CN109307662A - 使用基于荧光的检测制备组织切片 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于区分组织与包埋介质的改进方法，该包埋介质是例如福尔马林固定的石蜡包埋样品中的石蜡。该方法涉及使用组织中天然存在的物质的荧光以确定该经包埋样品中该组织的位置。经包埋样品通常由选定波长的光激发，并且使用在发射波长处的荧光发射以定位该经包埋样品中该组织的边界或位置。

Description

使用基于荧光的检测制备组织切片
技术领域
本申请涉及使用基于荧光的检测从经包埋样品(例如福尔马林固定的石蜡包埋样品)制备组织切片的方法。
背景技术
福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织块的形成用于保存组织样品的形态和细胞内容物。组织处理通常涉及将分离的组织在福尔马林中放置一段时间，例如几天，并且然后将组织包埋在石蜡中。FFPE样品可以方便地在室温长期储存，且尤其可用于免疫组织化学染色和形态分析。FFPE样品也可用于分析(profile)基因表达和研究疾病。
在进行生物测试时，通常通过在切片机上切割组织块来修整FFPE组织块。可以分析组织块以由技术人员或使用自动化方法确定FFPE中组织的边界。在前一种情况下，技术人员通常检查FFPE块以观察石蜡中包埋的组织的漫射图像。技术人员可以确定包含组织的切片的横截面区域应该看起来是什么样的，并将其与从切片机刀片出来时的组织切片相比较。优选地，修整组织块以将代表量的组织暴露于块的表面并确保块的面与刀的边缘对齐。
在自动分析过程中，通常使用相机对组织进行成像。光源以一定角度照射组织块的表面，以区分石蜡与组织表面之间的差异。由于石蜡比组织相对更平滑，因此自动分析利用石蜡和组织的不同天然纹理来区分这两种材料。
US 2010/0118133 A1公开了一种自动化方法和设备，其用于产生薄组织切片并使用相机获得通过对样品切片而产生的表面的图像。使用一种设备评价图像，以确定样品的切片是否可以接受以供进一步使用。
许多现有方法在用于分析不同组织和石蜡类型时提供不准确且不一致的数据，因为许多方法对组织和石蜡的光学和表面特征的变化敏感。在一些情况下，使用现有方法很难将FFPE样品中的组织与石蜡区分开。
因此，需要一种用于确定例如石蜡的包埋介质中组织样品的位置的其他方法和装置。本发明的方法和装置提供了用于将组织块中的组织与石蜡区分开的准确且一致的方法。
发明内容
在一个实施方案中，本申请提供了一种确定经包埋样品中组织的位置的方法。该方法包括用波长为从约200nm至约600nm的光辐照经包埋样品，其中该经包埋样品包括组织和包埋介质；检测该经包埋样品的荧光发射；并且基于该荧光发射确定在该经包埋样品中该组织的至少一部分的位置。
在另一个实施方案中，本申请提供了一种确定在经包埋样品中组织的位置的方法。该方法包括用至少一个光源辐照包括组织和包埋介质的经包埋样品以产生第一荧光发射和第二荧光发射；检测该第一荧光发射和该第二荧光发射；并且基于该第一荧光发射和该第二荧光发射确定该经包埋样品中该组织的至少一部分的位置。
在另一个实施方案中，本申请提供了一种用于从经包埋样品切下组织切片的装置。该装置包括：切片机，该切片机包括适配为用于线性运动的样品架、刀具架、和由该刀具架保持的与该样品架相对的刀具，使得当该样品架线性移动时由该样品架保持的样品被该刀具切片以形成组织切片；指向该样品架的至少一个光源；以及光学系统，其被定位为可捕获来自由该样品架保持的样品的发射光。
根据本申请公开的主题提供的示例性实施方案包括但不限于权利要求和以下实施方案：
A1.一种确定经包埋样品中组织的位置的方法，该方法包括：
用光辐照经包埋样品，其中该经包埋样品包括组织和包埋介质；
检测该经包埋样品的荧光发射；并且
基于该荧光发射确定在该经包埋样品中该组织的至少一部分的位置。
B1.一种确定经包埋样品中组织的位置的方法，该方法包括：
用至少一个光源辐照包括组织和包埋介质的经包埋样品以产生第一荧光发射和第二荧光发射；
检测该第一荧光发射和该第二荧光发射；并且
基于该第一荧光发射和该第二荧光发射确定该经包埋样品中该组织的至少一部分的位置。
B2.实施方案B1的方法，其中该第一荧光发射是该包埋介质的荧光发射。
B3.实施方案B1或B2的方法，其中该第二荧光发射是该组织的组分的荧光发射。
B4.实施方案B1至B3中任一项的方法，其中该第一荧光发射和/或该第二荧光发射在从300nm至600nm、优选从300nm至550nm、更优选从300nm至500nm、或甚至更优选从300nm至450nm的波长处具有最大值。
B5.实施方案B1至B4中任一项的方法，其中该第一荧光发射在从375nm至425nm的波长处具有最大荧光，并且该第二荧光发射在从500nm至600nm的波长处具有最大荧光。
AB1.前述实施方案中任一项的方法，其中该包埋介质是石蜡。
AB1.a实施方案AB1的方法，其中该经包埋样品是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织块。
AB1.b.实施方案AB1或AB1.a的方法，其中该石蜡为粒化石蜡、完全精制的石蜡、半精制石蜡、或其组合。
AB1.c实施方案AB1或AB1.a的方法，其中该石蜡是完全精制的石蜡与合成树脂或聚合物的共混物。
AB1.d实施方案AB1或ABl.a的方法，其中该石蜡是Spectrum石蜡、Millipore石蜡、Fisherfinest Histopath石蜡、EMS Paramat、Paraplast&Polyfin、Sakura FinetekTissue Tek VIP、Leica Surgipath Paraplast、或其组合。
AB1.e实施方案AB1至AB1.d中任一项的方法，其中该石蜡包含二甲亚砜(DMSO)。
AB2.实施方案A1至B5中任一项的方法，其中该包埋介质是环氧树脂。
AB2.a实施方案AB2的方法，其中该环氧树脂是缩水甘油基环氧树脂。
AB2.a.i实施方案AB2.a的方法，其中该缩水甘油基环氧树脂是缩水甘油胺、缩水甘油酯、缩水甘油醚、或其组合。
AB2.a.ii实施方案AB2.a.的方法，其中该环氧树脂是Araldite、Quetol、Epon812、Embed 812、Poly-Bed 812、或其组合。
AB2.a.iii实施方案AB2.a的方法，该缩水甘油基环氧树脂是乙二醇二缩水甘油醚。
AB2.b实施方案AB2的方法，其中该环氧树脂是非缩水甘油基环氧树脂。
AB2.b.i实施方案AB2.b.的方法，其中该非缩水甘油基树脂选自脂族和环脂族树脂。
AB3.前述实施方案中任一项的方法，其中使用成像设备检测该荧光发射。
AB3.a实施方案AB3的方法，其中使用包括相机的成像设备检测该荧光发射。
AB3.b实施方案AB3.a的方法，其中该相机是数码相机。
AB3.c实施方案AB3至AB3.b的方法，其中使用该荧光发射的数字图像确定该经包埋样品中该组织的位置。
AB4.前述实施方案中任一项的方法，其中该方法用于确定组织表面的位置。
AB5.前述实施方案中任一项的方法，还包括在确定该组织表面的位置之后从该经包埋样品切下切片。
AB5.a实施方案AB5的方法，还包括从经包埋样品切下切片并基于确定的组织表面的位置接受或拒绝该切片。
AB6.前述实施方案中任一项的方法，其中该包埋介质在被辐照时基本上不展现荧光。
AB7.前述实施方案中任一项的方法，其中用波长为从200nm至600nm、优选250nm至550nm、更优选300nm至550nm、或甚至更优选300nm至500nm的光辐照该经包埋样品。
AB8.前述实施方案中任一项的方法，其中该经包埋样品在从300nm至600nm的波长处具有最大荧光发射。
AB9.前述实施方案中任一项的方法，其中该荧光发射是通过该组织的组分的自发荧光产生的。
AB9.a实施方案AB9的方法，其中该组分是胶原蛋白、弹性蛋白、色氨酸、卟啉、黄素、NADH、吡哆辛、脂色素、或其组合。
AB9.b实施方案AB9的方法，其中该组分在从300nm至550nm的波长处具有最大荧光发射。
AB10.前述实施方案中任一项的方法，其中该辐照是多次进行的，并且其中在每次辐照之前切割经包埋样品。
AB11.前述实施方案中任一项的方法，其中该组织是人组织。
AB12.前述实施方案中任一项的方法，其中该组织是动物组织。
AB12.a实施方案AB12的方法，其中该组织是小鼠、大鼠、狗、或灵长类组织。
AB13.前述实施方案中任一项的方法，其中该组织来自器官或解剖部位。
AB13.a前述实施方案中任一项的方法，其中该组织分离自乳房、前列腺、肺、结肠、直肠、膀胱、子宫体、甲状腺、肾、口腔(例如扁桃体)、胰腺、肝脏、子宫颈、胃、小肠、脑、脊髓、心脏、骨、关节、食管、胆囊、脂肪、皮肤、脾脏、胎盘、阴茎、尿道、输卵管、卵巢、外阴、肾上腺、阑尾、或眼睛。
AB14.前述实施方案中任一项的方法，其中该组织是来自人或动物来源的沉淀细胞。
AB15.前述实施方案中任一项的方法，其中该组织是患病或健康组织。
AB16.前述实施方案中任一项的方法，其中该组织用于鉴定癌症、传染病、代谢疾病、退行性疾病、炎性疾病、或其组合。
AB17.前述实施方案中任一项的方法，其中进行本发明的方法以定位经包埋组织以用于在荧光原位杂交(FISH)测试方法中使用。
AB18.前述实施方案中任一项的方法，其中进行本发明的方法以定位经包埋组织以用于在显色原位杂交(CISH)测试方法中使用。
AB19.前述实施方案中任一项的方法，其中定量测量一种或多种内源物质的自发荧光以确定该经包埋样品中该组织的位置。
AB20.前述实施方案中任一项的方法，其中使用数字图像的像素强度确定该经包埋样品中该组织的位置。
AB21.前述实施方案中任一项的方法，其中该方法包括对该经包埋样品进行切片或修整。
AB21.a.前述实施方案中任一项的方法，其中该方法包括用至少一种染色剂对组织切片进行染色，其中该组织切片是通过对该经包埋样品进行切片或修整获得的。
AB22.前述实施方案中任一项的方法，其中该包埋介质包括荧光染料。
AB23.前述实施方案中任一项的方法，其中对该经包埋样品用两个或更多个光源辐照。
AB24.前述实施方案中任一项的方法，其中使用选自发光二极管、汞弧灯、氙弧灯、激光器、及其组合的光源来辐照该经包埋样品。
AB25.前述实施方案中任一项的方法，其中该方法包括横向地正面照射该经包埋样品。
AB25.a实施方案AB25的方法，其中以与该经包埋样品的一面的平面成约10度至约20度的斜角正面照射该经包埋样品。
C1.一种用于从经包埋样品切下组织切片的装置，该装置包括：
切片机，其包括适配为用于线性运动的样品架、刀具架、和由该刀具架保持的与该样品架相对的刀具，使得当该样品架线性移动时，由该样品架保持的样品被该刀具切片以形成组织切片；
指向该样品架的至少一个光源；以及
光学系统，其被定位为可捕获来自由该样品架保持的样品的发射光。
C2.实施方案C1的装置，其中该光学系统包括相机。
C2.a实施方案C2的装置，其中该相机是数码相机。
C2.b实施方案C2或C2.a的装置，其中该相机是在每个像素前具有微滤光器的多色相机。
C3.实施方案C1的装置，其还包括处理器，该处理器与该光学系统通信并被配置为基于来自该样品的荧光发射提供信号。
C4.实施方案C1至C3的组织，该至少一个光源是LED光源、汞弧灯、氙弧灯、或激光器。
C5.实施方案C1至C4的装置，该光学系统包括至少两个光源、至少三个光源、或至少四个光源。
C6.实施方案C1至C5的装置，其中该装置包括具有带激发和发射滤光器的二向色分束器的滤光器立方体。
C6.a实施方案C6的装置，其中该装置包括在二向色滤光器之后的另外的透镜，以将发射光聚焦到成像传感器上。
C7.实施方案C1至C6.a的装置，其中该装置包括滤光器立方体组件中的发射滤光器，其中至少一个激发源的切换器切换至少一个滤光器。
C8.实施方案C1至C7的装置，其中该装置包括一个或多个激发滤光器。
C9.实施方案C1至C8的装置，其中该装置包括光圈。
C9.a实施方案C9的装置，其中该光圈是高数值光圈。
C10.实施方案C1至C9.a的装置，该装置包括一个或多个发射滤光器。
C11.实施方案C1至C10的装置，其中该装置包括成像透镜。
C12.实施方案C1至C4的装置，其中该装置包括切片机刀片、至少一个光源、至少一个激发滤光器、至少一个光圈、至少一个发射滤光器、透镜组件、以及至少一个相机。
C13.实施方案C1至C4的装置，其中该装置包括切片机刀片、至少两个光源、至少两个激发滤光器、至少一个光圈、至少两个发射滤光器、透镜组件、至少一个相机、以及至少一个用于发射滤光器之间切换的机构。
C14.实施方案C1至C4的装置，其中该装置包括切片机刀片、至少两个光源、至少两个激发滤光器、至少一个光圈、双带带通发射滤光器、透镜组件、以及至少一个多色相机。
C14.a实施方案C14的装置，其中该多色相机在每个像素前具有微滤光器。
C15.实施方案C1至C4的装置，其中该装置包括切片机刀片、至少一个光源、至少一个激发滤光器、至少一个光圈、物镜组件、镜筒透镜或中继透镜、二向色分束器、至少一个发射滤光器(在滤光器立方体组件中)、以及至少一个相机。
本申请还涉及以下实施方案：
1.一种确定经包埋样品中组织的位置的方法，该方法包括：
用波长为从约200nm至约600nm的光辐照经包埋样品，其中该经包埋样品包括组织和包埋介质；
检测该经包埋样品的荧光发射；并且
基于该荧光发射确定该经包埋样品中该组织的至少一部分的位置。
2.实施方案1的方法，其中该包埋介质是石蜡。
3.实施方案1的方法，其中该经包埋样品是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织块。
4.实施方案1-3中任一项的方法，其中使用包括相机的成像设备检测该荧光发射。
5.实施方案4的方法，其中使用该荧光发射的数字图像确定该经包埋样品中该组织的位置。
6.实施方案5的方法，其中使用该数字图像的像素强度确定该经包埋样品中该组织的位置。
7.实施方案1-6中任一项的方法，其中该方法用于确定组织表面的位置。
8.实施方案7的方法，其还包括在确定该组织表面的位置之后从该经包埋样品切下或修整切片。
9.实施方案8的方法，其中该方法包括用至少一种染色剂对该组织切片进行染色。
10.实施方案1-9中任一项的方法，其中该光具有从约250nm至约450nm的波长。
11.实施方案1-10中任一项的方法，其中该荧光发射是通过该组织的组分的自发荧光产生的。
12.实施方案11的方法，其中该组分是弹性蛋白或胶原蛋白。
13.一种确定经包埋样品中组织的位置的方法，该方法包括：
用至少一个光源辐照包括组织和包埋介质的经包埋样品以产生第一荧光发射和第二荧光发射；
检测该第一荧光发射和该第二荧光发射；并且
基于该第一荧光发射和该第二荧光发射确定该经包埋样品中该组织的至少一部分的位置。
14.实施方案13的方法，其中由至少两个光源辐照该经包埋样品。
15.实施方案13的方法，其中该经包埋样品是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织块，并且该第一荧光发射经由石蜡的荧光发生。
16.实施方案13-15中任一项的方法，其中该方法包括横向地正面照射该经包埋样品。
17.实施方案13-16中任一项的方法，其中以与该经包埋样品的一面的平面成约10度至约20度的斜角正面照射该经包埋样品。
18.一种用于从经包埋样品切下组织切片的装置，该装置包括：
切片机，其包括适配为用于线性运动的样品架、刀具架、和由该刀具架保持的与该样品架相对的刀具，使得当该样品架线性移动时，由该样品架保持的样品被该刀具切片以形成组织切片；
指向该样品架的至少一个光源；以及
光学系统，其被定位为捕获来自由该样品架保持的样品的发射光。
19.实施方案18的装置，其中该光学系统包括相机。
20.实施方案18或19的装置，其还包括处理器，该处理器与该光学系统通信并被配置为基于来自该样品的荧光发射提供信号。
结合所附权利要求，本发明的方法和装置的这些和其他特征和优点将从以下详细描述中变得清楚。
附图说明
当与附图一起阅读时，从以下详细描述中可最好地理解本发明。这些特征不一定按比例绘制。
图1A和图1B示出完全包埋在石蜡中的组织样品(图1A)和包埋在石蜡中并被修整以暴露组织的一部分的组织样品(图1B)的照片。
图2示出显示福尔马林固定的石蜡包埋块中的组织的例子的照片，其中在块样品中的组织与石蜡无法区分。
图3A和图3B示出使用明视野分析(图3A)和暗视野分析(图3B)，在福尔马林固定的石蜡包埋组织块中的组织与石蜡之间的界面的图像。
图4A和图4B示出人体组织内源性的各种荧光团的激发光谱(图4A)和发射光谱(图4B)的图。每个图示出光的波长对荧光强度。
图5示出在4X放大倍数下福尔马林固定的石蜡包埋块的块面的荧光发射的荧光图像的集合。在切片之间通过将福尔马林固定的石蜡包埋的组织块样品的荧光成像而获得图像。
图6是表示每次从组织块切割切片后，在福尔马林固定的石蜡包埋组织块中的弹性蛋白和胶原蛋白的自发荧光的图像的像素强度的图。
图7A-图7D示出根据本申请的实施方案的基于荧光的成像系统的硬件图。
图8A是包括单个组织的福尔马林固定的石蜡包埋组织块样品的各切片的荧光发射图像的集合。使用具有560nm 55nm带通发射滤光器的365nm激发源获得图像。图8B是使用280nm激发源和405nm 20nm宽带通发射滤光器获得的相同FFPE切片的荧光发射图像的集合。
具体实施方式
定义的术语
应当理解，本申请使用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的，而不意图限制。除了定义的术语的技术和科学含义之外，所定义的术语是本发明的技术领域中通常理解和接受的术语。
术语“自发荧光”是指生物分子例如蛋白质的自然发光。
术语“荧光团”是指在用光激发时可以重新发光的荧光化合物。术语“内源性荧光团”是指能够自发荧光的天然存在的生物物质。
“固定的”组织是已与固定剂接触一段合适时间的组织。
“经包埋组织”或“经包埋样品”是部分或完全被包埋介质(例如石蜡或环氧树脂)包围的组织样品。本申请的经包埋组织或经包埋样品不应与由对包埋组织进行切片或修整所产生的组织切片混淆。
术语“福尔马林固定的石蜡包埋块”或“福尔马林固定的石蜡包埋样品”或“FFPE样品”是指包埋在石蜡中的经福尔马林处理的组织。
术语“像素强度”或“像素强度值”可互换使用，并且是指在数字图像中的感兴趣区域上检测到的荧光信号平均值。在采集数字图像期间，在每个像素检测到的光子都会转换为与检测到的光子数成比例的强度值。像素强度可用于确定样本中荧光团的局部浓度。
如在说明书和所附权利要求中所使用的，并且除了其普通含义之外，术语“基本”或“基本上”是指在本领域普通技术人员可接受的限度或程度之内。例如，“基本上取消”意为本领域技术人员认为取消是可接受的。
如在说明书和所附权利要求中所使用的，并且除了其普通含义之外，术语“大致”和“约”是指在本领域普通技术人员可接受的限度或量之内。术语“约”通常是指±所指数字的15％。例如，“约10”可指示8.5至11.5的范围。例如，“大致相同”意为本领域普通技术人员认为被比较的项目是相同的。
在本申请中，数值范围包括定义该范围的数字。在本申请中，无论何处找到词语“包括”，应设想可以在其位置中使用词语“本质上由……组成”或“由……组成”。
除非另外定义，否则本申请所使用的全部技术和科学术语具有与本申请所涉及领域的技术人员通常所理解的相同含义。
发明详述
提供了允许人们将经包埋样品中的组织与包埋介质区分开的方法。图1示出完全包埋在石蜡中的组织(1A)和相应的经修整样品(1B)。为了确定用于修整的组织的位置，通常在视觉上评估包埋介质中的组织以鉴定组织与包埋介质之间的界面。在很多情况下，难以直观地鉴定组织与包埋介质之间的界面。这样的例子示于图2中，其中FFPE样品中的组织与石蜡包埋介质无法区分。图3A和图3B示出使用明视野分析(图3A)和暗视野分析(图3B)获得的在福尔马林固定的石蜡包埋组织块中的组织与石蜡之间的界面的图像。在一些情况下，使用此类方法可能难以鉴定组织与包埋介质之间的界面。本发明的方法和装置解决了这个问题，其利用荧光来定位经包埋样品中的组织。
与现有方法相反，本发明的方法利用组织中的内源性荧光团的自发荧光来区分组织与包埋介质(例如石蜡或环氧树脂)。组织与包埋介质之间的鲜明对比可以通过以适当的波长辐照经包埋样品例如福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织块并检测所得到的荧光发射来实现。荧光发射可用于确定组织的至少一部分的位置。例如，本发明的方法可用于定位在福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织块中组织的表面。在包埋样品中定位组织之后，可以通过修整或切片来进一步处理组织以获得一个或多个组织切片。在组织切片的生物分析或染色之前进行本申请的荧光方法。本申请的方法对各种组织类型均有效，并且在正常照明条件下在组织与包埋介质在光学上无法区分的情况下，可用于将组织与石蜡区分开。
荧光是通过已吸收电磁辐射的物质发射的光，通常用于阐明分析物的存在或量。荧光化合物在某些条件下能够吸收和发射光，其中发射光通常具有较低的能量。自发荧光是当以特定波长辐照生物分子时该分子的自然发光(通常在波长峰或图案)。每种荧光生物分子都有其自身的激发和发射光谱。在人类和动物组织中，蛋白质例如胶原蛋白和弹性蛋白能够自发荧光。图4A示出许多生物分子的激发光谱，并且图4B示出相同的这些生物分子的发射光谱。蛋白质可以作为内源性荧光团，并且可以通过监测蛋白质的荧光发射来检测或追踪。
在一个实施方案中，本申请提供了一种确定经包埋样品中组织的位置的方法。该方法包括用波长为例如从约200nm至约600nm的光辐照经包埋样品，其中该经包埋样品包括组织和包埋介质；检测该经包埋样品的荧光发射；并且基于该荧光发射确定在该经包埋样品中该组织的至少一部分的位置。
在一些实施方案中，包埋介质是石蜡。在一些实施方案中，包埋介质是环氧树脂。
在一些实施方案中，使用成像设备检测荧光发射。在一些实施方案中，成像设备包括例如数码相机的相机。在此类情况下，用光辐照包括组织和包埋介质(例如石蜡)的经包埋样品，并使用数码相机拍摄所得到的荧光发射。数字图像中荧光的存在指示组织存在于正在研究的样品中。在一些实施方案中，本申请的方法是使用包括数码相机和切片机的光学系统进行。在一些实施方案中，本申请的方法是使用荧光显微镜进行。
在一些实施方案中，当以选定波长辐照时，包埋介质基本上不展现荧光。
本申请的方法可以用于分析任何类型的组织。在一些实施方案中，该组织是人组织。在一些实施方案中，该组织是动物组织。在一些实施方案中，该组织是小鼠、大鼠、狗或灵长类动物组织。本申请的方法可用于分析来自任何器官或解剖部位的组织切片。在一些实施方案中，该组织分离自乳房、前列腺、肺、结肠、直肠、膀胱、子宫体、甲状腺、肾、口腔(例如扁桃体)、胰腺、肝脏、子宫颈、胃、小肠、脑、脊髓、心脏、骨、关节、食管、胆囊、脂肪、皮肤、脾脏、胎盘、阴茎、尿道、输卵管、卵巢、外阴、肾上腺、阑尾、或眼睛。在一些实施方案中，该组织是来自人类或动物来源的沉淀细胞。在一些实施方案中，本申请的方法用于测试患病或健康组织。在一些实施方案中，本申请的方法用于鉴定癌症、传染病、代谢疾病、退行性疾病、炎性疾病、或其组合。
在一些实施方案中，经包埋样品是福尔马林固定的石蜡包埋样品。福尔马林固定的石蜡包埋样品可以由任何类型的石蜡形成。在一些实施方案中，石蜡是完全精制的石蜡与合成树脂或聚合物的共混物。在一些实施方案中，石蜡包含二甲亚砜(DMSO)。在一些实施方案中，福尔马林固定的石蜡包埋样品是由粒化石蜡、完全精制的石蜡、半精制石蜡、或其组合形成。因此，在一些实施方案中，在福尔马林固定的石蜡包埋样品中，组织可以与粒化石蜡、完全精制石蜡、或半精制石蜡区分开。在一些实施方案中，福尔马林固定的石蜡包埋样品是由Spectrum石蜡、Millipore石蜡、Fisherfinest Histopath石蜡、EMS Paramat、Paraplast、Polyfin、Sakura Finetek Tissue Tek VIP、Leica Surgipath Paraplast、或其组合形成。
在一些实施方案中，包埋介质是环氧树脂。在一些实施方案中，环氧树脂是缩水甘油基环氧树脂。在一些实施方案中，环氧树脂是非缩水甘油基环氧树脂。在一些实施方案中，环氧树脂是选自脂族和环脂族树脂的非缩水甘油基树脂。在一些实施方案中，环氧树脂是选自缩水甘油胺、缩水甘油酯、缩水甘油醚、及其组合的缩水甘油基环氧树脂。在一些实施方案中，环氧树脂是乙二醇二缩水甘油醚。在一些实施方案中，环氧树脂是Araldite、Quetol、Epon 812、Embed 812、Poly-Bed 812、或其组合。在一些实施方案中，环氧树脂是甘油基脂族环氧树脂。在一些实施方案中，将组织包埋在环氧树脂中提供了具有改善的形态的组织切片。
在一些实施方案中，经包埋样品被切割或切片以提供切片和经修整的块。在一些实施方案中，在切片机上对经包埋样品进行切片或修整。在一些实施方案中，当经包埋样品被切片机切片或修整时，检测经包埋样品的自发荧光。将经修整块用光辐照，并进行分析以确定荧光的存在。成像可用于确定荧光的存在。根据需要重复修整和/或辐照过程。例如，可以重复修整/辐照过程直到找到组织的表面。
在一些实施方案中，定量测量一种或多种内源性物质的自发荧光以确定经包埋样品中组织的位置。
在一些实施方案中，使用荧光数字图像的像素强度来确定经包埋样品中组织的位置。将经修整块用光辐照，并使用荧光显微镜采集数字图像。荧光显微镜系统包括将在荧光分析期间检测到的光子转换为像素强度值的软件，以允许用户确定感兴趣区域的像素强度。可以将经修整块进一步切片或修整，并通过荧光显微镜系统进行分析以提供第二数字图像。两个或更多个数字图像的像素强度的比较可用于确定经包埋样品中组织的位置。例如，两个数字图像之间像素强度值的增加可指示在经修整块中的组织已暴露并准备好被切割且用于生物测试。
在一些实施方案中，本申请的方法用于确定经包埋样品中组织样品的表面的位置。在一些实施方案中，本申请用于在经包埋样品中确定组织向包埋介质过渡或包埋介质向组织过渡的位置。在一些实施方案中，本申请的方法用于整体定位组织。
在一些实施方案中，该方法包括从经包埋样品切下切片并基于确定的组织表面的位置接受或拒绝该切片。在一些实施方案中，辐照是多次进行，并且在每次辐照之前切割经包埋样品。
组织中内源性物质的荧光发射可用于确定经包埋样品中组织的位置。组织中的任何内源性荧光团均可使用。在一些实施方案中，内源性荧光团是胶原蛋白、弹性蛋白、色氨酸、卟啉、黄素、NADH、吡哆辛、脂色素、或其组合。在一些实施方案中，使用胶原蛋白的荧光发射来确定经包埋样品中组织的位置。在一些实施方案中，使用弹性蛋白的荧光发射来确定经包埋样品中组织的位置。在一些实施方案中，使用色氨酸的荧光发射来确定经包埋样品中组织的位置。在一些实施方案中，使用胶原蛋白、弹性蛋白、和色氨酸中的一种或多种来确定经包埋样品中组织的位置。
在一些实施方案中，使用波长为从约320nm至约380nm的激发光来检测胶原蛋白自发荧光。在一些实施方案中，在从约375nm至约425nm的波长处检测胶原蛋白最大荧光发射。
在一些实施方案中，使用波长为从约320nm至约380nm的激发光来检测弹性蛋白自发荧光。在一些实施方案中，在从约400nm至约450nm的波长处检测弹性蛋白最大荧光发射。
在一些实施方案中，使用波长为从约180nm至约230nm的激发光来检测色氨酸自发荧光。在一些实施方案中，在从约300nm至约350nm的波长处检测色氨酸最大荧光发射。
经包埋样品可用具有任何合适波长的光辐照。在一些实施方案中，用波长为从约200nm至约600nm的光辐照经包埋样品。因此，在一些实施方案中，用波长为从约200nm至约600nm、从约200nm至约550nm、从约200nm至约500nm、从约200nm至约450nm、从约200nm至约400nm、从约200nm至约350nm、从约250nm至约600nm、从约250nm至约550nm、从约250nm至约500nm、从约250nm至约450nm、从约250nm至约400nm、从约300nm至约500nm、从约300nm至约550nm、从约300nm至约600nm、从约350nm至约600nm、从约400nm至约600nm、从约450nm至约600nm、从约350nm至约550nm、从约350nm至约500nm、从约400nm至约600nm、从约400nm至约550nm、或从约450nm至约600nm的光辐照经包埋样品。
经包埋样品的荧光发射可以在任何合适的波长(通常是最大发射波长)处检测。在一些实施方案中，经包埋样品在从约300nm至约600nm的波长处具有最大荧光发射。因此，在一些实施方案中，经包埋样品在从约300nm至约600nm、从约300nm至约550nm、从约300nm至约500nm、从约300nm至约450nm、从约300nm至约400nm、从约350nm至约600nm、从约350nm至约550nm、从约350nm至约500nm、从约350nm至约450nm、从约400nm至约600nm、从约450nm至约550nm、或从约500nm至约600nm的波长处具有最大荧光发射。
通常使用如本领域已知的光源和被配置为检测荧光的检测器进行荧光方法。在一些实施方案中，使用能够在特定波长或其范围处发光的光源进行荧光技术。在一些实施方案中，使用一个或多个光源辐照经包埋样品。在一些实施方案中，光源是发光二极管(LED)光源。在一些实施方案中，光源是汞弧灯。在一些实施方案中，光源是氙弧灯。在一些实施方案中，光源是激光器(LASER)。在一些实施方案中，使用具有一个或多个激发滤光器的荧光系统来进行本发明的方法。在一些实施方案中，荧光系统包括光圈和一个或多个发射滤光器。在一些实施方案中，荧光系统包括成像透镜和成像相机。
可以使用任何合适的方法形成经包埋样品。在一些实施方案中，从受试者获得组织并切片。将该组织与福尔马林溶液接触并在室温固定至少48小时。通常使用一系列乙醇浴对组织进行脱水，然后包埋在蜡块中。蜡通常包含链长为从约20至约40个碳的直链烷烃的混合物。在一些实施方案中，戊二醛被用作固定剂以将组织包埋在环氧树脂中。可以对经包埋样品切片(slice)或切段(section)以用于任何后续分析(例如，显微镜载玻片分析)。
在一些实施方案中，经包埋样品可以被进一步修整或切片以形成组织切片(section或slice)。可以使用任何合适的方法(例如，使用切片机刀片)对经包埋样品进行修整或切片。在一些实施方案中，清洁剂例如二甲苯可用于从该切片除去包埋介质。在一些实施方案中，使用至少一种染色剂例如苏木精和/或伊红、酸性/碱性品红、或革兰氏染色剂对组织切片进行染色。在一些实施方案中，组织切片可以安装到载玻片上以用于分析。可以使用任何合适的方法使染色的组织切片经历进一步分析(例如，使用显微镜进行病理分析)。
在一些实施方案中，进行本申请的方法以定位经包埋组织以用于在荧光原位杂交(FISH)测试方法中使用。在一些实施方案中，进行本申请的方法以定位经包埋组织以用于在显色原位杂交(CISH)测试方法中使用。
在另一个实施方案中，本申请提供了一种通过以下方式确定经包埋样品中组织的位置的方法：用至少一个光源辐照包括组织和包埋介质的经包埋样品以产生第一荧光发射和第二荧光发射；检测该第一荧光发射和该第二荧光发射；并且基于该第一荧光发射和该第二荧光发射确定该经包埋样品中该组织的至少一部分的位置。
在一些实施方案中，用波长为从约250nm至约325nm的光辐照经包埋样品。在一些实施方案中，用波长为从约300nm至约400nm的光辐照经包埋样品。在一些实施方案中，在两个波长处同时辐照经包埋样品。在一些实施方案中，明视野显微镜与本申请的方法结合使用以确定经包埋样品中组织的位置。
在一些实施方案中，第一荧光发射是通过在经包埋样品中的包埋介质(例如石蜡)的荧光产生的。在一些实施方案中，第二荧光发射是通过存在于经包埋样品中的组织组分的自发荧光产生的。在一些实施方案中，第一荧光发射在从约375nm至约425nm的波长处具有最大荧光，并且第二荧光发射在从约500nm至约600nm的波长处具有最大荧光。
在一些实施方案中，使用两个或更多个(例如两个、三个、四个、五个、或六个)光源来辐照经包埋样品。在一些实施方案中，该两个或更多个光源是相同的。在一些实施方案中，该两个或更多个光源是不同的。在一些实施方案中，对样品同时或分别由该两个或更多个光源辐照。
在一些实施方案中，该方法是在不存在二向色滤光器的情况下进行。
在一些实施方案中，该方法包括横向地正面照射经包埋样品，例如以与该经包埋样品的一面的平面成约10度至约20度的斜角来正面照射。在一些实施方案中，通过具有高数值光圈(high numerical aperture)的透镜收集荧光发射。在一些实施方案中，来自两个或更多个横向方向(例如，左或右或顶部或底部)的照射产生均匀的激发和发射模式。
在一些实施方案中，高数值光圈物镜用于发射光的激发和收集，以及具有带激发和发射滤光器的二向色分束器的滤光器立方体。在一些实施方案中，在二向色滤光器之后使用另外的透镜以将发射光聚焦到成像传感器上。
在一些实施方案中，包埋介质具有弱荧光。因此，在一些实施方案中，可以将荧光染料添加至包埋介质中。荧光染料在与组织样品中内源性荧光团的发射波长不同的波长处发射光，因此来自荧光染料的荧光发射可用于确定经包埋样品中组织的位置。可以在形成经包埋样品之前将荧光染料掺入到包埋介质中。
在另一个实施方案中，本申请提供了一种用于从经包埋样品切下组织切片的装置。该装置包括：切片机，该切片机包括适配为用于线性运动的样品架、刀具架、和由该刀具架保持的与该样品架相对的刀具，使得当该样品架线性移动时，由该样品架保持的样品被该刀具切片以形成组织切片；指向该样品架的至少一个光源；以及光学系统，其被定位为可捕获来自由该样品架保持的样品的发射光。
在一些实施方案中，该装置包括至少两个光源。在一些实施方案中，该装置包括至少三个光源。在一些实施方案中，该装置包括至少四个光源。
在一些实施方案中，该装置包括具有带激发和发射滤光器的二向色分束器的滤光器立方体。在一些实施方案中，该装置包括二向色滤光器。在一些实施方案中，该装置包括在二向色滤光器之后的另外的透镜，其用以将发射光聚焦到成像传感器上。在一些实施方案中，该装置包括滤光器立方体组件中的发射滤光器，其中至少一个激发源的切换器切换至少一个滤光器。
在一些实施方案中，该装置包括一个或多个激发滤光器。在一些实施方案中，该装置包括光圈。在一些实施方案中，该装置包括具有高数值光圈的透镜。在一些实施方案中，该装置包括一个或多个发射滤波器。在一些实施方案中，该装置包括成像透镜。在一些实施方案中，该光学系统包括相机。在一些实施方案中，该光学系统包括数码相机。在一些实施方案中，该光学系统能够检测至少一种荧光发射。
在一些实施方案中，该装置包括切片机刀片、至少一个光源、至少一个激发滤光器、至少一个光圈、至少一个发射滤光器、透镜组件、以及至少一个相机。
在一些实施方案中，该装置包括切片机刀片、至少两个光源、至少两个激发滤光器、至少一个光圈、至少两个发射滤光器、透镜组件、至少一个相机、以及至少一个用于发射滤光器之间切换的机构。
在一些实施方案中，该装置包括切片机刀片、至少两个光源、至少两个激发滤光器、至少一个光圈、双带带通发射滤光器、透镜组件、以及至少一个多色相机。在一些实施方案中，该多色相机在每个像素前具有微滤光器。
在一些实施方案中，该装置包括切片机刀片、至少一个光源、至少一个激发滤光器、至少一个光圈、物镜组件、镜筒透镜或中继透镜、二向色分束器、至少一个发射滤光器(在滤光器立方体组件中)、至少一个相机。在一些实施方案中，激发源之间的切换伴随着切换滤光器。
图7A-图7D示出基于荧光的成像系统的非限制性实例。每个系统包括切片机刀片、一个或多个光源、一个或多个激发滤光器、二维光圈、一个或多个发射滤光器、成像透镜、以及成像相机。图7A示出了根据本申请的一个实施方案的可用于对经包埋样品703成像的单色荧光成像系统701，该单色荧光成像系统701包括切片机刀片705、LED光源707、激发滤光器709、光圈711、发射滤光器713连同用于切换发射滤光器的机构、透镜组件715、以及相机717。图7B示出了根据本申请的一个实施方案的可用于对经包埋样品721成像的双色荧光成像系统719，该双色荧光成像系统719包括切片机刀片723、LED光源725、激发滤光器727、光圈729、具有机动轮组件的发射滤光器731、透镜组件733、以及相机735。图7C示出了根据本申请的一个实施方案的可用于对经包埋样品739成像的双色荧光成像系统737，该双色荧光成像系统737包括切片机刀片741、LED光源743、激发滤光器745、光圈747、双色带通发射滤光器749、透镜组件751、具有多色图像传感器755的彩色相机753。图7D示出了根据本申请的一个实施方案的可用于对经包埋样品759成像的荧光成像系统757，该荧光成像系统757包括切片机刀片761、LED光源763、光圈765、激发滤光器767、物镜组件769、二向色分束器771、发射滤光器773、镜筒透镜或中继透镜775、以及相机777，其中激发源的切换伴随着切换滤光器。
在一些实施方案中，该光学系统包括处理器，该处理器与该光学系统通信并被配置为基于来自该样品的荧光发射提供信号。
应当理解的是，本申请的教导并不限于所描述的具体实施方案，因为这些当然可以改变。还应当理解的是，因为本申请的范围将仅由所附权利要求限制，所以本申请所使用的术语仅是出于描述具体实施方案的目的，而不旨在是限制性的。
如本申请所公开的，提供了多个数值范围。应当理解的是，每个中间值，到下限的十分之一个单位(除非上下文清晰地另外指示)，在该范围的上限与下限之间的，也被确切披露。在所述范围中的任何所述值或中间值与在该所述范围中的任何其他所述值或中间值之间的每个更小范围都涵盖在本申请内。这些更小范围的上限和下限可以独立地被该范围包括或排除，并且其中任一个限值、两个限值均不或两个限值均被包括在更小范围中的每个范围也被涵盖在本申请内，服从于所述范围中任何确切排除的限值。在所述范围包括一个或两个限值的情况下，排除了那些被包括的限值的任一个或两个的范围也被包括在本申请内。
除非另外定义，本申请所用的全部技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。尽管类似于或等同于本申请所描述的方法和材料的任何方法和材料也可用于对本申请的实践或测试，但是现在将对一些示例方法和材料进行描述。
本申请引用的所有专利和出版物均明确地通过引用并入。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开，并且不应当解释为承认本申请的权利要求无权早于这种出版物。另外，所提供的出版物的日期可以不同于实际公开日期，所述实际公开日期可被独立确认。
如在本说明书和所附权利要求中所用的，术语“一个”、“一种”和“该”包括单数和复数指示物二者，除非上下文清楚地另外指明。
在阅读本申请之后，如对于本领域的普通技术人员将清楚的是，本申请所描述和说明的单独实施方案中的每个实施方案具有不连续的组分和特征，所述组分和特征可以在不偏离本申请的范围或精神的情况下易于与任何其他若干实施方案的特征分离或组合。可以按所叙述的事件的顺序或按逻辑上可能的任何其他顺序来执行所叙述的任何方法。
实施例1
此实施例说明根据本申请的实施方案的一种测量人组织中内源性荧光团的荧光的方法。
获得FFPE人组织块。分析FFPE块以确定自发荧光是否可用于区分FFPE块中的组织与石蜡。使未切割的FFPE块经受与弹性蛋白和胶原蛋白的激发波长对应的光。使用数字成像检测任何所产生的荧光发射。使用ThermoFisher切片机刀片切割FFPE块，其中对FFPE块的连续切割是以范围为5微米至40微米厚度的间隔进行。在每次切割后，使FFPE块的块面经受与弹性蛋白和胶原蛋白的激发波长相对应的光，并且使用数字成像检测荧光发射。以4倍放大倍数收集图像。记录并绘制每个图像的像素强度。
在实验中，使用X-Cite 120Q作为光源。使用具有470nm/525nm的激发/发射光谱(带通40nm)的针对荧光素或绿色荧光蛋白(GFP)的Zeiss Filter Set 38检测弹性蛋白的荧光。使用具有365nm/445nm的激发/发射光谱(带通50nm)的针对DAPI的Zeiss Filter Set49检测胶原蛋白的荧光。GFP和DAPI的曝光时间分别为65毫秒和175毫秒。使用Zeiss AxioImager M2可视化FFPE样品中自发荧光的存在。使用AxioCAM MRM获得自发荧光的图像。
实验结果示于图5中。绘制了切割号与每个图像的像素强度的图，如图6所示。
图5示出FFPE块中的组织的荧光成像可用于检测和定位FFPE块中的组织。另外，如图6所示，当使用GFP和DAPI二者时，针对未切割的FFPE块的200个像素增加到表面处理的块的超过1,000个像素。基于这些结果，据信可以利用观察到的像素强度增加来确定何时组织暴露并且准备好切割并用于生物测试。
实施例2
此实施例说明根据本申请的实施方案的使用石蜡的荧光发射来反衬出组织的方法。
获得FFPE人组织块。分析FFPE块以确定石蜡的荧光是否可用于区分FFPE块中的组织与石蜡。具体而言，进行实验以确定在组织中存在内源性荧光团的情况下是否可以获得石蜡荧光的图像。使用具有中心在560nm的发射滤光器(55nm带通)的365nm LED激发源测量FFPE样品中组织的荧光强度。使用280nm LED激发源和中心在405nm的发射滤光器(20nm宽带通)测量FFPE样品中组织周围的石蜡的荧光强度。
为了收集该数据，两个激发源均以与面部平面成10度和20度之间的斜角横向正面照射块。不需要二向色滤光器。通过具有高数值光圈的透镜收集发射光，透镜看起来垂直于块的一面。从两个或更多个横向方向(例如左和右或顶部和底部)的照明产生更均匀的激发和发射模式。
图8A示出在石蜡的存在下，使用365nm激发源以及中心在560nm的发射滤光器(55nm宽带通)的组织荧光图像。图8B示出使用280nm激发源和中心在405nm的发射滤光器(20nm宽带通)的石蜡荧光。如图8B所示，石蜡可以在经包埋样品中在没有可感知的组织荧光的情况下发生(undergo)荧光。结果指示组织与石蜡之间的对比可以通过检查石蜡区域中的荧光进一步增强。
鉴于本申请，应注意所述方法和装置可以是根据本申请实施的。此外，各种组分、材料、结构和参数仅作为说明和示例被包括，而不具有任何限制意义。鉴于本申请，本申请可以在其他应用中实施，并且可以确定用以实施这些应用的组分、材料、结构和设备，同时仍然在所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种确定经包埋样品中组织的位置的方法，该方法包括：
用波长为从约200nm至约600nm的光辐照经包埋样品，其中该经包埋样品包括组织和包埋介质；
检测该经包埋样品的荧光发射；并且
基于该荧光发射确定该经包埋样品中该组织的至少一部分的位置。
2.权利要求1的方法，其中该经包埋样品是福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织块。
3.权利要求1的方法，其中使用包括相机的成像设备检测该荧光发射。
4.权利要求3的方法，其中使用该荧光发射的数字图像确定该经包埋样品中该组织的位置。
5.权利要求4的方法，其中使用该数字图像的像素强度确定该经包埋样品中该组织的位置。
6.权利要求5的方法，其还包括在确定该组织表面的位置之后从该经包埋样品切下或修整切片。
7.权利要求6的方法，其中该方法包括用至少一种染色剂对该组织切片进行染色。
8.权利要求1的方法，其中该光具有从约250nm至约450nm的波长。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中该荧光发射是通过该组织的组分的自发荧光产生的。
10.权利要求9的方法，其中该组分是弹性蛋白或胶原蛋白。
CN201810834808.8A 2017-07-27 2018-07-26 使用基于荧光的检测制备组织切片 Pending CN109307662A (zh)

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