CN109293942B - 一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法 - Google Patents

一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法 Download PDF

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Abstract

一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,涉及一种核桃壳预处理方法。是要解决由于核桃壳中酸不溶木素含量高难于生物降解的问题。方法:一、物理预处理:对核桃壳进行物理研磨,过筛,得到核桃壳粉末;二、化学预处理:将经过物理处理后的核桃壳粉末中加入碱液处理;三、然后滤去碱液,蒸馏水洗涤,经抽滤后,调节pH值,烘干至恒重,即完成。本发明通过联用物理‑化学预处理,物理预处理使得木质素和半纤维素与纤维素的结合层被部分破坏,后续化学处理又使得原料变得多孔,内表面积进一步增大,有利于增大木质素与酶或其他化学物质的接触面积。进而提高生物降解效果。本发明用于天然木质纤维素降解领域。

Description

一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法
技术领域
本发明涉及一种核桃壳预处理方法。
背景技术
目前,资源、能源危机已日益突出,如何高效利用农林废弃物已成为世界各国关注的焦点,而核桃是当今世重要的油料、干果树种之一,是世界公认的良好生态、经济型树种,在我国22个省区均有种植,主要产区在云南、陕西、山西、四川、河北、甘肃、新疆、安徽等省。以云南为例,其为我国著名的核桃主产区,目前云南核桃种植面积达4280万亩,产量102万吨,产值305亿元,其省内90%以上的县(市、区)种植核桃。核桃壳是核桃取仁后的废弃物,若取仁率按55%计算,则云南每年至少产生核桃壳56.10万吨。而2016年全球核桃市场产量为725.21万吨(较2015年的692.55万吨增长4.72%),预计未来产量将持续增长,如此一来将至少产生380.90万吨的核桃壳废弃物,若将大量集中的核桃壳丢弃或焚烧,将导致严峻的环境污染问题并造成严重的资源浪费。基于上述资源、能源危机和环境问题,如何利用和处置农林废弃物、发展绿色经济已成为各国关注的研究焦点。
人们对农林废弃物核桃壳的综合利用展开了研究,如从核桃壳中提取棕色素用于食品加工业。此外,核桃壳还可用作滤料、堵漏材料、生产抗氧化剂和活性炭等。但核桃壳经过资源综合利用后很可能带来二次污染,譬如用作吸附材料的核桃壳粉仍需要进行处理,相同的问题也发生在许多核桃壳资源化方式。获得高效、经济的核桃壳废料生物降解方式可对核桃壳无害化处理有显著的影响,而核桃壳木质素组成成分主要是酸不溶木素(依品种不同含量略有差别,但是均高于50%),其含量大大高于针叶材、阔叶材,纤维素含量却明显低于针、阔叶材、麦草和花生壳等材料,导致其与其他天然木质纤维素相比更加难以生物降解。
发明内容
本发明是要解决由于核桃壳中酸不溶木素含量高,难于生物降解的问题,提供一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法。
本发明提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,包括以下步骤:
一、物理预处理:
去除核桃壳中杂质,对核桃壳进行物理研磨,过筛,得到粒径为60-80目的核桃壳粉末;
二、化学预处理:
将经过步骤一处理后的核桃壳粉末中加入碱液,于55~65℃下处理46~50h;所述碱液为质量浓度6%~10%的Ca(OH)2溶液;其中核桃壳粉末与碱液的体积比为1:(0.9~1.1);
三、然后滤去碱液,蒸馏水洗涤残渣至pH值不再发生变化,经抽滤后,调节pH值至6~7,于55~65℃下烘干至恒重,即完成。
步骤三中使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节pH值,所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为0.1mol/L,pH值为3。
步骤三中烘干的具体方法为:放入鼓风干燥箱中干燥。
本发明的有益效果:
本发明通过联用物理-化学预处理,物理预处理可以使得木质素和半纤维素与纤维素的结合层被部分破坏,聚合度降低,并提高比表面积,后续化学处理又使得原料变得多孔,内表面积进一步增大,有利于增大木质素与酶或其他化学物质的接触面积。进而提高生物降解效果。
将木质纤维素类原料进行粉碎处理,原料的各组分均被保留,且没有量上的变化。但木质素和半纤维素与纤维素的结合层被部分破坏,三者的聚合度降低,而且纤维素的结晶结构也部分被破坏。机械粉碎也能提高基质的表面积,使得裸露的表面的结合点增加。
碱预处理改变木质纤维素基质的结构主要通过以下两种方法:(1)溶胀纤维素;(2)去除木质素和半纤维素。碱预处理过程中,木质素中的酯键在碱性条件下易分解,醚键也可以在相对高温破坏,这些官能团的变化明显促进木质素的溶解,导致更为有效的木质素酶的接触。经过碱处理后的物料更具有多孔性,因此,碱处理后的基质更适合丝状真菌的生长。
当采用物理-化学联合预处理时,其对菌株诱导产生木质素酶的效果远高于单独采用物理预处理和单独采用化学预处理。物理-化学联合预处理时,烟曲霉的Lac、Mnp和Lip分别为原酶活的578%、2548%和1074%,是仅物理预处理的5.89倍、5.12倍和3.82倍,是仅化学预处理的1.74倍、4.70倍和2.62倍。通过联用物理-化学预处理,可以使得木质素和半纤维素与纤维素的结合层先被物理处理部分破坏,聚合度降低,并提高比表面积,而后化学处理又进一步使得原料变得多孔,内表面积增大,两者共同作用极有利于增大木质素与酶或其他化学物质的接触面积。
进一步探究核桃壳高效降解的最佳核桃壳与大量营养盐溶液体积比发现,在核桃壳粒径为60-80目,Ca(OH)2的浓度为8%,核桃壳与大量营养盐溶液体积比1:1.5条件下,菌株产木质素酶活性最高,其Lac、Mnp和木Lip分别为原酶活的899%、5611%和2332%。
附图说明
图1为核桃壳未经过预处理且未进行生物降解的扫描电镜图像;
图2为未进行预处理进行生物降解的扫描电镜图像;
图3为预处理效果最佳未进行生物降解的扫描电镜图像;
图4为经过最佳预处理进行生物降解的扫描电镜图像;
图5是核桃壳在不同预处理及生物降解前后的傅里叶红外光谱图;
图6为核桃壳在不同预处理及生物降解前后的XRD结晶度谱图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式,还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一:本实施方式提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,包括以下步骤:
一、物理预处理:
去除核桃壳中杂质,对核桃壳进行物理研磨,过筛,得到粒径为60-80目的核桃壳粉末;
二、化学预处理:
将经过步骤一处理后的核桃壳粉末中加入碱液,于55~65℃下处理46~50h;所述碱液为质量浓度6%~10%的Ca(OH)2溶液;其中核桃壳粉末与碱液的体积比为1:(0.9~1.1);
三、然后滤去碱液,蒸馏水洗涤残渣至pH值不再发生变化,经抽滤后,调节pH值至6~7,于55~65℃下烘干至恒重,即完成。
采用物理预处理和化学预处理相结合,综合处理核桃壳。物理预处理的目的是通过降低其粒径或破坏其结构的规律性,增加木质素降解酶接触面积。天然木质素被粉碎之后,整体反应性能都可以得到提高,促进木质素酶对木质素的降解,提高一些化学试剂对木质素作用。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:步骤二中于60℃下处理47~49h。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:步骤二中所述碱液为质量浓度7%~9%的Ca(OH)2溶液。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:步骤二中所述碱液为质量浓度8%的Ca(OH)2溶液。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是:步骤二中核桃壳粉末与碱液的体积比为1:1。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是:步骤三中使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节pH值。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式六不同的是:所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为0.1mol/L,pH值为3。其它与具体实施方式六相同。
具体实施方式八:本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是:步骤三中烘干的具体方法为:放入鼓风干燥箱中干燥。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九:本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是:步骤三中调节pH值至6.5。其它与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十:本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是:步骤三中于60℃下烘干至恒重。其它与具体实施方式一至九之一相同。
下面对本发明的实施例做详细说明,以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方案和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1:
本实施例提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,包括以下步骤:
一、物理预处理:
去除核桃壳中杂质,对核桃壳进行物理研磨,过筛,得到粒径为60-80目的核桃壳粉末;
二、化学预处理:
将经过步骤一处理后的核桃壳粉末中加入碱液,于60℃下处理48h;所述碱液为质量浓度8%的Ca(OH)2溶液;其中核桃壳粉末与碱液的体积比为1:1;
三、然后滤去碱液,蒸馏水洗涤残渣至pH值不再发生变化,经抽滤后,使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节pH值至6.5,于60℃下鼓风干燥箱中干燥至恒重,即完成。
所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为0.1mol/L,pH值为3。
对比例1:仅使用物理预处理。
一、物理预处理:
去除核桃壳中杂质,对核桃壳进行物理研磨,过筛,得到粒径为60-80目的核桃壳粉末;
二、然后蒸馏水洗涤核桃壳粉末至pH值不再发生变化,经抽滤后,使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节pH值至6.5,于60℃下鼓风干燥箱中干燥至恒重,即完成。
所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为0.1mol/L,pH值为3。
对比例2:仅使用化学预处理。
一、化学预处理:
将核桃壳中加入碱液,于60℃下处理48h;所述碱液为质量浓度8%的Ca(OH)2溶液;其中核桃壳粉末与碱液的体积比为1:1;
二、然后滤去碱液,蒸馏水洗涤残渣至pH值不再发生变化,经抽滤后,使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节pH值至6.5,于60℃下鼓风干燥箱中干燥至恒重,即完成。
所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为0.1mol/L,pH值为3。
对上述方法得到的核桃壳进行以下实验:
(一)采用固态培养方式培养,于250mL锥形瓶中添加预处理后的核桃壳样品5g,依据核桃壳与大量元素营养盐溶液体积比为1:1.5添加大量元素营养盐溶液,并加入体积约为大量营养盐溶液0.1%的微量元素营养盐溶液,于120℃高压灭菌20min。后接入孢子悬液3.5mL,在30℃下进行培养,分别于培养第3、6、9、12、15、18、21、24d取样进行发酵液木质素酶活测定。每组3个平行样。
孢子悬液的制备:用接种环挑取烟曲霉菌G-13,接入无菌水中,制成浓度为106个/mL的孢子悬液,4℃冰箱保存备用;所述烟曲霉菌G-13已经发表在文章《木质素降解真菌菌丝球自固定化细胞体系的建立》中。
(二)粗酶液制备:取发酵后固态基质至离心管,并按照1g底物添加5mL 200mmol/L乙酸-乙酸钠(pH值4.5)缓冲溶液,于30℃100r/min振荡浸提40min。于6000r/min室温下离心10min,所得上清液即为粗酶液。
(三)木质素酶活力测定:
锰过氧化物酶活力测定:反应体系内加入3.4mL 200mmol/L pH值为4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液,0.1mL 1.6mmol/L MnSO4溶液和0.4mL粗酶液,最后加入0.1mL 1.6mmol/L H2O2溶液启动反应,在30℃下反应3min,于240nm测定吸光度的变化值。1个酶活单位(U/L)定义为:反应前3min内,每min氧化1μmol Mn2+成为Mn3+的平均需酶量。每个样品平行测定3次求平均值。
木质素过氧化物酶活力测定:反应体系内加入1.5mL 250mmol/L pH值为3酒石酸-酒石酸钠缓冲液,1mL 15mmol/L藜芦醇溶液和0.4mL的粗酶液,最后加入0.1mL 20mmol/L的H2O2溶液启动反应,在30℃下反应3min,于310nm测定吸光度的变化值。1个酶活单位(U/L)定义为:反应前3min内,每min氧化1μmol藜芦醇成为藜芦醛的平均需酶量。每个样品平行测定3次取平均值。
漆酶活力测定:反应体系中加入2mL 200mmol/L pH值为5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液,0.5mL 0.5mmol/L ABTS溶液和0.5mL粗酶液,在28℃下反应3min,于420nm测定吸光度的变化值。1个酶活单位(U/L)定义为:反应前3min内,每min将1μmol ABTS转化为ABTS自由基的平均需酶量。每个样品平行操作3次取平均值。
(四)发酵底物处理:取离心残渣用蒸馏水洗涤抽滤,直至滤液颜色不再变化,然后向滤渣加水,于5000r/min下离心10min,洗涤3次,沉淀物于60℃烘干至恒重,用于后续的扫描电镜、红外光谱和X-射线衍射的表征。
结果如表1所示。表1显示了各种预处理方式对烟曲霉(A.Fumigatus)G-13产木质素降解酶活的影响。
Figure BDA0001829580320000061
Figure BDA0001829580320000071
表1中数据分别为各种预处理的发酵底物培养24d内所产各种木质素酶活的最高值,且各数据是将菌株A.Fumigatus G-13以未经预处理的核桃壳作为发酵底物,其Lac、Mnp和Lip酶活分别于第18d、15d和18d达到最大值,将其分别定义为100%,测得的各酶活分别与之相比而获得的相对酶活。
根据表1分析可知,单独采用物理预处理,三种木质素酶的酶活在80-100目时达到最大,也就是说粒径越小,酶活越高,最大相对酶活分别是133%(Lac),564%(Mnp)和291%(Lip)。
单独采用化学预处理,其中8%Ca(OH)2预处理效果最好,菌株所产最大酶活分别为未处理样品的332%(Lac),541%(Mnp),425%(Lip)。
而当采用物理-化学联合预处理时,其对菌株诱导产生木质素酶的效果远高于单独采用物理预处理和单独采用化学预处理。当核桃壳粒径为60-80目联合8%Ca(OH)2预处理时,在核桃壳与大量营养盐溶液体积比为1:1条件下,其Lac、Mnp和Lip分别为原酶活的578%、2548%和1074%,是该粒径下物理预处理的5.89、5.12和3.82倍,是该浓度下Ca(OH)2化学预处理的1.74、4.70和2.62倍。其可能的原因是物理预处理破坏纤维素的结晶结构,使得核桃壳比表面积增大,使裸露的表面的结合点增加;碱处理的机制在于OH-能够削弱纤维素和半纤维素之间的氢键,皂化半纤维素和木质素之间的化学键,引起木质纤维原料的润胀,导致内部表面积增加,聚合度降低,木质素和碳水化合物之间的化学建断裂,破坏木质素结构;通过联用物理-化学预处理,可以使得木质素和半纤维素与纤维素的结合层先被物理处理部分破坏,聚合度降低,并提高比表面积,而后化学处理又进一步使得原料变得多孔,内表面积增大,两者共同作用极有利于增大木质素与酶或其他化学物质的接触面积。
进一步探究核桃壳高效降解的最佳核桃壳与大量营养盐溶液体积比发现,在核桃壳粒径为60-80目,Ca(OH)2的浓度为8%,核桃壳与大量营养盐溶液体积比1:1.5条件下,菌株产木质素酶活性最高,其Lac、Mnp和木Lip分别为原酶活的899%、5611%和2332%。
(五)扫描电镜分析
图1为核桃壳未经过预处理且未进行生物降解的扫描电镜图像;图2为未进行预处理进行生物降解的扫描电镜图像;图3为预处理效果最佳未进行生物降解的扫描电镜图像;图4为经过最佳预处理进行生物降解的扫描电镜图像。如图1~4所示,未经过预处理的核桃壳表面被大块片状物质和不规则的粒状物覆盖。颗粒状物质排列紧密,分布致密,片状物质或覆盖,或与颗粒物质相互连接交织附着于核桃壳表面。经不同预处理并用烟曲霉菌株生物降解的核桃壳表面致密且坚硬的结构呈现不同程度的破损,即核桃壳表面致密结构呈现出现裂痕和孔洞,预处理使烟曲霉菌能够进入核桃壳结构内部进行降解,导致核桃壳组织结构松散。
(六)红外分析
图5是核桃壳在不同预处理及生物降解前后的傅里叶红外光谱图,测定波数范围为4000-400cm-1。图5中曲线A为核桃壳未经过预处理且未进行生物降解,曲线B为未进行预处理进行生物降解,曲线C为预处理效果最佳未进行生物降解,曲线D为经过最佳预处理进行生物降解的红外光谱图。
由图5可知,4个光谱有很多相似之处,表明处理后核桃壳结构中的主要基团没有发生明显变化。但各基团透射率的相对强度却改变了,说明核桃壳的成分在量上发生了明显变化。波数1620cm-1和1510cm-1处的吸收峰表征芳香核羰基(C=O)伸缩振动,是木质素最特征的红外谱带,未处理的木质纤维素中此吸收峰较为明显,而未经处理纤维素中波数为1240cm-1的吸收峰归属于乙酰酯键,在经过物理预处理及生物降解后此峰明显减弱,说明在处理过程中发生了皂化反应,乙酰酯键消失,纤维素、半纤维素和木质素之间的部分连接键已被破坏。
(七)X射线衍射分析
纤维素结晶度反映的是纤维素中结晶区所占的相对比例,而不是绝对比例。研究表明无定形木质素和半纤维素的减少也同样会影响样品中纤维素结晶区的比例。如图6所示,图6中曲线A为核桃壳未经过预处理且未进行生物降解,曲线B为未进行预处理进行生物降解,曲线C为经过最佳预处理未进行生物降解,曲线D为经过最佳预处理进行生物降解的扫描电镜图像。根据XRD分析和相关计算得出核桃壳结晶度。核桃壳经过预处理并用烟曲霉生物降解后,纤维素结晶度(CrI)反而略有上升了,这可能是因为,在预处理及生物降解后,未处理核桃壳中高含量的非纤维成分在水分子快速振动的作用下被分解。
碱性(主要指低浓度强碱)预处理的作用主要是打断木质素与半纤维素之间酯键和醚键联接,以及木质素分子间的酯键和碳碳键,并削弱半纤维素和纤维素之间的氢键结合。此时,纤维素和半纤维素会发生降解反应,纤维素大分子会水解断裂,变成两个甚至多个短链分子,由一个还原性末端基变成两个或多个还原性末端基,因而又会促进剥皮反应,而半纤维素快速溶出并降解。温和温度下的稀碱预处理对核桃壳纤维素的浓度和晶型结构影响不大,但由于不定形基质的溶出,会导致结晶度相对升高。

Claims (10)

1.一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
一、物理预处理:
去除核桃壳中杂质,对核桃壳进行物理研磨,过筛,得到粒径为60-80目的核桃壳粉末;
二、化学预处理:
将经过步骤一处理后的核桃壳粉末中加入碱液,于55~65℃下处理46~50h;所述碱液为质量浓度6%~10%的Ca(OH)2溶液;其中核桃壳粉末与碱液的体积比为1:(0.9~1.1);
三、然后滤去碱液,蒸馏水洗涤残渣至pH值不再发生变化,经抽滤后,调节pH值至6~7,于55~65℃下烘干至恒重,即完成,后续用烟曲霉菌株对于核桃壳进行处理。
2.根据权利要求1所述的一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,其特征在于步骤二中于60℃下处理47~49h。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,其特征在于步骤二中所述碱液为质量浓度7%~9%的Ca(OH)2溶液。
4.根据权利要求1或2所述的一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,其特征在于步骤二中所述碱液为质量浓度8%的Ca(OH)2溶液。
5.根据权利要求4所述的一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,其特征在于步骤二中核桃壳粉末与碱液的体积比为1:1。
6.根据权利要求5所述的一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,其特征在于步骤三中使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节pH值。
7.根据权利要求6所述的一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,其特征在于所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为0.1mol/L,pH值为3。
8.根据权利要求7所述的一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,其特征在于步骤三中烘干的具体方法为:放入鼓风干燥箱中干燥。
9.根据权利要求8所述的一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,其特征在于步骤三中调节pH值至6.5。
10.根据权利要求9所述的一种提高核桃壳生物降解效果的预处理方法,其特征在于步骤三中于60℃下烘干至恒重。
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