CN109259887A - 一种兔非手术胚胎移植器械、方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种兔非手术胚胎移植器械、方法及其应用，移植器械包括外管套、外管、内管以及注射器；将兔胚胎装入内管；绑定受体兔，将套有外管套的外管从受体兔阴道插入，直至外管的尖端抵达子宫颈；向外拉出外管套，使外管套的封闭端借助外管的尖端刺破；推动外管，使外管尖端穿过子宫颈，将内管插入至外管尖端，利用与内管相连的注射器，将内管内的兔胚胎注射到子宫内。本发明消除了手术对受体兔造成的损伤以及感染的风险，且能够快速的将兔胚胎移植入受体兔子宫内，可以提高兔胚胎移植效率和胎儿出生率，应用广泛。

Description

一种兔非手术胚胎移植器械、方法及其应用

技术领域

本发明属于实验动物应用领域，涉及一种在模式动物疾病模型构建等过程中使用的兔子胚胎非手术移植器械和方法。

背景技术

兔子是重要的模式动物，在系统发育上非常接近人类。兔子在脂代谢、动脉粥样硬化等疾病研究中具有非常重要的价值。通过对兔子进行药物干扰，如给兔子饲喂胆固醇建立动脉粥样硬化模型，是研究脂代谢和动脉粥样硬化非常重要的模型。自然突变选择获得疾病模型兔，如WHHL和WHHLMI，以及通过基因编辑获得了特定基因修饰的兔，这对阐明疾病发生机制，开发新药物以及新的治疗方案具有重要作用。截止目前，多种基因编辑的兔子被报道。

体细胞核移植技术是获得转基因动物的重要方法，尤其在制备基因插入的动物中具有其他方法不可比拟的优势。通过对供体细胞进行基因编辑，然后将供体细胞注入到具有重编程能力的去核的卵母细胞，然后通过融合、激活、培养，然后进行胚胎移植，获得基因修饰的新个体。也有将基因编辑工具分子注射到受精卵内，在胚胎水平上对基因进行编辑，然后将经过显微注射的胚胎进行胚胎移植，获得基因修饰的新个体。

胚胎移植是获得转基因兔过程中重要的一步。目前广泛采用的方法是手术法胚胎移植，即在全身麻醉的兔子腹部开口，将胚胎从输卵管伞部或输卵管切口处注入。虽然通过这种手术法的胚胎移植被广泛采用，但手术方法存在诸多缺陷，如麻醉、感染风险，手术过程容易造成兔子损伤、死亡及胚胎在体外放置过长时间，从而影响胎儿出生率。

手术法胚胎移植是较为普遍的胚胎移植方法，广泛用于羊、犬和小鼠等物种；而非手术法胚胎移植则主要应用于牛等大型家畜。最近有研究报道小鼠非手术胚胎移植成功的方法，但是针对兔的非手术胚胎移植的方法未有研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种兔非手术胚胎移植器械、方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种兔非手术胚胎移植器械，该胚胎移植器械包括柔性外管套、导向外管、导液内管以及注射器，所述导向外管为一端呈尖头状的管体，导液内管的一端自导向外管的另一端伸入所述管体并一直延伸至导向外管呈尖头状的一端，导液内管的另一端与注射器相连，柔性外管套设置于导向外管外侧，其中，柔性外管套的封闭端位于导向外管呈尖头状的一端，柔性外管套的开口端向导向外管的另一端延伸，延伸长度以插入兔子阴道后柔性外管套的开口端能够露出阴道口外并方便拿捏为准。

优选的，所述导向外管采用移液管制成，柔性外管套采用无菌塑料薄膜制成。

优选的，所述导向外管在距离该导向外管呈尖头状的一端的开口30-35mm处弯曲，弯曲的角度为15-25度。这样的设计贴合兔生殖道弯曲的结构，不影响转动等操作，使得导向外管更容易插入子宫。

一种兔非手术胚胎移植方法，包括以下步骤：

1)利用注射器将兔胚胎装入导液内管；

2)绑定受体兔后将套有柔性外管套的导向外管从受体兔阴道插入，直至导向外管的尖端抵达受体兔子宫颈；然后向外拉出柔性外管套，借助导向外管的尖端刺破柔性外管套的封闭端；

3)经过步骤2)后，推动导向外管，使导向外管尖端穿过受体兔子宫颈(进入子宫)，然后将所述导液内管的一端插入至导向外管尖端，然后利用与所述导液内管的另一端相连的注射器，将所述兔胚胎注入到受体兔子宫内。

优选的，所述步骤1)具体包括以下步骤：体外培养兔胚胎至桑椹胚期或囊胚期，然后将兔胚胎从胚胎培养液中转移到胚胎移植液中，然后将兔胚胎以三段法装入导液内管，使兔胚胎封闭于导液内管内的两段胚胎移植液之间。

优选的，通过三段法装入导液内管内的兔胚胎，其具体封闭形式为：导液内管内装载有交错排列于三段移植液之间的两段空气柱，其中，中间的一段移植液载有胚胎，这样的设计可以防止胚胎丢失，保证胚胎注入子宫内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的效果：

本发明的非手术法兔胚胎移植器械以导向外管作为操作通道，利用导液内管和注射器将兔胚胎从受体兔阴道经子宫颈直接注入子宫内，消除了手术对受体兔造成的损伤以及感染的风险，导向外管借助外管套实现无菌操作，避免子宫内感染，并且能够快速的将兔胚胎移植入受体兔子宫内，缩短了兔胚胎在体外环境的停留时间，有利于兔胚胎在受体兔内继续发育；本发明的移植器械结构简单、易于操作，可以提高兔胚胎移植效率和胎儿出生率。

按照本发明的兔胚胎移植的具体流程中，采用非手术法胚胎移植器械将胚胎从受体雌兔阴道插入，并经子宫颈注入子宫内，降低了手术操作对受体生殖器官的损伤，且能够快速的将胚胎移植入受体内，缩短了手术法时胚胎在体外环境滞留时间，有利于胚胎发育。同时，胚胎移植中仅需绑定受体兔，消除了麻醉的风险以及麻醉对受体兔生殖性能的不利影响。

本发明能够减轻兔的痛苦，降低死亡率，有利于动物福利的保障，降低成本，具有重要应用价值与经济价值。

附图说明

图1A为兔非手术胚胎移植方法的流程模式图之一，其中示出了非手术法的移植器械；

图1B为兔非手术胚胎移植方法的流程模式图之二，其中示出了将胚胎从胚胎培养液中转移到胚胎移植液的微滴中；

图1C为兔非手术胚胎移植方法的流程模式图之三，其中示出了三段法装载胚胎至移植的内管中(胚胎位于一根内管中液柱的中间段)；

图1D为兔非手术胚胎移植方法的流程模式图之四，其中示出了外管进入子宫流程(将套在外管上的外管套与外管一同插入生殖道，抵达子宫颈，向后端拉外管套，使得外管穿过外管套，外管套则全部脱出)；

图1E为兔非手术胚胎移植方法的流程模式图之五，其中示出了将胚胎注射到子宫内(将载有胚胎的内管插入外管管腔，使内管沿着外管进入子宫，推动与内管相连的注射器，完成注入)；

图中：1-卵巢；2-输卵管；3-子宫；4-子宫颈；5-膀胱；6-外管套；7-外管；8-内管；9-注射器；10-三段胚胎移植液柱；11-胚胎；12-胚胎培养液；13-持卵针；14-胚胎移植液。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述实施例用于解释本发明，而非对本发明的限定。

(一)非手术法兔胚胎移植

1)试剂和培养液/处理液的来源和制备

注射用垂体促卵泡素(PMSG)及注射用绒促性素(HCG)均购买自宁波市三生药业有限公司。灭菌注射用水购买自芮城县维尔富兽药有限公司。戊巴比妥钠购买自Merck公司。DPBS、EBSS及FBS均购买自Hyclone公司。

胚胎培养液：EBSS+10％FBS

胚胎移植液：EBSS+5％BSA

2)兔胚胎移植的具体流程

2.1供体及受体兔的制备

供体兔的制备：选用西安交通大学医学部实验动物中心提供的新西兰雌兔，6月龄(体重3kg)，单笼饲养，自然采光，自由饮水采食。第一天分别颈部皮下注射PMSG 100IU/只。第四天中午将HCG用灭菌注射用水配制成500U/mL，当天12点半给注射过PMSG的雌兔耳缘静脉注射HCG，0.2mL/只(100U/只)。

选用6-8月龄生殖性能良好的新西兰雄兔，供体兔注射HCG后，按照1:1的比例与雄兔合笼交配。

受体兔的制备：选用约18月龄生过一胎的经产新西兰雌兔作为受体兔。同供体兔同一时间注射HCG，剂量为0.2mL/只(100U/只)。注射后继续单笼饲养，待进行胚胎移植。在制备受体兔的同时，选取未经激素处理的新西兰雌兔和繁殖性能良好的新西兰雄兔交配，用于对胚胎移植后受体兔刚出生的兔仔哺乳。

2.2供体兔胚胎的收集与培养

由经过交配的供体兔体内提取胚胎(受精卵)前，用2mL注射器两支各吸取约2.5mLDPBS(含10％FBS)，置于37℃培养箱内预热待冲卵用。在35mm*10mm的细胞培养皿内做体积200μL的胚胎培养液微滴，然后用胚胎级的矿物油覆盖微滴，于收集胚胎前24小时提前将胚胎培养液微滴置于37℃培养箱内平衡备用。

供体兔交配20-24h后静脉注射3％戊巴比妥钠(60mg/kg)过量麻醉，固定供体兔于解剖台上，腹面朝上，用75％乙醇喷洒供体兔腹部以尽量减少毛发的污染。用经高压灭菌的解剖器械切开腹腔，移开盘绕的肠子，找到子宫、输卵管和卵巢。用镊子提起输卵管、卵巢的脂肪垫，用小剪刀剥离，使输卵管和卵巢与体腔壁分离，并剪开输卵管回折部分脂肪使伞端暴露，伞端部分应尽量少带脂肪组织。将输卵管伞部及部分输卵管插入一次性灭菌细塑料管，并导入无菌离心管(15mL)内接取受精卵。用预热过的DPBS(含10％FBS)于子宫角输卵管结合处将受精卵依次从双侧输卵管伞部冲出。将含冲卵液的离心管静置1分钟使受精卵沉淀至底部。用1mL移液枪缓缓吸出冲卵液体的上清液至剩余约0.5mL液体，对剩余冲卵液用移液枪吹打使受精卵脱去卵丘颗粒细胞，重新悬浮后吸出，以液滴形式转移至无菌的培养皿内，在体视显微镜下，挑选出受精卵，并在DPBS液滴(含10％FBS)中清洗3-4次使受精卵不含其它组织块或卵丘细胞。将挑选的受精卵移入预先在培养箱中平衡的胚胎培养液中进行培养。培养箱中培养环境为38.5℃、体积分数为5％的CO₂、完全相对湿度。体外培养至第四天，体视显微镜下挑选发育良好的囊胚期胚胎进行胚胎移植。

2.3胚胎移植

本发明采用非手术的方法，通过使用胚胎移植器械将胚胎经由受体兔阴道直接注入子宫，方便快捷。

步骤一：准备移植器械

胚胎移植外管7由天津市津玻玻璃有限公司的1mL移液管(外径7.0mm，内径3.0mm)加工而成。用酒精喷灯将移液管尖端距尖端开口30mm处弯曲(约25度)，并烧制移液管尖端使之圆润，灭菌。

胚胎移植内管8为购自西安嘉诚生物科技有限公司的MICRO MEDICAL TUBING(外径1.63mm，内径1.14mm)，灭菌。胚胎移植内管8与1mL注射器采用购自西安交通大学医用器材厂的无菌注射器细管连接。

参见图1A，将胚胎移植外管7尖端套入采用无菌塑料薄膜制成的外管套6的封闭端，并与注射器、胚胎移植内管8，一并无菌包装(胚胎移植内管8未连接注射器一端插入在胚胎移植外管7内)，备用。将外管套6套于经过灭菌的胚胎移植外管7上，这样可避免胚胎移植外管7在经阴道进入子宫前被污染。

步骤二：参见图1B，用持卵针13将囊胚期的胚胎11从胚胎培养液12中转移到胚胎移植液14中。参见图1C，将胚胎11以三段间隔的方法装入胚胎移植内管8。具体过程为：控制注射器9依次吸取第一段胚胎移植液、小段空气、胚胎11以及第二段胚胎移植液、小段空气和第三段胚胎移植液到所述内管8中，形成三段胚胎移植液柱10，这样可以防止胚胎丢失。

步骤三：一只手抓住受体兔的颈背部皮肤，另一只手抓住兔子髋骨背侧皮肤，使受体兔腹部朝上，头部高于尾部，身体轴与水平面约呈45度，完成受体兔的绑定。

步骤四：参见图1D，受体兔绑定后，将套有外管套6的胚胎移植外管7从阴道插入，进入阴道口时所述外管7尖端朝向受体兔背面，进入阴道4-5cm后旋转所述外管7 180°，使所述外管7尖端朝向受体兔腹面，并继续推进抵达子宫颈4处(感觉外管推进受阻)，然后把外管套6向外拉使胚胎移植外管7刺破并穿透外管套6，直至将外管套6全部拉出至阴道外。轻轻推动及略微旋转使所述外管7尖端穿过子宫颈4，缓缓推进所述外管7，感觉无阻力后停止推进。

步骤五：参见图1E，将装载胚胎的胚胎移植内管8插回所述外管7的管腔，并抵达所述外管7的尖端，推动与该内管8相连的注射器9，轻轻将胚胎注射到子宫3内，缓慢拔出移植器械(内管和外管)，移植完成。受体兔放入原饲养环境单笼饲养3周，然后移入产笼内饲养。

上述非手术法兔胚胎移植中，采用简单、易于操作的胚胎移植器械将囊胚时期的胚胎从受体兔阴道经子宫颈直接注入子宫内，降低了手术操作对受体兔生殖器官(卵巢1、输卵管2、子宫3等)的损伤以及感染的风险；胚胎移植时仅需绑定受体兔，消除了麻醉的风险以及麻醉对受体兔生殖性能的不利影响；且能够快速的将胚胎移植于受体内，缩短了胚胎在体外环境的停留时间，有利于移植后胚胎发育。因此，可以提高兔胚胎移植效率和胎儿出生率。

(二)非手术法兔胚胎移植的应用

利用体外受精、单精子胞浆注射、胚胎冷冻等辅助生殖技术对兔繁殖育种时，胚胎移植都是关键环节，采用本发明的移植器械和方法能够有效提高辅助生殖的成功率。采用体细胞核移植或显微注射构建疾病模型时，也必须要进行胚胎移植。

(三)非手术法兔胚胎移植的进步意义

兔的生殖生理结构与小鼠等其他实验动物存在很大差异，因此现有的非手术移植的方法并不适用于兔。本发明针对兔的生殖生理特征，首次采用一定的胚胎移植器械(包括外管套、带弯头的外管及内管和注射器)和方法，成功的获得了非手术胚胎移植兔。其中，外管套能够防止病原微生物污染胚胎；带弯头的外管能够更加适应生殖道结构，易于进入子宫；内管三段法装载胚胎能够防止胚胎丢失；注射器易于控制胚胎的转载和注入子宫。按照以上非手术法兔胚胎移植的具体流程进行胚胎移植，将胚胎借助所述胚胎移植器械从受体雌兔阴道插入，穿过子宫颈，并注入子宫内，降低了操作对受体生殖器官的损伤，且能够快速的将胚胎移植入受体内，缩短了胚胎在体外环境滞留时间，有利于胚胎发育。针对兔的生殖结构，本发明通过所述胚胎移植器械，能够有效的进行非手术移植，解决了受体兔因移植操作中的麻醉、感染、疼痛、惊吓而死亡率较高的难题，保障了后续实验、生产顺利进行。

Claims (7)

1.一种兔非手术胚胎移植器械，其特征在于：该胚胎移植器械包括柔性外管套(6)、导向外管(7)、导液内管(8)以及注射器(9)，所述导向外管(7)为一端呈尖头状的管体，导液内管(8)的一端自导向外管(7)的另一端伸入所述管体并一直延伸至导向外管(7)呈尖头状的一端，导液内管(8)的另一端与注射器(9)相连，柔性外管套(6)设置于导向外管(7)外侧，柔性外管套(6)的封闭端位于导向外管(7)呈尖头状的一端，柔性外管套(6)的开口端向所述导向外管(7)的另一端延伸。

2.根据权利要求1所述一种兔非手术胚胎移植器械，其特征在于：所述导向外管(7)采用移液管制成，柔性外管套(6)采用无菌塑料膜制成。

3.根据权利要求1所述一种兔非手术胚胎移植器械，其特征在于：所述导向外管(7)在距离其呈尖头状的一端的开口30-35mm处弯曲，弯曲的角度为15-25度。

4.一种兔非手术胚胎移植方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将兔胚胎(11)装入导液内管(8)；

2)绑定受体兔后将套有柔性外管套(6)的导向外管(7)从受体兔阴道插入，直至导向外管(7)的尖端抵达子宫颈(4)；然后向外拉出柔性外管套(6)，借助导向外管(7)的尖端刺破柔性外管套(6)的封闭端；

3)经过步骤2)后，推动导向外管(7)，使导向外管(7)尖端穿过子宫颈(4)，然后将所述导液内管(8)插入至导向外管(7)尖端，然后利用与所述导液内管(8)相连的注射器(9)，将所述导液内管(8)内的兔胚胎(11)注入到子宫(3)内。

5.根据权利要求4所述一种兔非手术胚胎移植方法，其特征在于：所述步骤1)具体包括以下步骤：体外培养兔胚胎(11)至桑椹胚期或囊胚期；然后将兔胚胎(11)从胚胎培养液(12)中转移到胚胎移植液(14)中，然后将兔胚胎(11)以三段法装入导液内管(8)，使兔胚胎(11)封闭于导液内管(7)内的两段胚胎移植液之间。

6.一种如权利要求1所述的兔非手术胚胎移植器械在兔繁殖育种中的应用。

7.一种如权利要求1所述的兔非手术胚胎移植器械在构建疾病模型中的应用。