上密封片(60a)和下密封片(60b)，上密封片(60a)具有相应上密封开口(65a)的阵列，下密封片(60b)具有相应下密封开口(65b)的阵列，这些阵列各自对应于上板和下板(10,20)中的第一孔部分和第二孔部分(41,42)的阵列；
-膜片(30)，膜片(30)具有上表面(31a)和下表面(31b)，并且膜片(30)具有仅在向下表面(31b)施加真空时为了允许设置在其上表面(31a)处的流体朝向其下表面(31b)转移穿过膜(30)的此类结构；
-在下板(20)中的锁(70)，锁(70)被配置成将上板和下板(10,20)、膜(30)、在上板和膜之间的上密封片(65a)以及在膜和下板之间的下密封片(65b)牢固地保持在一起，其中所有的阵列被对准以便形成具有孔(40)的阵列的组件(100)，这些孔(40)各自具有在上板的上表面处的顶部开口端(11)、在下板的下表面处的底部开口端(21)、在顶部开口端和膜的上表面(31a)之间延伸的第一孔部分(41)、以及在膜的下表面和底部开口端之间延伸的第二孔部分(42)，其中当流体从第一孔部分转移穿过膜进入第二孔部分中时，膜的上表面和下表面在第一孔部分和第二孔部分周围被密封没有该流体；
该系统还包括：
-阻挡底座(50)，阻挡底座(50)具有从其上表面突出并且被配置为在从底部开口端插入第二孔部分(42)中时被接收在第二孔部分(42)中以防止设置在膜上表面处的流体转移穿过膜进入第二孔部分中的立柱(51)的阵列；
-阻挡底座(50)，阻挡底座(50)具有在阻挡立柱(51)被接收在第二孔部分(42)中时相对于组件(100)将阻挡底座(50)牢固地保持在固定关系中的多个锁(80)。
附图说明
为了更好地理解本文公开的主题并且举例说明如何可在实践中实施该主题，现在参照附图仅通过非限制性示例来描述各实施方案，其中：
图1是根据本发明所公开的主题的一个实施方案的系统的示意性透视图；
图2A和图2B是沿平面II-II取得的图1的系统的示意性剖视图，其中该系统的阻挡底座分别处于第一位置和第二位置；
图3是根据本发明所公开的主题的另一个实施方案的系统的部件分解图；
图4A是根据本发明所公开的主题的另一个实施方案的系统的部件分解图；
图4B至图4D是不具有其阻挡板、处于其组装的不同阶段的图4A中所示的系统的透视图；并且
图4E至图4G是处于将其阻挡板固定至图4D中所示的组件的不同阶段的图4A中所示的系统的透视图。
具体实施方式
图1、图2A和图2B是根据本发明所公开的主题的一个实施方案的系统1的示意性透视图和剖视图，系统1例如通过本说明书的背景技术部分中描述的包括步骤(a)至(c)的程序用于多种含纤维蛋白原的样品(下文：“测试样品”)的原位制备，以用于使用含有蛋白水解酶的溶液检测纤维蛋白原的存在和/或定量纤维蛋白原，该蛋白水解酶能够在其与纤维蛋白原例如凝血酶反应时形成纤维蛋白。
系统1包括上板10、下板20以及在它们之间的多孔膜30，上板10具有带有上开口11的第一腔体部分41的阵列，下板20具有带有下开口21的对应第二腔体部分42的阵列，多孔膜30被组装使得上板的第一腔体部分与下板的第二腔体部分相对于纵向轴线X同轴对准，并且膜30在它们之间隔开，从而由此形成细长腔体40的阵列，细长腔体40各自被配置成单个测试样品的制备。系统1还包括具有从其中向上突出的多个立柱51的阻挡板50，多个立柱51各自被配置成接收在对应的下开口21中。
如图1和图2A中所见，每个细长腔体40构成孔，其中该孔的顶部开口端和底部开口端分别由板10和20的上开口和下开口11和21构成，细长腔体40被膜30分成第一孔部分和第二孔部分，该第一孔部分由第一腔体部分41构成并且起到物质接收部分的作用，该第二孔部分由第二腔体部分42构成并且被配置为充当从腔体的第二开口端21插入其中时立柱51可通过其阻挡从底部开口端进入膜的通道，如图2B所示。
膜30为由多孔材料制成的片材的形式，该多孔材料相对于蛋白质，诸如相对于在物质接收部分41中设置在其上的流体不含吸收特性，以便在通过底部开口端/下开口21向其施加真空时穿过膜。膜材料是对上述物质惰性的疏水性材料。膜具有在10至40μm范围内，更特别地在20至30μm范围内，并且还更特别地约25μm大小的孔隙。
每个物质接收部分41具有足以将该方法的每个步骤所需的预定量的物质通过顶部开口端/上开口11接收在其中的尺寸。
每个立柱51具有轴向延伸部，该轴向延伸部至少不小于第二腔体部分42的轴向延伸部，并且具有凸缘53，凸缘53至少在其接近膜30的位置处具有的形状和尺寸对应于孔的第二部分的形状和尺寸。
阻挡底座50被配置成从第一位置和第二位置移动立柱51，在该第一位置中立柱51的凸缘53在远离膜30的方向上与底部开口端21间隔开，以便允许穿过膜30在第一孔部41和第二孔部分42之间的流体连通，在该第二位置中每个凸缘53靠近或接触每个孔内的膜30的下表面31b的对应区域32设置，并且如果从孔的底部开口端21的方向看，完全覆盖对应区域32以便防止上述流体连通的可能性。
包括第一孔部分41的壁的上板10、包括第二孔部分42的壁的下板20、以及包括立柱51的阻挡底座50，由耐碱性物质例如NaOH的材料制成。此类材料的一个示例是不锈钢，并且更特别地ST-303。每个所列出的元件可由多于一种材料制成。例如，阻挡立柱51可由材料制成或具有涂层，阻挡立柱51具有比制成阻挡板52的材料更高的疏水性特性和更低的摩擦系数。具体地，阻挡板52可由不锈钢制成，诸如ST-303，并且阻挡立柱51可由聚四氟乙烯制成。
如在描述的示例中，阻挡板52和立柱51都可生产为单一主体。另选地，这些元件可单独生产并且组装以形成阻挡底座50。该板可被构造成能够相对于该系统的其余部分固定不动或仅水平地移动，与下板20永久性地间隔开，并且可具有用于在上述两个位置之间轴向移动立柱51的机构(未示出)。
系统1被配置成安装在真空歧管(未示出)上，使得底部开口端21暴露以用于通过其向孔施加真空。
系统1可还包括用于密封膜30和上板10或下板20中的至少一个之间的孔区域的密封布置(在图2A和图2B中未示出)。
针对该系统的上述结构，它构成多孔阵列，其中每个孔起到单个试管的作用，该单个试管具有在试管外部的其第一位置和试管内部的第二位置之间可移动的专用阻挡立柱51。
上述系统可用于使用含有蛋白水解酶的溶液，从含纤维蛋白原的样品原位制备测试样品的方法，该蛋白水解酶能够在其与纤维蛋白原(例如凝血酶)反应时形成纤维蛋白，该方法如下：
(a)将预定量的含凝血酶溶液和预定量的含纤维蛋白原的样品设置在每个孔的物质接收部分41中，以在膜30上获得它们的混合物，并且任选地将该系统放在孵育器(未示出)中以促进形成纤维蛋白凝块形式的混合物，其中与每个孔关联的阻挡立柱51在其第一位置(图2A)中，即在试管外部；
(b)将系统1安装在真空歧管(未示出)上，其中底部开口端21面向真空歧管；
(c)在物质接收部分41中用预定量的液体诸如盐水洗涤凝块；
(d)通过操作真空歧管以向底部开口端21的膜30施加真空，由此通过底部开口端21使“非可凝固”蛋白穿过膜30从物质接收部分41抽吸出来而除去液体连同“非可凝固”蛋白；
(e)任选地，将步骤(c)和(d)重复多次；
(f)将系统1从真空歧管中移除；
(g)移动阻挡底座50，使立柱51在其第二位置(图2B)中，即在试管内部；以及
(h)将预定量的溶解溶液诸如包含碱性物质和/或离液剂的碱溶液设置在每个孔的物质接收部分41中以促进凝块的溶解，从而由此产生测试样品。
在一些实施方案中，步骤(a)至(h)在原位或在相同的物质接收部分、腔体部分和/或孔中进行。
在上述方法中，用于每个孔中的物质的量是使得在上述步骤(a)中产生的纤维蛋白凝块具有此类尺寸：使得其与在物质接收部分41的底部处构成的膜30接触的区域小于膜表面的区域，使得凝块仅占据膜表面区域的一部分，即不完全覆盖膜的表面，这由于膜的疏水性质是可能的。
图3示出了根据本发明所公开的主题的另一个实施方案的系统2，就涉及其上板10、下板20、膜30和阻挡底座50的结构，系统2类似于系统1，但还包括密封布置60。在图3中，上板10的下表面被指定为12，下板20的上表面被指定为22，并且密封布置为上密封构件和下密封构件的形式，该上密封构件和下密封构件分别被指定为60a和60b。
每个这些密封构件60a、60b具有对应于相应的上板下表面12或下板上表面22的形状和尺寸的片材形式，并且因此在膜30的面向上板下表面12的侧面处安装在上板下表面12和膜30之间，或在膜30的面向下板上表面22的侧面处安装在下板上表面22和膜30之间。
上密封构件60a具有多个上密封开口65a，多个上密封开口65a的形状和尺寸对应于第一孔部分41的横截面形状和尺寸。因此，当上密封构件60a被夹在上板10和膜30之间时，其中上密封构件60a的开口65a与第一孔部分41同轴对准，在第一孔部分周围形成密封，例如防止从第一孔部分朝向膜穿过的流体到达除了区域31以外的膜区域。
下密封构件60b具有多个下密封开口65b，多个下密封开口65b的形状和尺寸对应于第二孔部分42的横截面形状和尺寸。因此，当下密封构件60b被夹在下板20和膜30之间时，其中下密封构件60b的开口65b与第二孔部分42同轴对准，在第二孔部分周围形成密封，例如防止从膜区域32朝向第二孔部分42穿过的流体到达除了区域32以外的膜区域。
上密封构件和下密封构件可由诸如硅的材料制成，从而允许其清洁/洗涤。
一般来说，上密封构件60a和下密封构件60b可永久性地或可拆卸地附接至相应的上板10和下板20，并且它们都可具有相应的定位公母部分，这些定位公母部分相互接合可确保密封构件以及上板和下板所需的相互部署。具体地，在图3中所示的实施方案中，上密封构件60a和下密封构件60b具有多个销钉68a和68b，多个销钉68a和68b沿上密封构件60a和下密封构件60b的相对边缘设置并且被配置成对应地紧固接收在上板12和下板22中的对应销孔18(未示出)和28中。
系统2可包括第一固定布置和第二固定布置，该第一固定布置被配置成将上板10和下板20与在它们之间的上密封构件60a和下密封构件60b以及膜30固定在一起，从而由此形成开放式组件(不包括阻挡板50，在这种情况下，阻挡板50在其第一位置中)，该第二固定布置被配置成固定至开放式组件，当在第二位置中时阻挡板50处于其相对位置处，设置在其对应于上板和下板拐角的区域之间。
更具体地，上板和下板可具有参与固定的多个拐角，在这种情况下，第一布置可被配置成在板固定在一起时在这些拐角处向上板和下板施加相等的力。
图4A示出了根据本发明所公开的主题的另一个实施方案的系统3，就涉及其上板10、下板20、膜30、阻挡底座50和密封布置60的结构，系统3类似于系统2，但它还包括第一固定布置和第二固定布置，该第一固定布置在这种情况下为在图4B至4D中更详细示出的四个完全相同的锁定机构70的形式，该第二固定布置在这种情况下为图4E至4G中更详细示出的两个锁定机构80的形式。
参考图4B至4D，第一固定布置的每个锁定机构70包括锁71'和锁接合部分71"，锁71'至少在下板20的一个拐角处附接至下板20，锁接合部分71"形成在上板10的对应拐角处。锁71'包括：
-环首螺栓形式的对准构件73，对准构件73具有上端75、下端76和在它们之间的细长螺栓主体77，其中下端76铰接至下板20，使得环首螺栓可能在以实线示出的第一水平位置(相对于板)和以虚线示出的第二竖直位置(相对于板)之间以箭头B的方向转动，如图4B中所示；以及
-偏心凸轮杆形式的夹紧构件74，夹紧构件74安装至环首螺栓73的上端75，具有在第一位置和第二位置之间以箭头C的方向转动的可能性，在该第一位置中夹紧构件74与对准构件对准，在该第二位置中夹紧构件74相对于对准构件横向取向，如图4C中所示。
上板10的锁接合部分71"为凹部形式，该凹部被配置为将螺栓主体接收在其中。
在操作中，首先对准上板10和下板20与在它们之间的膜30以及密封构件60a和60b，之后将它们彼此固定；然后，使环首螺栓73从其水平位置转动至其竖直位置，使得螺栓主体77被接收在锁接合部分71"内，并且将在其对准位置中的偏心凸轮杆74设置在上板上方，如图4C中所示；最后，偏心凸轮杆74被转动到其横向位置，如图4D中所示，从而在上板10上施加压力。一旦这种情况发生在所有四个锁定机构70中，上板和下板彼此牢固地夹紧，从而形成组件100(图4A、图4D)。
参考图4E至4G，第二固定布置的锁定机构80具有与锁定机构70相同的结构并且以与锁定机构70相同的方式进行操作，其中主要差别在于它们的位置。具体地，锁定机构80的锁81'在阻挡板50的相对边缘中间附接至阻挡板50，并且锁接合部分81"形成在锁接合部分71"之间的上板10的对应位置处，如图4E中所示。在一些实施方案中，“锁接合部分”是上板中的突出部。
在操作中，首先对准组件100和阻挡构件50，之后将它们彼此固定；然后，使环首螺栓83从其水平位置转动至其竖直位置，使得螺栓主体87被接收在锁接合部分81"内，并且将在其对准位置中的偏心凸轮杆84设置在上板上方，如图4F中所示；最后，偏心凸轮杆84被转动到其横向位置，如图4G中所示，从而在上板10上施加压力。一旦这种情况发生在两个锁定机构80中，组件100和阻挡板彼此牢固地夹紧，从而形成系统3(图4G)。
从上面的描述中可清楚地看到，锁定机构71的细长螺栓主体77的长度应当对应上板10、在其中的膜和密封构件的总厚度，并且锁定机构81的细长螺栓主体87的长度应当对应于组件100的总厚度。
上述任何系统1至3可在它们的制造地点组装，或者可作为套件来生产，其中系统的全部或至少一部分的部件有待在使用者的地点处组装。
已进行实验，用于将使用以下描述的根据本发明所述主题的装置和原位方法获得的定量含纤维蛋白原的溶液中的可凝固纤维蛋白原浓度的结果与使用由已知制备方法(实验1)制备或具有已知值(实验2)的含纤维蛋白原溶液获得的这些结果进行比较。
实验1
本实验的目的是检验根据本发明所公开的主题的装置和原位方法测量含纤维蛋白原的样品(样品1和2，参见下文)中的纤维蛋白原含量的能力。为此目的，将测试样品中获得的可凝固纤维蛋白原浓度与使用已知的经验证的重力测定方法获得的结果进行比较。
为了在测定中计算样品1和2中的可凝固纤维蛋白原浓度，用纤维蛋白原标准样品(具有64mg/ml的可凝固纤维蛋白原浓度)在装置中并排测试样品。
测试样品(含纤维蛋白原的溶液)
样品1包含29.8mg/ml的可凝固纤维蛋白原；
样品2包含70.1mg/ml的可凝固纤维蛋白原。
已知的评估方法(已知的经验证的重力测定方法)
用于评估两个样品中可凝固纤维蛋白原浓度的已知方法是根据欧洲药典7.0(还参见：Gaffney P.J.和Wong M.Y.Collaborative study of a proposed InternationalStandard for plasma Fibrinogen measurement.Thrombosis and Heamostasis,68(4),第428-432页,1992)的经验证的重力测定方法。
测试的技术和方法
下文是用于实验中的根据本发明所公开的主题的装置的描述。
该装置具有由不锈钢(st-303)制成的矩形上板和矩形下板，每个板具有35个开孔。每个板具有1.5cm的高度、12.6cm的长度和8.5cm的宽度。每个孔具有1.5cm的深度、0.9cm的直径和0.64cm2的面积。该装置包括两个硅密封构件，该两个硅密封构件各自具有在长度和在宽度上对应于两个板的0.2cm厚度，并且具有在形状和尺寸上对应于板中的孔的孔洞。使用由聚丙烯制成的疏水性膜片，该疏水性膜片具有25μm的孔隙大小(Merck，货号PP2514250)。该装置还包括由不锈钢(st-303)制成的四个凸轮杆锁，该四个凸轮杆锁位于下板的每个拐角上以用于将上板和下板、膜片和两个密封构件保持在一起，从而形成有待在原位方法过程中使用的具有开放式孔的组件。
上述元件根据以下顺序自下而上进行组装：下板、第一硅密封构件、膜、第二硅密封构件、上板，在此之后通过凸轮杆锁将这些元件彼此固定(下文：“组件I”)。
该装置还包括具有35个阻挡立柱的由不锈钢(st-303)制成的矩形阻挡底座，底座具有13cm的长度和9cm的宽度，并且每个立柱具有2.9cm的高度，其中上表面具有约0.8cm的直径并且在形状上对应于孔开口。阻挡底座具有由不锈钢(st-303)制成的两个凸轮杆锁并且位于底座的短侧面的中间。锁被配置成将组件I与阻挡底座保持在一起，从而将立柱定位靠近膜。以这样的方式将组件I安装在阻挡底座上，使得阻挡立柱防止穿过膜的流体渗漏的可能性。
真空歧管(Merck Millipore，货号MAVM0960R)被用于向装置施加真空。它具有5.5cm的高度、14.5cm的长度、10cm的宽度。
根据以下步骤进行测试：
1-通过将50μl溶液A和60μl溶液B混合在膜片上而在组件I的孔内形成凝块(参见下表1中的溶液A和溶液B的组成)。
表1：溶液A和溶液B的制备。
Figure BDA0001893059350000231
*基于纤维蛋白原标准样品，用盐水将样品稀释在可接受光密度内。将纤维蛋白原标准品稀释作为样品2，450μl盐水和50μl纤维蛋白原标准品。
2-为了允许凝块形成，在室温(约20-25℃)下孵育混合物20分钟。凝块覆盖约0.35-0.49cm2的膜表面(约55％-77％的孔区域)。
3-在凝块形成之后，将组件I安装在真空歧管上，并且洗涤凝块6次以除去非可凝固蛋白。每次将900μl盐水加入每个孔，然后在约900毫巴的压力差(Δp)下向装置施加真空，从而使洗涤溶液穿过膜。
4-将组件I从真空歧管中移除并且安装在阻挡底座上，并且由两个凸轮杆锁固定，从而将立柱放置靠近膜并且防止穿过膜的流体渗漏的可能性。
5-将1ml凝块溶解溶液[7M尿素、0.2M NaOH的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液]加入每个孔。
6-在室温下孵育1小时后。在本实验中，原位(在相同的孔中)进行步骤1-6。
7-在孵育后，从每个孔中收集100μl并且转移到微量离心管中，并且用900μl H2O以1:10稀释。
8-将样品转移至比色皿，以用于定量可凝固纤维蛋白原浓度。光学密度(O.D.)的测量通过分光光度计在280nm和320nm处进行。为了测量用于可凝固纤维蛋白原计算的最终光密度，将320nm处的光密度测量值从280nm处的光密度测量值中扣除，并且基于经扣除的光密度和受到上述步骤的已知光密度的纤维蛋白原标准样品，计算精确的可凝固纤维蛋白原浓度。样品的稀释被考虑在计算中。
示例测试的结果示于下表2中。
表2：样品1和2中的可凝固纤维蛋白原浓度。
Figure BDA0001893059350000241
可看出使用根据本发明所公开的主题的装置和原位方法所获得的样品1和2的平均结果实质上与通过耗时的、替代的、经验证的方法(其中用于样品制备的所有步骤不在相同的孔中进行)所获得的结果相同。
这些结果证明了原位方法的高准确度和本发明所公开的主题的原位方法和装置用于定量含纤维蛋白原溶液中的可凝固纤维蛋白原浓度的适用性。
不同平行测定之间的RSD(3.5％-4％)证明了测试的良好精度。
实验2
根据本发明所公开的主题的原位方法测量样品中可凝固纤维蛋白原浓度的精度通过测试纤维蛋白原浓缩物国际标准品的可凝固纤维蛋白原浓度来证实，所述纤维蛋白原浓缩物国际标准品具有10.9mg/ml的已知认证值(购自NIBSC，编码02/242)(下文：“样品3”)。
测试的技术和方法
使用与上述实验1中的那些完全相同的装置和原位方法来执行测试。针对样品1进行凝块制备(参见表1)。
使用上述的装置和原位方法所获得的可凝固纤维蛋白原浓度示于下表3中。
表3：纤维蛋白原浓缩物国际标准品的可凝固纤维蛋白原结果。
Figure BDA0001893059350000251
这些结果确认了根据本发明所公开的主题的方法是准确的和精确的，并且该装置可用于准确测量可凝固纤维蛋白原浓度。

Claims (58)

1.一种用于执行原位制备样品的装置，所述制备包括多个步骤并且涉及至少两种物质，所述装置包括：
-物质接收部分(41)，所述物质接收部分(41)具有顶部和底部并且具有足以将每个所述步骤所需的预定量的材料通过所述顶部接收在其中的尺寸；
-膜(30)，所述膜(30)具有上表面(31a)和下表面(31b)，所述上表面(31a)构成所述物质接收部分(41)的所述底部并且面向所述物质接收部分的内部，所述下表面(31b)面向所述物质接收部分的外部，并且所述膜(30)具有这样的结构以便仅在向其底部施加真空时至少在一个所述步骤中允许设置在所述物质接收部分中的流体从其中朝向所述物质接收部分的所述外部转移穿过所述膜；以及
-至少一个阻挡构件(51)，所述构件被配置成采取一种位置，在该位置中所述构件靠近所述膜的所述下表面设置并且覆盖它，以便防止穿过所述膜在所述物质接收部分和所述物质接收部分的所述外部之间流体连通的可能性，并且所述构件被配置成采取另一种位置，该位置与所述膜间隔开，以便在向所述物质接收部分的所述底部施加真空时允许所述流体连通。
2.根据权利要求1所述的装置，还包括细长腔体(40)，所述细长腔体(40)具有上开口和下开口(11,21)、由所述物质接收部分(41)构成的第一腔体部分以及在所述膜(30)和所述腔体的所述下开口(21)之间延伸的第二腔体部分，并且其中所述阻挡构件(51)能够从所述装置的下开口端插入到所述第二腔体部分中。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述装置的围绕所述物质接收部分、所述膜和所述阻挡构件的至少一部分耐受碱性物质。
4.根据权利要求3所述的装置，其中所述碱性物质是NaOH。
5.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述膜由如下材料制成，该材料至少在使用前至少相对于所述物质不含吸收特性；该材料为多孔疏水性材料且/或对至少所述物质是惰性的。
6.根据权利要求5所述的装置，其中所述材料具有在10至40μm的范围内大小的孔隙。
7.根据权利要求5所述的装置，其中所述材料具有在20至30μm的范围内大小的孔隙。
8.根据权利要求5所述的装置，其中所述材料具有约25μm大小的孔隙。
9.根据权利要求1或2所述的装置，其中所述装置被配置成在所述阻挡构件(51)与所述膜(30)间隔开时安装在真空歧管上，以便允许向所述膜的所述下表面(31b)施加真空。
10.根据权利要求2所述的装置，其中所述阻挡构件具有沿轴线(X)的延伸部，该延伸部至少不小于沿此轴线的所述第二腔体部分的延伸部。
11.根据权利要求2所述的装置，包括构成孔的阵列的多个所述物质接收部分以及对应的多个阻挡构件，所述多个阻挡构件各自被配置成相对于所对应的物质接收部分采取位置。
12.根据权利要求11所述的装置，构成系统(3)的一部分，所述系统(3)包括：
-上板(10)，所述上板(10)具有上表面(15)、下表面(12)和在它们之间延伸的多个第一孔部分，所述多个第一孔部分各自具有在所述上表面处的顶部开口端和在所述下表面处的底部开口端，每个第一孔部分构成所述物质接收部分(41)；以及
-膜片，所述膜片被配置为在所述上板(10)的下表面(12)处与所述上板(10)组装，使得最靠近每个第一孔部分的所述下开口端并且在形状和尺寸上与其对应的所述膜的区域构成所述第一孔部分的底部。
13.根据权利要求12所述的装置，其中所述系统还包括用于在所述膜的所述区域(32)和所对应的所述第一孔部分的下开口端周围形成密封的密封布置(60)，并且其中所述密封布置(60)为由硅制成的上密封片(60a)的形式，所述上密封片(60a)具有在形状和尺寸上对应于所述第一孔部分的所述底部开口端的多个上密封开口(65a)，所述上密封片被配置成安装在所述上板(10)和所述膜(30)之间，其中所述上密封片的开口与所述第一孔部分同轴对准。
14.根据权利要求13所述的装置，其中所述系统还包括下板(20)，所述下板(20)具有上表面(22)、下表面(25)和在它们之间延伸的多个第二孔部分(42)，并且所述多个第二孔部分(42)具有的横截面形状和尺寸对应于所述第一孔部分的横截面形状和尺寸，每个第二孔部分具有在所述下板的所述上表面处的顶部开口端和在所述下板的所述下表面处的底部开口端；所述上板(10)和所述下板(20)被配置成彼此固定，其中所述膜(30)夹在它们之间，使得每对对应的第一孔部分和第二孔部分(42)同轴对准以形成一个孔并且由所述膜的所述区域(32)隔开。
15.根据权利要求14所述的装置，其中所述系统还包括在所述膜的所述区域和所述第二孔部分的所述顶部开口端周围形成密封的密封布置，并且其中所述密封布置为由硅制成的下密封片(60b)的形式，所述下密封片(60b)具有在形状和尺寸上对应于所述第二孔部分的所述顶部开口端的多个下密封开口(65b)，所述密封片被配置成安装在所述下板(20)和所述膜(30)之间，其中所述密封片的开口与所述第二孔部分(42)同轴对准。
16.根据权利要求15所述的装置，其中所述上板和所述下板中的一个包括锁(70)，所述锁(70)用于将所述上板和所述下板、所述膜以及所述上密封片和所述下密封片牢固地保持在一起，从而由此形成具有开放式孔的组件(100)。
17.根据权利要求14所述的装置，其中所述系统还包括具有所述阻挡构件(51)的阻挡底座(50)，所述阻挡构件(51)各自具有在形状和尺寸上对应于所述膜的所述区域(32)的阻挡凸缘(53)。
18.根据权利要求17所述的装置，其中所述阻挡构件为从所述阻挡底座的上表面突出的多个立柱的形式，阻挡表面由所述立柱的顶部表面构成。
19.根据权利要求17所述的装置，其中所述系统包括在所述阻挡构件(51)靠近所述膜(30)时相对于所述上板(10)和所述下板(20)将所述阻挡底座(50)牢固地保持在固定关系中的锁(80)。
20.根据权利要求16所述的装置，其中所述组件(100)被配置成在所述阻挡构件(51)与所述膜间隔开时安装在真空歧管上，使得所述第二孔部分的所述底部开口端暴露以用于向其施加真空。
21.一种用于检测可凝固纤维蛋白原的存在和/或定量可凝固纤维蛋白原的样品制备的原位方法，所述方法包括多个步骤并且涉及至少两种物质，所述至少两种物质中的一种包括纤维蛋白原，并且另一种包括蛋白水解酶，所述蛋白水解酶能够在其与纤维蛋白原反应时形成纤维蛋白，所述步骤至少如下：
(a)提供根据权利要求1至20中任一项所述的装置；
(b)通过在所述物质接收部分中将所述至少两种物质混合在所述膜上来形成凝块；
(c)在所述物质接收部分中用液体洗涤所述凝块；
(d)通过在所述阻挡构件(51)与所述膜(30)间隔开时在所述物质接收部分的所述底部处施加真空和/或向腔体的下开口(21)施加真空，由此使所述液体通过所述下开口穿过所述膜从所述物质接收部分(41)抽吸出来而除去所述液体；
(e)将步骤(c)和(d)重复多次；
(f)将所述阻挡构件(51)带到靠近所述膜的所述位置；以及
(g)用合适的水性溶液溶解所述物质接收部分中的所述凝块。
22.根据权利要求21所述的原位方法，其中所述水性溶液包含碱性物质和/或离液剂。
23.根据权利要求21或22所述的原位方法，其中步骤(d)中的所述施加真空通过在所述阻挡构件(51)远离所述膜时将所述装置安装在真空歧管上，使得第二孔部分的底部开口端暴露以用于向其施加真空来执行。
24.一种用于执行原位制备样品的装置，所述制备包括多个步骤并且涉及至少两种物质，所述装置包括：
-至少一个细长腔体(40)，所述腔体具有沿所述装置的纵向轴线(X)间隔开的上开口和下开口(11,21)；所述腔体具有物质接收部分(41)，所述物质接收部分(41)在所述物质接收部分的顶部开口端和底部之间延伸，并且具有足以将每个所述步骤所需的预定量的材料通过所述上开口接收在其中的尺寸；以及
-膜(30)，所述膜(30)构成所述物质接收部分的所述底部，并且具有这样的结构以便仅在通过所述下开口向其施加真空时至少在一个所述步骤中允许设置在所述物质接收部分中的流体从其中朝向所述腔体的所述下开口(21)转移穿过所述膜；
其中所述膜由疏水性材料制成，所述疏水性材料至少相对于所述物质不含吸收特性，从而允许在所述物质接收部分中通过混合所述物质，并且在所述物质接收部分中孵育混合的所述物质而在其上形成的凝块仅部分地覆盖所述膜。
25.根据权利要求24所述的装置，其中所述凝块仅在膜区域的50％-80％的范围内覆盖所述膜。
26.根据权利要求24所述的装置，其中所述细长腔体(40)包括由所述物质接收部分(41)构成的第一腔体部分以及在所述膜(30)和所述腔体的所述下开口(21)之间延伸的第二腔体部分。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的装置，其中所述装置的围绕所述细长腔体和所述膜的至少一部分耐受碱性物质。
28.根据权利要求27所述的装置，其中所述碱性物质是NaOH。
29.根据权利要求24至26中任一项所述的装置，其中所述疏水性材料是多孔的且/或对至少所述物质是惰性的。
30.根据权利要求24至26中任一项所述的装置，其中所述疏水性材料具有在10至40μm的范围内大小的孔隙。
31.根据权利要求24至26中任一项所述的装置，其中所述疏水性材料具有在20至30μm的范围内大小的孔隙。
32.根据权利要求24至26中任一项所述的装置，其中所述疏水性材料具有约25μm大小的孔隙。
33.根据权利要求24至26中任一项所述的装置，其中所述装置被配置成安装在真空歧管上，以便允许向所述膜的下表面(31b)施加真空。
34.根据权利要求24至26中任一项所述的装置，包括构成孔阵列的多个所述细长腔体。
35.根据权利要求34所述的装置，构成系统(3)的一部分，所述系统(3)包括：
-上板(10)，所述上板(10)具有上表面(15)、下表面(12)和在它们之间延伸的多个第一孔部分，所述多个第一孔部分各自具有在所述上表面处的顶部开口端和在所述下表面处的底部开口端，每个第一孔部分构成所述物质接收部分(41)；以及
-片形式的膜(30)，所述膜(30)被配置为在所述上板(10)的下表面(12)处与所述上板(10)组装，使得最靠近每个第一孔部分的所述底部开口端并且在形状和尺寸上与其对应的所述膜的区域构成所述第一孔部分的底部。
36.根据权利要求35所述的装置，其中所述系统还包括用于在所述膜的所述区域(32)和所对应的所述第一孔部分的底部开口端周围形成密封的密封布置(60)，并且其中所述密封布置(60)为由硅制成的上密封片(60a)的形式，所述上密封片(60a)具有在形状和尺寸上对应于所述第一孔部分的所述底部开口端的多个上密封开口(65a)，所述上密封片被配置成安装在所述上板(10)和所述膜(30)之间，其中所述上密封片的开口与所述第一孔部分同轴对准。
37.根据权利要求36所述的装置，其中所述系统还包括下板(20)，所述下板(20)具有上表面(22)、下表面和在它们之间延伸的多个第二孔部分(42)，并且所述多个第二孔部分(42)具有的横截面形状和尺寸对应于所述第一孔部分的横截面形状和尺寸，每个第二孔部分具有在所述下板的所述上表面处的顶部开口端和在所述下板的所述下表面处的底部开口端；所述上板(10)和所述下板(20)被配置成彼此固定，其中所述膜(30)夹在它们之间，使得每对对应的第一孔部分和第二孔部分(42)同轴对准以形成一个孔并且由所述膜的所述区域(32)隔开。
38.根据权利要求37所述的装置，其中所述系统还包括在所述膜的所述区域和所述第二孔部分的所述上开口端周围形成密封的密封布置，并且其中所述密封布置为由硅制成的下密封片(60b)的形式，所述下密封片(60b)具有在形状和尺寸上对应于所述第二孔部分的所述顶部开口端的多个下密封开口(65b)，所述密封片被配置成安装在所述下板(20)和所述膜(30)之间，其中所述密封片的开口与所述第二孔部分(42)同轴对准。
39.根据权利要求38所述的装置，其中所述上板和所述下板中的一个包括锁(70)，所述锁(70)用于将所述上板和所述下板、所述膜以及所述上密封片和所述下密封片牢固地保持在一起，从而由此形成具有开放式孔的组件(100)。
40.根据权利要求39所述的装置，其中所述组件(100)被配置成安装在真空歧管上，使得所述第二孔部分的所述底部开口端暴露以用于向其施加真空。
41.一种用于检测可凝固纤维蛋白原的存在和/或定量可凝固纤维蛋白原的样品制备的原位方法，所述方法包括多个步骤并且涉及至少两种物质，所述至少两种物质中的一种包括纤维蛋白原，并且另一种包括蛋白水解酶，所述蛋白水解酶能够在其与纤维蛋白原反应时形成纤维蛋白，所述步骤至少如下：
(a)提供根据权利要求24至40中任一项所述的装置；
(b)通过在所述物质接收部分中将所述至少两种物质混合在所述膜上来形成凝块，其中由于所述膜的疏水性质，所述凝块仅部分地覆盖所述膜；
(c)在所述物质接收部分中用液体洗涤所述凝块；
(d)通过在所述腔体的所述下开口处施加真空且由此使液体从所述物质接收部分抽吸出来而除去所述液体；
(e)将步骤(c)和(d)重复多次；
(f)防止穿过所述膜在所述物质接收部分(41)和所述下开口(21)之间的流体连通；以及
(g)用合适的水性溶液溶解所述物质接收部分中的所述凝块。
42.根据权利要求41所述的原位方法，其中所述凝块仅在膜区域的50％-80％范围内覆盖所述膜。
43.根据权利要求41所述的原位方法，其中所述物质的量使得所形成的凝块具有如下尺寸，该尺寸小于构成所述物质接收部分的所述底部的所述膜的尺寸，使得所述凝块不会完全覆盖所述膜的表面。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的原位方法，其中所述水性溶液包含碱性物质和/或离液剂。
45.根据权利要求41至43中任一项所述的原位方法，其中步骤(d)中的所述施加真空通过将所述装置安装在真空歧管上，使得第二孔部分的底部开口端暴露以用于向其施加真空来执行。
46.一种用于组装包括孔的阵列的系统(1)的套件，所述孔各自具有在顶部孔开口端和底部孔开口端之间延伸的细长腔体的形式，所述套件包括：
-上板(10)，所述上板(10)具有上表面(15)、下表面(12)和在它们之间延伸的多个第一孔部分，每个第一孔部分具有在所述上表面处的顶部开口端和在所述下表面处的底部开口端；以及
-下板，所述下板具有上表面(22)、下表面(25)和在它们之间延伸的多个第二孔部分(42)，并且所述多个第二孔部分(42)具有的横截面形状和尺寸对应于所述第一孔部分的横截面形状和尺寸，每个第二孔部分具有在所述下板的所述上表面处的顶部开口端和在所述下板的所述下表面处的底部开口端；
其中所述上板(10)和所述下板(20)被配置成与膜片一起使用，当所述板彼此固定时，所述膜片夹在它们之间，使得所述第一孔部分和所述第二孔部分(41,42)同轴对准以形成所述孔并且由所述膜(30)隔开，每个第一孔部分的顶端构成第一孔开口端，并且每个第二孔部分的底端构成第二孔开口端。
47.根据权利要求46所述的套件，所述套件还包括所述膜片。
48.根据权利要求46或47所述的套件，还包括由硅制成的上密封片(60a)，所述上密封片(60a)形成为具有对应于所述第一孔部分的所述横截面形状和尺寸的形状和尺寸的多个上密封开口(65a)，其中当组装所述系统时，所述上密封开口与所述第一孔部分同轴对准，所述上密封片为下列中的一种：
-永久性地附接至所述上板的所述下表面并且构成其整体部分；
-在所述膜的一侧上永久性地附接至所述膜并且构成所述膜的整体部分；或者
-在组装所述系统时被配置成安装在所述上板和所述膜之间。
49.根据权利要求48所述的套件，还包括由硅制成的下密封片(60b)，所述下密封片(60b)形成为具有对应于所述第二孔部分(42)的所述横截面形状和尺寸的形状和尺寸的多个下密封开口(65b)，其中当组装所述系统时，所述下密封开口与所述第二孔部分同轴对准，所述下密封片为下列中的一种：
-永久性地附接至所述下板的所述上表面并且构成其整体部分；
-在膜侧上永久性地附接至所述膜并且构成所述膜的整体部分，所述膜侧与所述上密封片附接的一侧相对；或者
-在组装所述系统时被配置成安装在所述下板和所述膜之间。
50.根据权利要求49所述的套件，其中所述上板(10)和所述下板(20)中的一个包括锁(70)，所述锁(70)用于将这些板、所述膜以及所述上密封片和所述下密封片锁定在一起，从而由此形成开放式组件(100)，所述上密封片和所述下密封片设置在所述膜和相应的上板和下板之间。
51.根据权利要求46或47所述的套件，还包括具有多个阻挡凸缘(53)的阻挡底座(50)，所述多个阻挡凸缘(53)各自在形状和尺寸上对应于所述膜的区域的形状和尺寸，所述阻挡底座被配置成采取一种位置，在该位置中每个阻挡表面靠近所述膜的对应区域设置并且如果从孔的底部开口端方向看，完全覆盖所述对应区域，以便防止穿过所述膜在所述第一孔部分和所述第二孔开口端之间流体连通的可能性，并且所述阻挡底座被配置成采取另一种位置，在该位置中所述阻挡表面与所述底部孔开口端在远离所述膜的方向上间隔开，以便允许所述流体连通。
52.根据权利要求51所述的套件，其中所述阻挡底座形成为具有从其上表面突出的多个立柱(51)，所述阻挡表面由所述立柱的所述顶部表面构成。
53.根据权利要求51所述的套件，其中所述阻挡底座包括在所述阻挡底座远离所述膜时将开放式组件(100)锁定到其上的锁(80)。
54.根据权利要求50所述的套件，其中所述开放式组件(100)被配置成安装在真空歧管上，使得所述底部孔开口端暴露以用于向所述孔施加真空。
55.根据权利要求46或47所述的套件，其中所述膜由疏水性材料制成并且/或者其中所述膜由不含吸收特性的材料制成。
56.一种用于定量含纤维蛋白原的样品中可凝固纤维蛋白原的方法，所述方法包括根据权利要求21至23或权利要求41至45中任一项所述的方法的步骤(a)至(g)，并且所述方法还包括：
(h)将预定部分的步骤(g)的溶解凝块转移至比色皿；
(i)使用分光光度计测量所述部分的蛋白质吸光度；以及
(j)确定所述样品中存在的所述可凝固纤维蛋白原，纤维蛋白原标准品含有已知量的可凝固纤维蛋白原。
57.根据权利要求56所述的方法，其中测量蛋白质吸光度的步骤通过测量在280nm波长处和在320nm波长处的光密度，并且从在280nm处获得的光密度减去在320nm处获得的光密度来执行。
58.一种用于执行原位制备样品的系统，所述系统包括：
-上板(10)，所述上板(10)具有上表面(15)、下表面(12)和在它们之间延伸的第一孔部分的阵列；
-下板(20)，所述下板(20)具有上表面(22)、下表面(25)和在它们之间延伸并且对应于所述第一孔部分的所述阵列的第二孔部分(42)的阵列；
-上密封片(60a)和下密封片(60b)，所述上密封片(60a)具有相应上密封开口(65a)的阵列，所述下密封片(60b)具有相应下密封开口(65b)的阵列，所述阵列各自对应于所述上板和所述下板(10,20)中的所述第一孔部分和所述第二孔部分(42)的所述阵列；
-膜片，所述膜片具有上表面(31a)和下表面(31b)，并且所述膜片具有这样的结构以便仅在向所述下表面(31b)施加真空时允许设置在其上表面(31a)处的流体朝向其下表面(31b)转移穿过所述膜(30)；
-在所述下板(20)中的锁(70)，所述锁(70)被配置成将所述上板和所述下板(10,20)、所述膜(30)、在所述上板和所述膜之间的所述上密封片以及在所述膜和所述下板之间的所述下密封片牢固地保持在一起，其中所有的阵列被对准以便形成具有孔的阵列的组件(100)，所述孔各自具有在所述上板的所述上表面处的顶部开口端、在所述下板的所述下表面处的底部开口端、在所述顶部开口端和所述膜的所述上表面(31a)之间延伸的所述第一孔部分、以及在所述膜的所述下表面和所述底部开口端之间延伸的所述第二孔部分(42)，其中当所述流体从所述第一孔部分转移穿过所述膜进入所述第二孔部分中时，所述膜的所述上表面和所述下表面在所述第一孔部分和所述第二孔部分周围被密封没有所述流体；
所述系统还包括：
-阻挡底座(50)，所述阻挡底座(50)具有从其上表面突出并且被配置为在从所述底部开口端插入所述第二孔部分(42)中时被接收在所述第二孔部分(42)中以防止设置在所述膜上表面处的流体转移穿过所述膜进入所述第二孔部分中的立柱(51)的阵列；
-阻挡底座(50)，所述阻挡底座(50)具有在所述立柱(51)被接收在所述第二孔部分(42)中时相对于所述组件(100)将所述阻挡底座(50)牢固地保持在固定关系中的多个锁(80)。
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