CN109312367A

CN109312367A - 用于药物递送的抗体融合蛋白

Info

Publication number: CN109312367A
Application number: CN201780034897.1A
Authority: CN
Inventors: 陈铭哲; 刘雅娟; 张博皓; 蔡亚萍; 陈君玮; 李佩宜
Original assignee: Esclibine Co Ltd
Current assignee: Esclibine Co Ltd
Priority date: 2016-06-06
Filing date: 2017-06-06
Publication date: 2019-02-05
Anticipated expiration: 2037-06-06
Also published as: CN109312367B; US11458208B2; EP3464602A4; TW201809013A; JP2019527238A; WO2017211278A1; EP3464602A1; JP7239987B2; US20190298848A1

Abstract

本发明涉及抗体融合蛋白。特定言之，本发明涉及用于胞内及核内药物递送的抗体融合蛋白。本发明的融合蛋白可用作肽穿透系统，其特异性地结合至各种目标以将效应肽递送穿过生物障壁。

Description

用于药物递送的抗体融合蛋白

技术领域

本发明涉及抗体融合蛋白。特定言之，本发明涉及用于胞内及核内药物递送的抗体融合蛋白。本发明的抗体融合蛋白具有双功能目标以结合胞外表面标记物及达成胞内目标调整。

背景技术

在靶向治疗选项中，抗体-药物结合物(ADC)作为最有前景的选项出现。ADC为单株抗体，其经设计成选择性地将强效细胞毒性药物递送至抗原表达细胞内。用于将药物连接至抗体的ADC的若干组分(包括抗体、连接子、细胞毒性药物有效负载及连接位点的选择)对ADC活性而言是至关重要的。用于制造ADC的细胞毒性药物(或有效负载)通常经由半胱胺酸或离胺酸残基结合至抗体。此产生每一抗体具有非均一数目的药物的ADC。每一抗体对应的药物的数目通常被称作药物与抗体的比率(DAR)，对于IgG1抗体而言，所述比率可在0与8个药物间变化。具有0个药物的抗体为无效的且与ADC竞争结合至抗原表达细胞。每一抗体具有8个药物的抗体具有降低的活体内稳定性，此可能促成非目标相关毒性(non-targetrelated toxicities)。即使具有均一化学计量的纯化ADC也将携带结合至多个位点的药物且因此为特有实体的复杂混合物。早期非同质ADC存在阻碍临床发展的稳定性、药物动力学及功效问题。尽管化学位点选择性抗体结合的最新进展(包括使用经工程改造的半胱胺酸残基、非天然氨基酸、及通过醣基转移酶及麸酰胺酸转移酶的酶结合)导致形成更同质的ADC，但是各方法间存在若干差别，包括对于抗体基因修饰、在结合中使用酶、及结合位点编号/位置的要求。

WO 2009/025846提供可激活结合多肽(ABP)，其含有目标结合部分(TBM)、遮蔽部分(MM)及可裂解部分(CM)，且表明ABP呈现可激活构形，以使得相比于在能够裂解CM的裂解剂存在下CM裂解之后，TBM中的至少一者更难以接近未裂解的目标。US 2016/0185875揭示一种能够选择性地在目标细胞或组织内激活以治疗其中的病症的铰链抗体。铰链抗体包括一个功能抗体、两个抑制结构域及四个可裂解连接子。然而，这两个专利公开案的有效负载无法达成满意效果，所以需要研发具有更高有效负载的药物递送系统。

发明内容

本发明使用包含抗体及一或多个细胞穿透效应肽(CPEP)的抗体融合蛋白，其同时靶向所关注的目标且递送肽有效负载以用于胞内及核内治疗。相比使用化学修饰策略，本发明的抗体融合蛋白不仅简化均一生产，而且不含任何作为有效负载的化学药物或用于结合的经修饰化学连接子。

本发明提供一种融合蛋白，其包含：(a)抗体或其抗原结合片段(Ab)，其能够靶向胞外表面标记物；及(b)融合至(a)的Ab或融合在(a)的Ab内部的一或多个细胞穿透效应肽(CPEP)，其中一个CPEP包含视情况存在的聚阴离子结构域(PAD)、一个或两个可裂解连接子(CL)、聚阳离子结构域(PCD)及效应肽(EP)，所述CPEP自N端至C端呈(EP-PCD-CL)、(PCD-EP-CL)、(EP-PCD-CL-PAD)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(CL-PCD-EP)、(CL-EP-PCD)、(PAD-CL-PCD-EP)或(CL-EP-PCD-CL-PAD)配置，此时CPEP融合至(a)的Ab的末端；或一个CPEP包含视情况存在的聚阴离子结构域(PAD)、两个可裂解连接子(CL)、聚阳离子结构域(PCD)及效应肽(EP)，所述CPEP自N端至C端呈(CL-PCD-EP-CL)、(CL-EP-PCD-CL)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(PAD-CL-EP-PCD-CL)、(CL-EP-PCD-CL-PAD)或(CL-PCD-EP-CL-PAD)配置，此时CPEP用其两个末端融合在Ab的内部。

在一个实施例中，一个CPEP包含视情况存在的聚阴离子结构域(PAD)、一个或两个可裂解连接子(CL)、聚阳离子结构域(PCD)及结合至胞内目标的效应肽(EP)；所述CPEP自N端至C端呈(EP-PCD-CL)、(PCD-EP-CL)、(EP-PCD-CL-PAD)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(CL-PCD-EP)、(CL-EP-PCD)、(PAD-CL-PCD-EP)或(CL-EP-PCD-CL-PAD)配置，此时CPEP融合至抗体或其抗原结合片段的末端。

在另一实施例中，一个CPEP包含视情况存在的聚阴离子结构域(PAD)、两个可裂解连接子(CL)、聚阳离子结构域(PCD)及结合至胞内目标的效应肽(EP)，所述CPEP自N端至C端呈(CL-PCD-EP-CL)、(CL-EP-PCD-CL)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(PAD-CL-EP-PCD-CL)、(CL-EP-PCD-CL-PAD)或(CL-PCD-EP-CL-PAD)配置，此时CPEP用其两个末端融合在抗体或其抗原结合片段的内部。亦即，CPEP以上述配置中的任一种配置整合至抗体或其抗原结合片段(Ab)内。在一个实施例中，CPEP融合在Ab的重链的内部。

在另一实施例中，CPEP融合至Ab的重链的末端或内部。

在例示性实施例中，本文的第[0053]段描述优选抗体。在一个实施例中，抗体包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链序列。在一些实施例中，抗体的抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')₂片段、单链片段、双功能抗体或线抗体。

在一些实施例中，一或多个CPEP融合至Ab的N端或C端，或融合在Ab内部。

PCD具有包含5至20个或其任何中间范围的连续碱性氨基酸的序列。在一个实施例中，聚阳离子肽选自由以下组成的群：聚离胺酸、聚精胺酸、聚鸟胺酸、聚组胺酸、及阳离子多醣或其混合物。在另一实施例中，聚阳离子肽为包含选自由以下组成的群的聚阳离子中的至少两者的组合物：离胺酸、精胺酸、聚离胺酸、聚精胺酸、聚鸟胺酸、聚组胺酸及阳离子多醣。在一优选实施例中，聚阳离子肽组合物由离胺酸及精胺酸组成。在另一实施例中，聚阳离子肽为均聚物或共聚物，或其混合物。

EP为结合至胞内目标的蛋白有效负载。EP的实施例描述于本文第[0060]段中。用于本发明的例示性融合蛋白中的优选EP及其序列列于本文第[0061]段中。

本发明的CPEP的可裂解连接子(CL)为包含复数个氨基酸残基的可裂解连接子。举例而言，CL可包括约4至约100个之间的氨基酸，或约6至约30个之间的氨基酸。CL可包括氨基酸残基，且可为约4至约30个之间，或约4至约10个之间的氨基酸残基的肽键。CL可通过细胞环境中所发现的条件裂解，诸如酸性条件，其可在癌细胞及癌组织或还原环境附近发现，如可于低氧或局部缺血细胞及组织附近发现；可通过在具有待治疗病症的细胞(诸如，患病、凋亡或坏死细胞及组织)的表面上发现或在细胞附近释放的蛋白酶或其他酶类裂解；或可通过其他条件或因子裂解。用于裂解CL的例示性酶类包括(但不限于)本文第[0069]段中所描述者。在一些实施例中，CL选自本文第[0070]段中所描述者。

CPEP可视情况包含视情况存在的聚阴离子结构域(PAD)。在一个实施例中，当CPEP具有聚阴离子结构域(PAD)时，CPEP为可激活性细胞穿透效应肽(ACPEP)。PAD为具有包含4至20个酸性氨基酸(优选5至9个酸性氨基酸)的序列的聚阴离子肽。PAD可有效形成自组装的聚阴离子-聚阳离子相互作用以防止ACPEP穿过细胞膜。在一些实施例中，PAD具有包含4至20个或其任何中间范围的连续酸性氨基酸的序列。

在一些实施例中，当CPEP融合至(a)的Ab的末端时，本发明的融合蛋白自N端至C端具有以下配置：(EP-PCD-CL)-Ab、(PCD-EP-CL)-Ab、(EP-PCD-CL-PAD)-Ab、(PAD-CL-PCD-EP-CL)-Ab、Ab-(CL-PCD-EP)、Ab-(CL-EP-PCD)、Ab-(PAD-CL-PCD-EP)或Ab-(CL-EP-PCD-CL-PAD)。

在一些其他实施例中，当CPEP用其两个末端融合在Ab内部时，本发明的融合蛋白自N端至C端具有以下配置：Ab^N-(CL-PCD-EP-CL)-Ab^C、Ab^N-(CL-EP-PCD-CL)-Ab^C、Ab^N-(PAD-CL-PCD-EP-CL)-Ab^C、Ab^N-(PAD-CL-EP-PCD-CL)-Ab^C、Ab^N-(CL-EP-PCD-CL-PAD)-Ab^C或Ab^N-(CL-PCD-EP-CL-PAD)-Ab^C，其中Ab^N为Ab的N端片段且Ab^C为Ab的C端片段。

本发明的融合蛋白具有双官能目标以结合胞外表面标记物及达成胞内目标调整。本发明的融合蛋白的效应肽可通过在特定条件存在下或在特定环境中裂解CL而进入目标细胞内。在优选实施例中，CL在生理条件下可裂解。此CL的裂解可通过特定病理性信号或与需要融合蛋白递送的细胞相关的特定环境来强化或实现。CL可由特异性的酶裂解，使得细胞摄取可靶向至特定位置，其中可得到这些条件。在CL裂解之后，融合蛋白的PCD-EP或EP-PCD部分自Ab释放。

在一些实施例中，本发明的融合蛋白包含具有选自SEQ ID NO.9、13、15、17、19、21或23的氨基酸序列的重链序列及具有选自SEQ ID NO.11的氨基酸序列的轻链序列。

本发明亦提供用于将效应肽递送至细胞内的组合物。在一个实施例中，组合物包含本发明的融合蛋白及药理学上适合的载剂。

本发明亦提供用于将效应肽递送至细胞内或细胞核内的方法，其包含向个体投与本发明的融合蛋白或包含本发明的融合蛋白的组合物。

图式简单说明

图1展示ASC生物药物的MoA(作用机制)的示意图。步骤1.抗体识别细胞表面标记物。步骤2.用微环境蛋白酶(例如MMP及ADAM等)裂解CPEP内部的可裂解连接子，且随后开启CPEP的细胞穿透功能。步骤3.由CPP/PCD携带的细胞毒性肽(自ASC生物药物切割下的肽)连同疾病治疗功能进入细胞质及/或核中。

图2A至C展示ASC生物药物的MoA研究。A中，流动式细胞测量术表明ASC生物药物可识别目标细胞。B及C，使用流动式细胞测量术及免疫萤光法，结果展示聚阳离子结构域3D4S9会被裂解且内化入人类乳房腺癌MCF7细胞中。

图3A及B展示3D4KLA降低人类乳房腺癌MCF7及人类非小细胞肺癌H1299细胞内的转化活性。用3D4KLA处理的人类乳房腺癌MCF7(A)及人类非小细胞肺癌H1299细胞(B)内的软琼脂群落形成活性降低。

图4A至F展示3D4S9会降低不同细胞株内的转化活性。用3D4S9处理的人类乳房腺癌MDA-MB-231(A)、人类乳房腺癌SKBR3(B)、人类乳房腺癌MCF7(C)、人类肺癌A549(D)、人类非小细胞肺癌H1299(E)及人类胰脏癌PANC-1细胞(F)内的软琼脂群落形成活性降低。

图5展示3D4rS9降低人类肺癌A549细胞内的转化活性。用3D4rS9处理的人类肺癌A549细胞内的软琼脂群落形成活性降低。

图6A及B展示3D4rS9-A降低人类乳房腺癌SKBR3及人类肺癌A549细胞内的转化活性。用3D4rS9-A处理的人类乳房腺癌SKBR3(A)及人类肺癌A549细胞(B)内的软琼脂群落形成活性降低。

图7展示3D4rS9-D降低人类肺癌A549细胞内的转化活性。用3D4rS9-D处理的人类肺癌A549细胞内的软琼脂群落形成活性降低。

图8展示3D4rS9-ΔD6降低人类乳房腺癌SKBR3细胞内的转化活性。用3D4rS9-ΔD6处理的人类乳房腺癌SKBR3细胞内的软琼脂群落形成活性降低。

图9展示3D4Fc-rS9降低人类肺癌A549细胞内的转化活性。用3D4Fc-rS9处理的人类肺癌A549细胞内的软琼脂群落形成活性降低。

图10A至C展示3D4S9减少使用人类胰脏癌PANC-1细胞的NOD/SCID小鼠内的异种移植肿瘤生长。3D4scr或3D4S9以30mg/kg的剂量一周两次腹膜内给药，持续3周。在处死小鼠之后，移除肿瘤且量测其质量。相比于3D4scr对照组内231(±150)mm3的肿瘤体积，携带用3D4S9治疗的人类PANC-1肿瘤异种移植物的小鼠在三周之后具有84(±40)mm3的肿瘤体积。3D4S9治疗减小异种移植肿瘤体积达60％(A)。相比于3D4scr对照组内0.66(±0.3)g的肿瘤重量，携带用3D4S9治疗的人类PANC-1肿瘤异种移植物的小鼠在三周之后具有0.13(±0.02)g的肿瘤重量。3D4S9治疗减小异种移植肿瘤重量达80％(B)。小鼠在处死之前称重。携带用3D4scr或3D4S9治疗的人类PANC-1肿瘤异种移植物的小鼠具有几乎相同的体重(C)。

具体实施方式

在以下描述中，使用许多术语且提供以下定义以有助于理解所主张的主题。在本文中未明确定义的术语是根据其普通及一般含义使用。

在多个实施例中，本文所述的抗体、结合片段及聚核苷酸通过其各别多肽或聚核苷酸序列描述。除非另外指示，否则多肽序列以N至C定向提供；聚核苷酸序列采取5'至3'定向。对于多肽序列而言，可使用基因编码氨基酸的公知的三字母或一字母缩写。

用于本发明中的肽的缩写如下：

Ab：抗体或其抗原结合片段；

CPEP：穿透效应肽；

PAD：聚阴离子结构域；

CL：可裂解连接子；

PCD：聚阳离子结构域；

EP：效应肽；

Ab^N：抗体或其抗原结合片段(Ab)的N端片段；及

Ab^C：抗体或其抗原结合片段(Ab)的C端片段。

除非另外规定，否则术语“一(a/an)”意指“一或多个”。

除非本文另外清楚指示，否则术语“或”在本文中用以意指术语“及/或”且可与术语“及/或”互换地使用。

在此申请案通篇中，术语“约”用于指示包括固有误差变化的值。

如本文所使用，术语“有效负载”是指EP。EP为结合至胞内目标的肽或蛋白有效负载。

如本文所使用，术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“聚核苷酸序列”及“聚核苷酸”可互换使用。其是指任何长度的核苷酸(去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合形式或其类似物。聚核苷酸可为单股或双股，且若为单股，则可为编码股或非编码(反义)股。聚核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及核苷酸类似物。

如本文所使用，术语“氨基酸”指示通式NH₂CHRCOOH的有机化合物，其中R可为任何有机基团。具体言之，术语氨基酸可指天然及非天然(人造)氨基酸，诸如Aib＝α-胺基异丁酸；tBuAla＝第三丁基丙胺酸；Thr-OBzl＝苏胺酸苯甲酯；5Ava＝5-胺基戊酸；Asp＝D＝天冬胺酸；Ala＝A＝丙胺酸；Arg＝R＝精胺酸；Asn＝N＝天冬酰胺；Gly＝G＝甘胺酸；Glu＝E＝麸胺酸；Gln＝Q＝麸酰胺酸；His＝H＝组胺酸；Ile＝I＝异白胺酸；Leu＝L＝白胺酸；Lys＝K＝离胺酸；M＝甲硫胺酸；Mamb＝(3-胺甲基)苯甲酸；Mamp＝Met＝(3-胺甲基)苯乙酸；Nle＝正白胺酸；Nva＝正缬胺酸；Phe＝F＝苯丙胺酸；Pro＝P＝脯胺酸；Ser＝S＝丝胺酸；Thr＝T＝苏胺酸；Trp＝W＝色胺酸；Tyr＝Y＝酪胺酸；及Val＝V＝缬胺酸。

如本文所使用，术语“穿透肽”是指任何促进物质移位穿过生物障壁的肽。生物障壁的实例包括(但不限于)紧密结合部及质膜。细胞穿透肽(CPP或PCD)能够穿透细胞膜且将不同货物(cargo)移位至细胞中。

如本文所使用，术语“多肽”及“蛋白”在本文中可互换使用，用于指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物及非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外指示，否则特定多肽序列亦隐含地涵盖其经保守修饰的变体。

如本文所使用，术语“抗体”是指完整抗体、单株抗体或多株抗体。术语“抗体”亦涵盖诸如双特异性抗体的多特异性抗体。人类抗体通常由两个轻链及两个重链组成，这些轻链及重链各自包含可变区及恒定区。轻链可变区包含侧接构架区的3个CDR，在本文中被标识为CDRL1或L1、CDRL2或L2及CDRL3或L3。重链可变区包含侧接构架区的3个CDR，在本文中被标识为CDRH1或H1、CDRH2或H2及CDRH3或H3。本发明的人类化抗体的CDR可使用Kabat及Chotia定义标识。

如本文所使用，术语“可激活”或“可切换”是指可激活的细胞穿透效应肽(ACPEP)在天然或未裂解状态(亦即，第一构形)下呈现未结合至目标的第一层级，及在裂解状态(亦即，第二构形)下呈现结合至目标的第二层级。

如本文所使用，如本文所用的术语“投与(administer/administering/toadminister)”是指给予或供应药物，包括活体内投与以及活体外直接向组织投与。

如本文所使用，术语“医药学上可接受”是指化合物及组合物适合向人类及/或动物投与而不会有与合理的效益/风险比相称的过度不良副作用，诸如毒性、刺激及/或过敏反应。

如本文所使用，术语“个体”及“患者”在本文中可互换使用且应理解为是指温血动物，尤其哺乳动物。此术语的范畴及含义内的动物的非限制性实例包括天竺鼠、狗、猫、大鼠、小鼠、马、山羊、牛、绵羊、动物园动物、非人类灵长类动物及人类。

如本文所使用，术语“有效量”是指当以本发明概念的方式使用时，足以呈现可侦测的治疗效果而不会有与合理的益处/风险比相称的过度不良副作用(诸如毒性、刺激及过敏反应)的融合蛋白或肽的量。

如本文所使用，术语“治疗有效量”是指足以呈现可侦测的治疗效果的融合蛋白或肽的量，当向哺乳动物或其他个体投与以治疗疾病时，所述量足以实现疾病的此种治疗。

如本文所用，术语“治疗(treatment/treating)”及其类似术语涵盖对哺乳动物，尤其人类的疾病的任何治疗，且包括：(a)预防疾病在易患所述疾病但尚未诊断患有所述疾病的个体中发生；(b)抑制疾病，即遏制其发展；及(c)减轻疾病，即引起疾病消退。

本发明提供一种用作肽穿透系统的融合蛋白，其特异性地结合至各种目标以将效应肽递送穿过生物障壁。本发明的融合蛋白可弥补此项技术内存在的缺陷，诸如低效、活性物质的生物性质的改变、杀灭目标细胞、生物障壁的不可逆破坏及/或待用于人类个体中的高风险。本发明的融合蛋白呈现未改变的生物活性物质(诸如效应肽)的高效非侵袭性递送。

在一个态样中，本发明提供一种融合蛋白，其包含：

(a)抗体或其抗原结合片段(Ab)，其能够靶向胞外表面标记物；及

(b)融合至(a)的Ab或融合在(a)的Ab内部的一或多个细胞穿透效应肽(CPEP)，

其中一个CPEP包含视情况存在的聚阴离子结构域(PAD)、一个或两个可裂解连接子(CL)、聚阳离子结构域(PCD)及效应肽(EP)，所述CPEP自N端至C端呈(EP-PCD-CL)、(PCD-EP-CL)、(EP-PCD-CL-PAD)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(CL-PCD-EP)、(CL-EP-PCD)、(PAD-CL-PCD-EP)或(CL-EP-PCD-CL-PAD)配置，此时CPEP融合至(a)的Ab的末端，或

一个CPEP包含视情况存在的聚阴离子结构域(PAD)、两个可裂解连接子(CL)、聚阳离子结构域(PCD)及效应肽(EP)，所述CPEP自N端至C端呈(CL-PCD-EP-CL)、(CL-EP-PCD-CL)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(PAD-CL-EP-PCD-CL)、(CL-EP-PCD-CL-PAD)或(CL-PCD-EP-CL-PAD)配置，此时CPEP用其两个末端融合在Ab的内部。

将一或多个CPEP融合至抗体或其抗原结合片段，或融合在抗体或其抗原结合片段的内部。用于本发明中的抗体或其抗原结合片段特异性地结合至表达所关注目标的任何细胞或细胞群体上的所关注目标。例示性目标包括(但不限于)氨基酸序列(例如，多肽、肽及蛋白质)、多醣、寡醣、碳水化合物及脂质。目标的特定非限制性种类包括受体及抗原。目标包括结合至抗原、受体或配位体的受体，其包括激素、生长因子、分化簇(统称为CD分子或CD标记物)、激素及生长因子类似物，及激素、激素类似物、生长因子、生长因子类似物的片段，及生长因子及类似物的片段。抗原目标包括病毒、细菌、真菌及寄生物抗原。抗原目标亦包括肿瘤相关抗原(TAA)。在一个实施例中，目标为胞外目标。例示性优选胞外目标包括(但不限于)下表中所列举者。

(第[0053]段)结合至目标的例示性抗体包括(但不限于)下表中所列举者。

在其他实施例中，抗体为阿特珠单抗、艾维路单抗、培立珠单抗、杜里土单抗、帕妥珠单抗或扎鲁姆单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗。在一个实施例中，抗体包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链序列。

抗体的抗原结合片段是指包含完整抗体的组分子集且保持抗体的抗原结合性质的蛋白。抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变域。可变域可为任何尺寸或氨基酸组成且一般将包含与一或多个构架序列相邻或同框的至少一个CDR。在具有与VL域相关联的VH域的抗原结合片段中，VH及VL域可在任何适合的配置内相对于彼此定位。举例而言，可变区可为二聚体且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可含有单体VH或VL域。在一些实施例中，抗体的抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')₂片段、单链片段、双功能抗体或线抗体。

在一个实施例中，一个CPEP包含视情况存在的聚阴离子结构域(PAD)、一个或两个可裂解连接子(CL)、聚阳离子结构域(PCD)及效应肽(EP)，所述CPEP自N端至C端呈(EP-PCD-CL)、(PCD-EP-CL)、(EP-PCD-CL-PAD)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(CL-PCD-EP)、(CL-EP-PCD)、(PAD-CL-PCD-EP)或(CL-EP-PCD-CL-PAD)配置，此时CPEP融合至抗体或其抗原结合片段的末端。

在另一实施例中，一个CPEP包含视情况存在的聚阴离子结构域(PAD)、两个可裂解连接子(CL)、聚阳离子结构域(PCD)及效应肽(EP)，所述CPEP自N端至C端呈(CL-PCD-EP-CL)、(CL-EP-PCD-CL)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(PAD-CL-EP-PCD-CL)、(CL-EP-PCD-CL-PAD)或(CL-PCD-EP-CL-PAD)配置，此时CPEP用其两个末端融合在抗体或其抗原结合片段的内部。亦即，CPEP整合入呈上述配置中的任一者的抗体或其抗原结合片段(Ab)内。

本发明的CPEP的可裂解连接子(CL)为包含复数个氨基酸残基的可裂解连接子。CPEP可包含一个或两个CL。两个CL可为相同的或不同的。当CPEP不具有PAD时，CL需要将抗体或其抗原结合片段与PCD-EP或EP-PCD连接。当CPEP具有PAD时，CL用以将酸性部分PAD与碱性部分PCD连接。举例而言，CL可包括约4至约100个之间的氨基酸，或约6至约30个之间的氨基酸。CL可包括氨基酸残基，且可为约4至约30个之间，或约4至约10个之间的氨基酸残基的肽键。

PCD为具有包含5至20个碱性氨基酸(优选7至12个碱性氨基酸)的序列的聚阳离子肽，其可有效地将CPEP传输穿过至少一个哺乳动物细胞的膜。亦发现聚阳离子肽具有核定位能力。PCD具有包含5至20个或其任何中间范围的连续碱性氨基酸的序列。在一个实施例中，PCD包含7至12个连续碱性氨基酸。在一个实施例中，碱性氨基酸在pH为6.0时带正电荷。在一个实施例中，聚阳离子肽选自由以下组成的群：聚离胺酸、聚精胺酸、聚鸟胺酸、聚组胺酸及阳离子多醣或其混合物。在另一实施例中，聚阳离子肽为包含选自由以下组成的群的聚阳离子中的至少两者的组合物：离胺酸、精胺酸、聚离胺酸、聚精胺酸、聚鸟胺酸、聚组胺酸及阳离子多醣。在一优选实施例中，聚阳离子肽组合物由离胺酸及精胺酸组成。在另一实施例中，聚阳离子肽为均聚物或共聚物，或其混合物。聚阳离子肽均聚物包含相同阳离子单体的单一重复单元。聚阳离子肽共聚物包含不同阳离子单体或不同阳离子聚合物。在一个实施例中，聚阳离子肽共聚物可包含阳离子单体的混合物、聚阳离子均聚物的混合物或聚阳离子共聚物的混合物。在一些实施例中，PCD包括非标准氨基酸，例如羟基离胺酸、锁链素、异锁链素或其他非标准氨基酸。

(第[0060]段)EP为结合至胞内目标的蛋白有效负载。在一个实施例中，EP为蛋白或功能蛋白的肽片段酶域。例示性EP包括(但不限于)下表中所列举者。

(第[0061]段)用于本发明的例示性融合蛋白中的优选EP及其序列列出于下表中。

CPEP可视情况包含视情况存在的聚阴离子结构域(PAD)。在一个实施例中，当CPEP具有聚阴离子结构域(PAD)时，CPEP为可激活的细胞穿透效应肽(ACPEP)。ACPEP呈现与目标蛋白的可激活结合(可切换结合)。通过经由蛋白酶-可裂解连接子将细胞穿透肽融合至聚阴离子肽结构域来阻断细胞穿透肽的全身性细胞摄取，从而经由形成分子内发夹结构中和所述聚阳离子结构域。为了特异性，设计连接子以使得其被某些酶裂解。在投与后，具有本发明的ACPEP的融合蛋白行进至肿瘤，其中ACPEP被蛋白酶裂解且积聚在目标组织内。

PAD为具有包含4至20个酸性氨基酸(优选5至9个酸性氨基酸)的序列的聚阴离子肽。PAD能有效形成自组装的聚阴离子-聚阳离子相互作用以防止ACPEP穿过细胞膜。在一些实施例中，PAD具有包含4至20个或其任何中间范围的连续酸性氨基酸的序列。在一个实施例中，PCD包含5至9个连续酸性氨基酸。在一个实施例中，酸性氨基酸在pH为6.0时带负电荷。在一个实施例中，酸性氨基酸具有pKa低于6.0的侧链。酸性氨基酸的非限制性实例包括天冬胺酸、麸胺酸、磷丝胺酸及磷酸苏胺酸。在一特定实施例中，PAD包含5至9个连续麸胺酸盐、天冬氨酸盐或其混合物。在一些实施例中，PAD包含一或多个D-氨基酸。在一特定实施例中，PAD由D-氨基酸组成。在一些实施例中，PAD为6个连续天冬胺酸盐。在一些实施例中，PCD包括非标准氨基酸，例如羟基离胺酸、锁链赖氨酸、异锁链素或其他非标准氨基酸。部分A可包括经修饰的氨基酸。

在一些其他实施例中，当CPEP用其两个末端融合在Ab的内部时，本发明的融合蛋白自N端至C端具有以下配置：Ab^N-(CL-PCD-EP-CL)-Ab^C、Ab^N-(CL-EP-PCD-CL)-Ab^C、Ab^N-(PAD-CL-PCD-EP-CL)-Ab^C、Ab^N-(PAD-CL-EP-PCD-CL)-Ab^C、Ab^N-(CL-EP-PCD-CL-PAD)-Ab^C或Ab^N-(CL-PCD-EP-CL-PAD)-Ab^C，其中Ab^N为Ab的N端片段且Ab^C为Ab的C端片段。在CPEP用其两个末端融合在Ab内部的情况下，CPEP整合至Ab内的关注位置中，从而使得本发明的融合蛋白自N端至C端包含抗体N端片段、CPEP及抗体C端片段。抗体N端片段及抗体C端片段的尺寸视CPEP整合入的位置而变化。

在另一实施例中，CPEP融合至Ab的重链的末端或内部。

本发明的融合蛋白具有双官能目标以结合胞外表面标记物及达成胞内目标调整。本发明的融合蛋白的效应肽可通过在特定条件存在下或在特定环境中裂解CL而进入目标细胞内。在优选实施例中，CL在生理条件下可裂解。此CL的裂解可得到强化或可通过特定病理信号或与需要融合蛋白递送的细胞相关的特定环境来实现。CL可通过特异性酶裂解，从而使得细胞摄取可以靶向至得到这些条件的特定位置。在CL裂解之后，融合蛋白的PCD-EP或EP-PCD部分自Ab释放。

在一些实施例中，CL可通过细胞环境中所发现的条件裂解，诸如酸性条件，其可在癌细胞及癌组织或还原环境附近发现，如可于低氧或局部缺血细胞及组织附近发现；可通过在具有待治疗病症的细胞(诸如，患病、凋亡或坏死细胞及组织)的表面上发现或在细胞附近释放的蛋白酶或其他酶类裂解；或可通过其他条件或因子裂解。

(第[0069段])用于CL裂解的例示性酶类包括(但不限于)下表中所列举者。

(第[0070]段)用于本发明的例示性融合蛋白中的优选CL及其序列列出于下表中。

(第[0071]段)在一些实施例中，本发明的融合蛋白展示于下表中。各融合蛋白的核苷酸及氨基酸序列亦列于下表中。因此，在一些实施例中，本发明的融合蛋白包含具有选自SEQ ID NO.9、13、15、17、19、21及23的氨基酸序列的重链序列及具有选自SEQ ID NO.11的氨基酸序列的轻链序列。因此，本发明的融合蛋白包含：

3D4KLA：具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链，及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链序列；

3D4S9：具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链，及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链序列；

3D4rS9：具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链，及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链序列；

3D4rS9-△D6：具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链，及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链序列；

3D4rS9-A：具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链，及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链序列；

3D4rS9-D：具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链，及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链序列；或

3D4Fc-rS9：具有(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列的重链，及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链序列。

融合蛋白的制备可通过任何用于制备蛋白质的通用方法进行，诸如蛋白质的化学合成、使用包含(携载)编码融合蛋白的各组分的聚核苷酸的表达(重组)载体(在合适宿主细胞内)的蛋白表达及其类似方法。

本发明的融合蛋白可根据公知的公众已知的基因工程技术制造。因此，举例而言，必要时扩增编码Ab的DNA及编码CPEP的DNA中的每一者，彼等DNA彼此结合，将所得DNA插入至细胞表达载体中，且用载体转染宿主细胞以表达融合蛋白，由此可制造本发明的融合蛋白。DNA的扩增可通过例如PCR方法进行。扩增DNA的结合可例如通过重迭延伸PCR方法进行。亦可设计待表达的融合蛋白的氨基酸序列以便直接制备人工合成基因。表达载体优选包括用于促进表达效率的启动子，及用于自培养上清液轻易回收经表达的融合蛋白的分泌信号序列，诸如抗体重链信号序列或抗体κ链信号序列。至于表达宿主细胞，可使用哺乳动物细胞、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、细菌细胞(大肠杆菌等)等。其中，动物细胞为优选的，且CHO细胞、HEK293细胞等为尤其优选的。

对于熟习此项技术者而言，显而易见的是如此定义的融合蛋白可通过肽及蛋白质的已知化学合成方法合成。融合蛋白可通过化学肽合成方法合成，尤其使用利用适合树脂作为载体的固相肽合成技术。或者，融合蛋白可通过肽的化学合成方法以连续蛋白形式合成。或者，蛋白的个别片段(结构域)可分别合成，且随后通过一个肽片段的胺基端自第二肽的羧基末端的缩合经由肽键一起组合在一个连续肽中。这些技术为公知的且熟知的。

本发明亦提供用于将效应肽递送至细胞内的组合物。在一个实施例中，组合物包含本发明的融合蛋白及药理学上适合的载剂。这些组合物通常制备为液态溶液或悬浮液，然而，亦涵盖固体形式，诸如锭剂、丸剂、粉末及其类似物。本发明的融合蛋白可与医药学上可接受且可与所述融合蛋白相容的赋形剂混合。适合的赋形剂为例如水、生理盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其类似物或其组合。此外，组合物可含有少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂及其类似物。此外，组合物可含有各种辅料(可诱导或增加针对抗原或免疫原的体液及/或细胞免疫反应的化合物)。若需要投与口服形式的组合物，则可添加各种增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂及其类似物。本发明的组合物可含有任何这些额外成份，从而提供呈适合于投与的形式的组合物。

本发明的组合物(制剂、调配物等)可通过熟习此项技术者熟知的多种适合手段中的任一者投与，包括但不限于通过非经肠(包括例如动脉内、静脉内、肌内、皮下)、经体表(包括真皮、经皮、皮下等)、经口、经鼻、经黏膜(包括舌下)及腔内途径(诸如阴道内、子宫颈内、子宫内、阴茎内及鼻内)。在一些实施例中，投与模式为通过注射、皮内或经口。

本发明亦提供用于将效应肽递送至细胞内及/或细胞核内的方法，其包含向个体投与本发明的融合蛋白或包含本发明的融合蛋白的组合物。因此，本发明提供一种本发明的融合蛋白在制造用于将效应肽递送至细胞内及/或细胞核内的药物中的用途。视待通过融合蛋白递送的效应肽而定，本发明的融合蛋白可经投与以用于癌症、纤维化、发炎疾病、代谢障碍、免疫系统病症、传染病、抗老化及酶替代疗法。融合蛋白可达成胞内及核内药物递送。前述实例用来进一步说明本发明的特定实施例，但不应解释为以任何方式限制本发明。

实例

实例1本发明的生物药物递送技术的作用机制

图1展示用于癌症治疗的此种创新生物药物递送技术ASC(抗体开启细胞毒性(Antibody Switched-on Cytotoxicity))生物平台的作用机制(MOA)的示意图，所述ASC生物平台利用靶向细胞表面的抗体(步骤1)；及随后在肿瘤微环境中激活CPEP(步骤2)，且CPP(细胞穿透肽)/PCD将作为细胞毒性肽有效负载的EP递送至细胞内(步骤3)。

实例2ASC生物药物表达及纯化

各ASC生物药物的基因经重新DNA合成或基于PCR合成，且选殖成经修饰的哺乳动物表达载体。基于抗-DSG2抗体(3D4)产生ASC生物药物(3D4scr、3D4KLA、3D4S9、3D4rS9、3D4rS9-△D6、3D4rS9-A、3D4S9-D及3D4Fc-rS9)。亦基于抗-DSG2抗体(3D4)产生具有无细胞毒性的EP的3D4scr作为阳性对照。3D4及3D4scr的核苷酸及氨基酸序列列于下表1中。各ASC生物药物的核苷酸及氨基酸序列描述于先前序列表中(参见第[0071]段)。遵循制造商说明书，利用Expi293^TM表达系统(Thermo Fisher Scientific)通过短暂基因表达来表达ASC生物药物。通过蛋白A亲和力纯化(GE Healthcare)自Expi293^TM上清液纯化ASC生物药物。在用pH 8.0的0.1M Tris及pH 8.0的10mM Tris洗涤蛋白A树脂之后，用pH 3.0的0.1M甘胺酸溶离ASC生物药物，随后通过每1mL溶离液添加0.1mL的pH 8.0的1M Tris-HCl来快速调节样品pH。随后，使用PD-10(Nap-10)去盐管柱(Desalting Column)(GE Healthcare)将蛋白溶液与PBS缓冲交换，且最后使用Vivaspin蛋白浓缩器旋转管柱(Vivaspin ProteinConcentrator Spin Column)(GE Healthcare)浓缩。所得ASC生物药物包括3D4scr、3D4KLA、3D4S9、3D4rS9、3D4rS9-△D6、3D4rS9-A、3D4S9-D及3D4Fc-rS9。

表1

实例3通过流动式细胞测量术的ASC生物药物分析

收集细胞(1×10⁶/ml)且将细胞再悬浮在具有2％FBS且含有2mM EDTA的PBS中，且与1μg/ml IgG、3D4scr、3D4KLA或3D4S9在4℃下一起培育30分钟。细胞用PBS洗涤两次，且随后在4℃下添加次级FITC结合抗体(Alexa Fluor 488山羊抗人类IgG)持续30分钟。将样品用PBS洗涤两次，且使用流动式细胞测量术分析。每样品分析10000个细胞事件。图2A展示通过流动式细胞测量术测得的表面结合ASC生物药物且结果展示ASC生物药物识别目标细胞。

收集人类乳房腺癌MCF7细胞且将其再悬浮在具有2％FBS且含有2mM EDTA的PBS中，且在4℃或37℃下与3D4S9(1μg/ml)一起培育，持续各时间点(1、5、10、15、30、60、90及120分钟)。所有细胞固定在1％多聚甲醛内10分钟，用PBS洗涤两次，且用初级兔抗连接子-X抗体染色。将Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG及AlexaFluor 488山羊抗人类IgG分别用于侦测连接子-X及ASC生物药物。使用流动式细胞测量术分析样品。每样品分析10000个细胞事件。图2B通过流动式细胞测量术评估裂解的ASC生物药物。

将人类乳房腺癌MCF7细胞接种在玻璃盖玻片上48小时，且在37℃下用3D4S9处理1小时及48小时。将盖玻片上的细胞用PBS洗涤，固定在4％多聚甲醛内，用PBS洗涤两次，及用0.2％Triton X-100渗透化15分钟。在用PBS洗涤之后，细胞用10％FBS阻断1小时，随后与兔抗连接子-X抗体一起培育。将Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG及Alexa Fluor 488山羊抗人类IgG分别用于可视化连接子-X及ASC生物药物的位置。最后，将固定细胞用PBS洗涤3次，且将其核对比染色、安放及使用萤光显微镜或共焦显微镜观测。图2C展示萤光ICC染色。图2B及C的结果展示3D4S9的聚阳离子结构域裂解且内化入人类乳房腺癌MCF7细胞中。

实例4软琼脂群落形成分析法

细胞(2×10³)用3D4scr、3D4KLA、3D4S9、3D4rS9、3D4rS9-△D6、3D4rS9-A、3D4S9-D或3D4Fc-rS9处理10分钟，且随后与生长介质中的0.35％琼脂糖混合，在12孔板中平铺在生长介质内的0.5％琼脂糖的固化层的顶部上。在1-2周后，将群落用Cristal Violet(0.01％溶液)染色且用PBS洗涤，且使用显微镜对群落计数。3D4scr、3D4KLA、3D4S9、3D4rS9、3D4rS9-ΔD6、3D4rS9-A、3D4S9-D或3D4Fc-rS9的软琼脂群落形成分析法的结果展示于图3至9中。结果展示用3D4KLA处理的人类乳房腺癌MCF7细胞(A)及人类非小细胞肺癌H1299(B)中的软琼脂群落形成活性降低(图3)；用3D4S9处理的人类乳房腺癌MDA-MB-231(A)、人类乳房腺癌SKBR3(B)、人类乳房腺癌MCF7(C)、人类肺癌A549(D)、人类非小细胞肺癌H1299(E)及人类胰脏腺癌PANC-1细胞(F)中的软琼脂群落形成活性降低(图4)；用3D4rS9处理的人类肺癌A549细胞中的软琼脂群落形成活性降低(图5)；用3D4rS9-A处理的人类乳房腺癌SKBR3(A)及人类肺癌A549细胞(B)中的软琼脂群落形成活性降低(图6)；用3D4rS9-D处理的人类肺癌A549细胞中的软琼脂群落形成活性降低(图7)；用3D4rS9-△D6处理的人类乳房腺癌SKBR3细胞中的软琼脂群落形成活性降低(图8)；用3D4Fc-rS9处理的人类肺癌A549细胞中的软琼脂群落形成活性降低(图9)。

将3D4sc、3D4S9、3D4KLA、3D4rS9、3D4rS9-△D6、3D4rS9-A、3D4rS9-D及3D4Fc-rS9用于各种癌细胞株的活体外抑制分析法中，且结果展示在下表2中。

(-)：阴性结果，群落形成未减少；

(+)：阳性结果，群落形成显着减少；

ND：(没有变化)

实例5肿瘤异种移植物

6周大雄性非肥胖严重糖尿病结合免疫缺乏小鼠接收皮下注射与基质胶(Matrigel)(1:1)混合的0.1ml PBS中的人类胰脏癌PANC1细胞株的2×10⁶个细胞。当肿瘤体积达到约20mm³时，小鼠随机分派至各治疗组。经PBS稀释的3D4scr及3D4S9(30mg/kg)每周两次腹膜内注射，持续3周。在治疗期结束时记录体重以评估3D4scr及3D4S9疗法的全身性毒性。用测径规量测肿瘤尺寸且根据公式(长度×宽度²)/2计算肿瘤体积。

图10A至C展示3D4S9减少使用人类胰脏癌PANC1细胞的NOD/SCID小鼠内的异种移植肿瘤生长。相比于3D4scr对照组内231(±150)mm3的肿瘤体积，携带用3D4S9治疗的人类PANC1肿瘤异种移植物的小鼠在三周之后具有84(±40)mm3的肿瘤体积。3D4S9治疗减小异种移植肿瘤体积达60％(A)。相比于3D4scr对照组内0.66(±0.3)g的肿瘤重量，携带用3D4S9治疗的人类PANC1肿瘤异种移植物的小鼠在三周之后具有0.13(±0.02)g的肿瘤重量。3D4S9治疗减小异种移植肿瘤重量达80％(B)。小鼠在处死之前称重。携带用3D4scr或3D4S9治疗的人类PANC1肿瘤异种移植物的小鼠具有几乎相同的体重(C)。

序列表

<110> 艾斯克立必恩股份有限公司

<120> 用于药物递送的抗体融合蛋白

<130> A91566/CN28254

<150> US 62/346,386

<151> 2016-06-06

<160> 26

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

Leu His Cys Lys Ser Phe Ala Ser Gly

1 5

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys

1 5 10

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Lys His Ser Pro Ala Cys Ala Phe Leu

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 5

Lys Pro Leu Gly Leu Ala Arg

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 6

Pro Leu Gly Leu Ala Gly

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 7

Lys Pro Leu Gly Leu Ala Gly

1 5

<210> 8

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体3D4KLA的重链

<400> 8

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaggcaggct 120

ccaggaaagg ctttaaagtg gatggtctgg atgaacacca acactggaga gtcaatatat 180

gctgaggagt tcaagggacg gtttgtcttc tctttggata cctctgccag tactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat atttctgtgc aagatactgg 300

gacacctatt ggggccaagg caccactctc acagtctcct cagctagcac caagggccca 360

tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 420

tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480

accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 540

agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 600

cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagcagagc ccaaatcttg tgacaaaact 660

cacacatgcc caccgtgccc agatgacgac gatgatgaca aaccactggg cctggccaga 720

cgccggagaa ggagacgcag gcggagaaaa ctggcaaagc ttgccaagaa actcgccaag 780

cttgctaaac cactgggcct ggcgggcgca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 840

ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 900

gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 960

gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 1020

gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga ctacaagtgc 1080

aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1140

cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaggaac 1200

caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1260

gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1320

ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1380

gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1440

tccctgtctc cgggtaaa 1458

<210> 9

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体3D4KLA的重链

<400> 9

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Lys Trp Met

35 40 45

Val Trp Met Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Ala Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Asp Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

180 185 190

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Asp Asp Asp Asp Asp Asp Lys Pro Leu Gly Leu Ala Arg

225 230 235 240

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys

245 250 255

Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Pro Leu Gly Leu Ala Gly Ala Pro Glu

260 265 270

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

275 280 285

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

290 295 300

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

305 310 315 320

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

325 330 335

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

340 345 350

Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

355 360 365

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

370 375 380

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn

385 390 395 400

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

405 410 415

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

420 425 430

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

435 440 445

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

450 455 460

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

465 470 475 480

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485

<210> 10

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体3D4KLA, 3D4S9, 3D4rS9, 3D4rS9-Delta D6,

3D4rS9-A, 3D4rS9-D, 3D4Fc-rS9, 3D4, 或 3D4scr的轻链

<400> 10

gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60

atcacttgca aggcgagtca ggacattaat agctatttaa gctggttcca gcagaaacca 120

gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt gcaaacagat tggtagatgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggcaagat ttttctctca ccatcagcag ccttgagtat 240

gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 11

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体3D4KLA, 3D4S9, 3D4rS9, 3D4rS9-Delta D6,

3D4rS9-A, 3D4rS9-D, 3D4Fc-rS9, 3D4, 或 3D4scr的轻链

<400> 11

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

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<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体3D4rS9-D的重链

<400> 20

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaggcaggct 120

ccaggaaagg ctttaaagtg gatggtctgg atgaacacca acactggaga gtcaatatat 180

gctgaggagt tcaagggacg gtttgtcttc tctttggata cctctgccag tactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat atttctgtgc aagatactgg 300

gacacctatt ggggccaagg caccactctc acagtctcct cagctagcac caagggccca 360

tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 420

tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480

accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 540

agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 600

cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagcagagc ccaaatcttg tgacaaaact 660

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 720

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 780

gtggacgacg acgatgacga taagcctctg ggcctggcca gacggcggag aagaagaagg 840

cgcagacgga agcacagccc tgcctgcgct tttctgccac tgggcctggc gggcgtgagc 900

cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 960

aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1020

gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gactacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1080

ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1140

gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccagga accaggtcag cctgacctgc 1200

ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1260

gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1320

agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1380

atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1440

<210> 21

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体3D4rS9-D的重链

<400> 21

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Lys Trp Met

35 40 45

Val Trp Met Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Ala Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Asp Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

180 185 190

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Asp Asp Asp Asp Asp Lys Pro Leu Gly Leu

260 265 270

Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys His Ser Pro Ala

275 280 285

Cys Ala Phe Leu Pro Leu Gly Leu Ala Gly Val Ser His Glu Asp Pro

290 295 300

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

305 310 315 320

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

325 330 335

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr

340 345 350

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

355 360 365

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

370 375 380

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

385 390 395 400

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

405 410 415

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

420 425 430

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

435 440 445

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

450 455 460

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475 480

<210> 22

<211> 1425

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体3D4rFc-rS9的重链

<400> 22

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaggcaggct 120

ccaggaaagg ctttaaagtg gatggtctgg atgaacacca acactggaga gtcaatatat 180

gctgaggagt tcaagggacg gtttgtcttc tctttggata cctctgccag tactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat atttctgtgc aagatactgg 300

gacacctatt ggggccaagg caccactctc acagtctcct cagctagcac caagggccca 360

tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 420

tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480

accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 540

agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 600

cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagcagagc ccaaatcttg tgacaaaact 660

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 720

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 780

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 840

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 900

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggactacaa gtgcaaggtc 960

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1020

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccag gaaccaggtc 1080

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1140

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1200

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1260

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1320

tctccgggta aagacgacga cgatgacgat aagcctctgg gcctggccgg acggcggaga 1380

agaagaaggc gcagacggaa gcacagccct gcctgcgctt ttctg 1425

<210> 23

<211> 475

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体3D4Fc-rS9的重链

<400> 23

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Lys Trp Met

35 40 45

Val Trp Met Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Ala Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Asp Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

180 185 190

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

340 345 350

Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asp Asp Asp Asp

435 440 445

Asp Asp Lys Pro Leu Gly Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

450 455 460

Arg Arg Lys His Ser Pro Ala Cys Ala Phe Leu

465 470 475

<210> 24

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体3D4 (抗-DSG2)的重链

<400> 24

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Lys Trp Met

35 40 45

Val Trp Met Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Ala Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Asp Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

180 185 190

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

340 345 350

Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 25

<211> 1443

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体3D4scr的重链

<400> 25

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaggcaggct 120

ccaggaaagg ctttaaagtg gatggtctgg atgaacacca acactggaga gtcaatatat 180

gctgaggagt tcaagggacg gtttgtcttc tctttggata cctctgccag tactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat atttctgtgc aagatactgg 300

gacacctatt ggggccaagg caccactctc acagtctcct cagctagcac caagggccca 360

tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 420

tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 480

accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 540

agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 600

cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagcagagc ccaaatcttg tgacaaaact 660

cacacatgcc caccgtgccc agatgacgac gatgatgaca aaccactggg cctggccaga 720

cgccggagaa ggagacgcag gcggagactg cattgcaaat cctttgcaag cggcccactg 780

ggcctggcgg gcgcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 840

cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 900

agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 960

gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1020

accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggactaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1080

gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1140

caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca ggaaccaggt cagcctgacc 1200

tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1260

ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1320

tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1380

gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1440

aaa 1443

<210> 26

<211> 481

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体3D4scr的重链

<400> 26

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Lys Trp Met

35 40 45

Val Trp Met Asn Thr Asn Thr Gly Glu Ser Ile Tyr Ala Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Asp Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

180 185 190

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Asp Asp Asp Asp Asp Asp Lys Pro Leu Gly Leu Ala Arg

225 230 235 240

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu His Cys Lys Ser Phe Ala

245 250 255

Ser Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

260 265 270

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

275 280 285

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

290 295 300

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

305 310 315 320

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

325 330 335

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp

340 345 350

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

355 360 365

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

370 375 380

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln Val Ser Leu Thr

385 390 395 400

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

405 410 415

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

420 425 430

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

435 440 445

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

450 455 460

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475 480

Lys

Claims

1.一种融合蛋白，其包含：

(b)一或多个细胞穿透效应肽(cell penetrating effector peptide；CPEP)，其融合至(a)的Ab或融合在(a)的Ab内部，

其中一个CPEP包含视情况存在的聚阴离子结构域(polyanionic domain；PAD)、一个或两个可裂解连接子(cleavable linker；CL)、聚阳离子结构域(polycation domain；PCD)及效应肽(effector peptide；EP)，所述CPEP自N端至C端是呈(CL-PCD-EP)、(CL-EP-PCD)、(PAD-CL-PCD-EP)、(CL-EP-PCD-CL-PAD)、(EP-PCD-CL)、(PCD-EP-CL)、(EP-PCD-CL-PAD)或(PAD-CL-PCD-CL-PAD)配置，此时所述CPEP融合至(a)的Ab的末端，或

一个CPEP包含视情况存在的聚阴离子结构域(PAD)、两个可裂解连接子(CL)、聚阳离子结构域(PCD)及效应肽(EP)，所述CPEP自N端至C端是呈(CL-PCD-EP-CL)、(CL-EP-PCD-CL)、(PAD-CL-PCD-EP-CL)、(PAD-CL-EP-PCD-CL)、(CL-EP-PCD-CL-PAD)或(CL-PCD-EP-CL-PAD)配置，此时所述CPEP用其两个末端融合在所述Ab的内部。

2.如权利要求1的融合蛋白，其中所述CPEP融合至所述Ab的重链的末端或内部。

3.如权利要求1的融合蛋白，其中所述抗体或其抗原结合片段靶向任何以下胞外标记物：

4.如权利要求1的融合蛋白，其中所述抗体选自由以下组成的群：阿昔单抗(abciximab)、阿布里单抗(abrilumab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿柏西普(aflibercept)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿玛西单抗(amatuximab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、艾维路单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达利珠单抗(daclizumab)、德诺单抗(denosumab)、杜里土单抗(duligotumab)、艾库组单抗(eculizumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、艾法珠单抗(efalizumab)、埃吉姆单抗(elgemtumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、依那西普(etanercept)、埃达珠单抗(etaracizumab)、艾托珠单抗(etrolizumab)、非吉单抗(figitumumab)、戈利木单抗(golimumab)、英利昔单抗(infliximab)、伊派利单抗(ipilimumab)、卢姆珠单抗(lumretuzumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕特里单抗(patritumab)、培立珠单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、兰比珠单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、塞库金单抗(secukinumab)、塞里班单抗(seribantumab)、他尼珠单抗(tanezumab)、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲美单抗(tremelimumab)、优特克单抗(ustekinumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、沃洛昔单抗(volociximab)及扎鲁姆单抗(zalutumumab)。

5.如权利要求1的融合蛋白，其中所述抗体包含：具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链序列。

6.如权利要求1至5中任一项的融合蛋白，其中所述抗体的抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')2片段、单链片段、双功能抗体或线抗体。

7.如权利要求1的融合蛋白，其中当所述CPEP融合至(a)的Ab的末端时，所述融合蛋白自N端至C端具有以下配置：(EP-PCD-CL)-Ab、(PCD-EP-CL)-Ab、(EP-PCD-CL-PAD)-Ab、(PAD-CL-PCD-EP-CL)-Ab、Ab-(CL-PCD-EP)、Ab-(CL-EP-PCD)、Ab-(PAD-CL-PCD-EP)或Ab-(CL-EP-PCD-CL-PAD)。

8.如权利要求1的融合蛋白，其中当所述CPEP用其两个末端融合在所述Ab的内部时，所述融合蛋白自N端至C端具有以下配置：Ab^N-(CL-PCD-EP-CL)-Ab^C、Ab^N-(CL-EP-PCD-CL)-Ab^C、Ab^N-(PAD-CL-PCD-EP-CL)-Ab^C、Ab^N-(PAD-CL-EP-PCD-CL)-Ab^C、Ab^N-(CL-EP-PCD-CL-PAD)-Ab^C或Ab^N-(CL-PCD-EP-CL-PAD)-Ab^C，其中Ab^N为所述Ab的N端片段且Ab^C为所述Ab的C端片段。

9.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述PCD包含5至20个连续碱性氨基酸。

10.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述PCD包含7至12个连续碱性氨基酸。

11.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述PCD选自由以下组成的群：聚离胺酸、聚精胺酸及聚组胺酸或其混合物。

12.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中PCD组合物由8至10个连续离胺酸及精胺酸组成。

13.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述EP为肽片段、蛋白的酶结构域、或功能蛋白或其组合。

14.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述EP为选自以下的肽片段：AKT、淀粉状蛋白-β、APAF1、ARF、Bcl-2、BCL9、β-索烃素(catenin)、BH3螺旋体、CDKN2B、环孢素A、散乱蛋白(dishevelled)、E-钙黏素(cadherin)、ERK、EZH2、GNAS、GRB7、HIF-1、组蛋白H3、组蛋白H4、HSP60、HSP70、HSP90、IKBKG、ITPR3、KLA、LAP、LFA-1、MAPK8IP1、MDM2、MEK、NBS1、P53、PKA、PKC、RAF、Slug、Smac/DIABLO、Stat3、存活素(survivin)或XIAP或其组合。

15.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中EP具有SEQ ID NO:2、3或4的氨基酸序列或其组合。

16.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述CPEP的所述PAD为具有包含4至20个酸性氨基酸的序列的聚阴离子肽。

17.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述PAD包含5至9个连续酸性氨基酸。

18.如权利要求17的融合蛋白，其中所述酸性氨基酸为天冬胺酸、麸胺酸、磷丝胺酸及磷酸苏胺酸。

19.如权利要求17的融合蛋白，其中所述PAD为6至8个连续天冬胺酸及麸胺酸。

20.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述CPEP的所述CL包含约6至约30个之间的氨基酸。

21.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述CPEP的所述CL包含约4至约10个之间的氨基酸残基。

22.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述CL在细胞环境中可裂解。

23.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述CL在胞外环境中可裂解。

24.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述CL在癌细胞附近的酸性条件下可裂解。

25.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述CL可通过以下任一者或其组合裂解：

26.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述CL序列包含：KPLGLAR(SEQ ID NO:5)、PLGLAG(SEQ ID NO:6)或KPLGLAG(SEQ ID NO:7)或其组合。

27.如权利要求1至8中任一项的融合蛋白，其中所述CL包含一或多个如权利要求20至26中任一项的序列。

28.如权利要求1的融合蛋白，其包含具有选自SEQ ID NO:9、13、15、17、19、21及23的氨基酸序列的重链序列，及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链序列。

29.如权利要求1的融合蛋白，其包含：

3D4rS9-ΔD6：具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链，及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链序列；

3D4Fc-rS9：具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链，及具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链序列。

30.一种用于将效应肽递送至细胞内的组合物，其包含如权利要求1至29中任一项的融合蛋白及药理学上适合的载剂。

31.一种如权利要求1至29中任一项的融合蛋白或如权利要求30的组合物的用途，其用于制造用以将效应肽作为蛋白有效负载递送至细胞或细胞核内的药物。

32.如权利要求31的用途，其中所述融合蛋白或组合物经由非经肠或腔内途径投与。

33.如权利要求32的用途，其中所述融合蛋白经投与以用于癌症、纤维化、发炎疾病、代谢障碍、免疫系统病症、传染病、抗老化或酶替代疗法，端视欲通过所述融合蛋白递送的所述效应肽而定。