WO2024009796A1 - ブタの採卵方法およびブタの受精卵作製方法 - Google Patents

ブタの採卵方法およびブタの受精卵作製方法 Download PDF

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eggs
follicle
pig
fertilized
egg
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正規 高須
一輝 杷野
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国立大学法人東海国立大学機構
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/02—Breeding vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
    • A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
    • A61D19/02—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for artificial insemination

Definitions

  • Patent Document 1 discloses a superovulation treatment method that can be applied to pigs that have repeated estrus cycles.
  • the treatment method disclosed in Patent Document 1 involves administering a hormonal agent having a corpus luteum degeneration effect to a pig undergoing repeated estrous cycles to cause the corpus luteum to regress, and then administering to the pig a hormonal agent to develop follicles and a hormonal agent to induce ovulation. administered to induce superovulation.
  • Patent Document 1 does not disclose a method for efficiently collecting eggs and forming blastocysts after inducing ovulation.
  • Non-Patent Document 1 discloses a method for a piglet production system in which eggs are collected under transvaginal ultrasound guidance, and embryos are produced in vitro and embryo transplanted.
  • egg collection method disclosed in Non-Patent Document 1 egg cells with uneven maturation states are collected by suction under transvaginal ultrasound guidance.
  • Non-Patent Document 1 is a transvaginal egg collection, which is a more non-invasive treatment than the conventional method, but requires equipment such as a dedicated probe. Furthermore, the approximately 15 eggs collected by the method of Non-Patent Document 1 contain eggs of various degrees of maturity, from immature eggs with cumulus cells to mature eggs.
  • the present invention has been made in view of the current situation, and aims to provide a method for collecting pig eggs and a method for producing fertilized pig eggs, which can efficiently obtain pig eggs that can grow to blastocysts. This was done as a problem to be solved.
  • the present invention relates to a method for collecting eggs from pigs.
  • the method for collecting eggs from pigs of the present invention includes a follicle development process in which hormonal agents are administered to pigs to develop follicles, and a follicle development process in which the position of the ovaries and the condition of the follicles in the ovaries are confirmed from outside the body using an ultrasound diagnostic device.
  • the method is characterized by comprising a confirmation step and an egg collection step of collecting eggs by puncturing the pig between the groin and navel.
  • the follicle confirmation step in the pig oocyte collection method of the present invention can include confirming the growth of follicles using an ultrasound diagnostic device.
  • the follicular development step in the pig oocyte collection method of the present invention is a step of administering a hormone agent to a pig that has been confirmed to be in heat, and includes a first administration step of administering a hormone having a luteal degeneration effect, and a first administration step of administering a follicle-stimulating hormone. It is preferable to include a second administration step of administering human chorionic gonadotropin, and a third administration step of administering human chorionic gonadotropin.
  • the present invention also provides a method for producing fertilized pig eggs.
  • the method for producing fertilized pig eggs of the present invention includes a collection step of collecting in-vivo mature eggs in which swelling of cumulus cells has been observed, a culturing step of culturing the collected in-vivo mature eggs in a maturation culture medium for 6 to 12 hours, It is characterized by comprising a fertilization step of fertilizing after the culturing step.
  • hormonal agents are administered to develop follicles.
  • multiple eggs develop at approximately the same rate in the mother pig's body until collection.
  • the collected eggs have a high rate of development until they reach a state where they can be implanted as fertilized eggs (blastocyst), and also have a high recovery rate when frozen and thawed.
  • a large number of eggs in an appropriate developmental state can be collected by checking the state of the follicles using an ultrasonic diagnostic device. Specifically, even from miniature pigs that ovulate infrequently, around 30-40 eggs can be collected in one egg collection, and about 50% of these will develop into blastocysts. In other words, about 15 blastocysts can be obtained in one egg collection.
  • eggs are collected by puncturing the abdominal wall.
  • egg retrieval through puncture is a non-invasive procedure, which reduces the burden on pigs undergoing the procedure and allows them to recover quickly.
  • it becomes possible to collect eggs from the same individual multiple times making it possible to collect eggs more efficiently than before.
  • valuable pig genetic resources can be secured at an early stage.
  • a general probe can be used for puncturing in the egg collection process.
  • An ultrasonic diagnostic device that is normally used by veterinarians can also be used, and egg collection can be performed without the need for special equipment.
  • fertilized eggs (blastocysts) can be produced with a higher success rate by culturing the collected in-vivo matured eggs in a maturation medium for 6 to 12 hours.
  • FIG. 1 is a flowchart showing an example of a pig egg collection method.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an example of a method for producing fertilized pig eggs.
  • FIG. 3 is a diagram showing a pig in a supine position being observed by an ultrasonic diagnostic device in the follicle confirmation process and egg collection process.
  • FIG. 4 is a photograph substituted for a drawing of an ultrasound image of a pig's ovary and follicle obtained by an ultrasound diagnostic device.
  • FIG. 5(a) is a photograph of a mature egg immediately after egg collection
  • FIG. 5(b) is a photograph of a developed fertilized egg (blastocyst) of a pig.
  • FIG. 6(a) is a flowchart of a method for genetic modification using somatic cell nuclear transfer
  • FIG. 6(b) is a flowchart of a method for genetic modification by genetic manipulation of a fertilized egg.
  • the egg collection method of the present invention is applicable to pigs belonging to the Boar family (including miniature pigs).
  • the time to start the egg collection method of the present invention is 12 to 13 days after the start of estrus. The date of onset of estrus is confirmed by back pressure test or method using boar pigs.
  • the hormonal agent administered in the first administration step of the follicle development step is a prostaglandin F2 ⁇ preparation (dinoprost, cloprostenol), which has a luteal degeneration effect.
  • the most preferred hormonal agent is dinoprost (trade name: Veterinary Pronargon F Injection Zoetis JP).
  • the position of the ovaries and the state of growth of the follicles in the ovaries are confirmed using an ultrasound diagnostic device while the pigs are anesthetized and have been administered hormones for a predetermined period of time.
  • eggs are collected by puncturing the pig between the groin and navel while continuing observation using an ultrasound diagnostic device.
  • the method for producing fertilized pig eggs of the present invention in-vivo mature eggs in which swelling of cumulus cells has been observed are collected, and the collected in-vivo mature eggs are cultured in a maturation medium for 6 to 12 hours. The embryo is then fertilized to produce a fertilized egg, which develops into a blastocyst.
  • a preferred maturation medium is porcine oocyte maturation basic medium (POM) (Functional Peptide Institute).
  • FIG. 1 shows a flowchart of the pig egg collection method performed in this example.
  • FIG. 2 shows a flowchart of the method for producing fertilized eggs.
  • step S1 it was confirmed when to apply a series of methods to the mini-pig P from which eggs were collected.
  • the egg collection method of this example is started 12 to 13 days after the start of estrus.
  • the date of onset of estrus was confirmed by back pressure test or method using boar pigs.
  • prostaglandin F2 ⁇ pronargon F injection for animals
  • step S3 the second administration step of the follicle development step was performed.
  • follicle-stimulating hormone (Antolin 10), which has a follicle-stimulating hormone effect, was administered gradually every 12 hours in the morning and evening for 3 days.
  • step S4 the third administration step of the follicle development step was performed.
  • human chorionic gonadotropin gonatropin
  • gonatropin which has an ovulation-promoting effect
  • step S5 the mini pig P is anesthetized and placed in a supine position, and the position of the ovary and the growth of the follicle in the ovary are confirmed from outside the body using an ultrasound diagnostic device. did.
  • Figure 3 shows the position where minipig P is observed.
  • FIG. 4 shows a photograph substituted for a drawing of an ultrasound image of a pig's ovary and follicle obtained by observation. As shown in FIG. 4, a plurality of eggs exist in the ovary in approximately the same developmental state due to the hormone drug administration in steps S2 to S4.
  • the probe 1 of the ultrasonic diagnostic device is placed between the inguinal region and the navel, and while continuing observation, it is connected to the extension tube. Puncture was made from near the most posterior papilla P1 using needle 2 for egg collection, which is a Cattelan needle or an egg collection needle. The follicle was punctured according to ultrasound guidance, and eggs were collected by pulling a syringe connected to an extension tube on the opposite side of needle 2. After egg collection, minipig P was administered antibiotics to control infection.
  • the obtained eggs were subsequently used to produce fertilized eggs.
  • FIG. 5(b) shows a photograph substituted for a drawing of the produced fertilized egg (blastocyst).
  • the egg collection method of this example it was possible to collect 30 to 40 internally matured eggs at a time.
  • the average number of litters of the mini pig P used this time is 5, but if the egg collection method of this example is applied to domestic pigs with an average litter of more than 10, 60-80 internally mature eggs can be collected. There is a high probability that it can be done.
  • the rate of blastocyst formation was approximately 60%. This is a high success rate comparable to the 60% blastocyst formation rate achieved by conventional methods of obtaining fertilized eggs through open surgery.
  • the optimal time for culturing in the mature culture solution is 6 to 12 hours, and no difference from the conventional method was observed when culturing in less than 6 hours. At the same time, it was confirmed that when maturation was carried out for more than 12 hours, the blastocyst formation rate was significantly reduced. For example, when cultured for 24 hours, the blastocyst formation rate was 10%.
  • FIG. 6 shows a flowchart of the genetic modification procedure performed together with the fertilized egg production method of this example.
  • FIG. 6(a) shows a genetic modification method using somatic cell nuclear transfer
  • FIG. 6(b) shows a genetic modification method by genetically manipulating a fertilized egg.
  • somatic cell nuclear transfer method collected eggs (fresh or cryopreserved eggs) are subjected to somatic cell nuclear transfer treatment using genetically manipulated donor cells immediately or after maturation culture (step S7) (step S11). In this way, a reconstructed fertilized egg is produced (step S12). By transplanting this fertilized egg into a recipient female, genetically modified offspring can be obtained.
  • the collected eggs are matured and cultured (step S7), and then fertilized by insemination (step S13) to produce fertilized eggs (step S14).
  • the fertilized eggs 10 to 16 hours after fertilization are subjected to genetic modification treatment by microinjection or electroporation (step S15).
  • genetic modification treatment by microinjection or electroporation (step S15).
  • a genetically modified pig can also be produced using a chimera of a pig ES cell or iPS cell and a fertilized egg derived from an egg collected by this method (step S15).
  • the offspring obtained by genetic modification using the fertilized egg production method of the present invention has the following concerns regarding genetic modification methods using ovaries and eggs derived from ordinary slaughterhouses: 1) The parents of the genetically modified individuals can be identified. 2) Microbial contamination of genetically modified individuals associated with the use of ovaries and eggs whose cleanliness cannot be guaranteed can be reduced.
  • the configurations of the pig egg collection method and fertilized egg production method described in this example can be modified as appropriate.
  • the pig egg collection method and fertilized egg production method according to the present invention are applicable to preserving valuable genetic resources such as branded pigs in pig farming, accelerating breeding by popularizing fertilized egg transplantation, and importing and exporting fertilized eggs from breeding pigs. Is possible. Additionally, this technology makes it possible to produce genetically modified/genome edited pigs with traceability and sanitary conditions. This makes it possible to create pigs suitable for producing cells and organs for transplantation into humans.
  • P Mini pig P1: Most posterior papilla 1: Probe of ultrasound diagnostic equipment 2: Needle for collecting eggs

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Abstract

胚盤胞まで成長可能なブタの卵子を効率よく得ることのできる、ブタの採卵方法及びブタの受精卵作製方法を提供する。　ブタの採卵方法は、ブタにホルモン剤を投与して卵胞を発育させる卵胞発育工程と、超音波診断装置によって、体外から卵巣の位置と当該卵巣の中の卵胞の状態を確認する卵胞確認工程と、ブタの鼠径部と臍との間に針２を穿刺して卵を採取する卵採取工程と、を備えている。ブタの受精卵作製方法は、卵丘細胞の膨化が認められた体内成熟卵を採取する採取工程と、採取した体内成熟卵を６～１２時間成熟培養液で培養する培養工程と、培養工程の後に受精させ受精卵（胚盤胞）を作製する工程と、を備えている。

Description

ブタの採卵方法およびブタの受精卵作製方法
　本発明は、ブタの採卵方法と、ブタの受精卵作製方法に関する。特に、ブタの生体から非侵襲的に複数の卵子を採取して受精卵を作製する技術に関する。
　グローバル化の進んだ現代では、海外から家畜伝染病が入り込んで流行する可能性が高まっている。実際、近年の豚熱の流行時には、種豚が豚熱に感染したためにブタ品種が失われた事例が報告されている。このため、在来ブタやブランドブタなど、個体数が少なく貴重な遺伝子資源の保存が求められている。
　同時に、ブタの育種改良の迅速化も求められている。現在、牛では、受精卵移植を活用して育種が進められているが、ブタの受精卵移植は未だ普及していない。
　現在、ブタの体外発生にかかる研究は、人やマウスなどの知見を基に作製したプロトコールにしたがって行われている。研究の素材としては、食肉処理場で処理したブタの卵巣から採取した卵子が用いられている。しかしながら、ブタの体内で成熟した卵子の状態を知る者がほとんどいないため、現在のプロトコールが正解か否かが不明な状態で研究が行われているのが現状である。実際、食肉処理場で採取した卵巣に由来する卵子の発生率は低く、改善の余地がある。 
　特許文献１には、発情周期を繰り返している豚に適用し得る過排卵処理法が開示されている。特許文献１の処理方法は、発情周期を繰り返している豚に黄体退行作用を持つホルモン剤を投与して黄体を退行させ、次いで該豚に卵胞を発育させるホルモン剤および排卵を誘発するホルモン剤を投与して過排卵を誘発する。しかしながら、排卵を誘発した後、卵子を効率よく採取して胚盤胞を形成させる方法は、特許文献１に開示されていない。
　非特許文献１には、経膣超音波ガイド下で卵子を採取し、胚の体外生産と胚移植を行うことによる子豚生産システムの方法が開示されている。非特許文献１の卵子の採取方法は、経膣超音波ガイド下で、成熟状態が不均一な卵子細胞を吸引により採取している。
特開２００２－２０５９４６号公報
Ｋｏｊｉ　Ｙｏｓｈｉｏｋａ、Ｋｅｎｚｏ　Ｕｃｈｉｋｕｒａ、Ｔｏｍｏｋｏ　Ｓｕｄａ、Ｓａｔｏｋｏ　Ｍａｔｏｂａ「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｉｇｌｅｔｓ　ｆｒｏｍ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ－ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ　ｂｙ　ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ－ｇｕｉｄｅｄ　ｏｖｕｍ　ｐｉｃｋ－ｕｐ　ｆｒｏｍ　ｌｉｖｅ　ｄｏｎｏｒｓ」Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．２０２０年１月
　ブタの採卵方法として、従来から知られている外科的処置を実施すると、術後に子宮が癒着するために繰り返し採卵を行うことができず、非効率的である。一方、非特許文献１に開示されている採卵方法は、経膣的採卵であるために従来よりも非侵襲的な処置であるが、専用のプローブ等の装置が必要となっている。また、非特許文献１の方法で採卵した１５個程度の卵子は、卵丘細胞が付いた未成熟卵子から成熟した卵子まで様々な成熟度の卵子が含まれている。
　本発明は、このような現状に鑑みてなされたものであって、胚盤胞まで成長可能なブタの卵子を効率よく得ることのできる、ブタの採卵方法及びブタの受精卵作製方法の提供を、解決すべき課題としてなされたものである。
　本発明は、ブタの採卵方法に関する。本発明のブタの採卵方法は、ブタにホルモン剤を投与して卵胞を発育させる卵胞発育工程と、超音波診断装置によって、体外から卵巣の位置と当該卵巣の中の卵胞の状態を確認する卵胞確認工程と、ブタの鼠径部と臍との間に穿刺して卵を採取する卵採取工程と、を備えていることを特徴とする。
　本発明のブタの採卵方法における卵胞確認工程は、超音波診断装置によって、卵胞の発育を確認することを含むことができる。
　本発明のブタの採卵方法における卵胞発育工程は、発情を確認したブタにホルモン剤を投与する工程であって、黄体退行作用を持つホルモンを投与する第一の投与工程と、卵胞刺激ホルモンを投与する第二の投与工程と、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを投与する第三の投与工程と、を備えていることが好ましい。
　卵胞発育工程は、第一の投与工程が一日間であり、第二の投与工程が三日間であり、第三の投与工程が一日間であることが最も好ましい。
　本発明はまた、ブタの受精卵作製方法を提供する。本発明のブタの受精卵作製方法は、卵丘細胞の膨化が認められた体内成熟卵を採取する採取工程と、採取した体内成熟卵を６～１２時間成熟培養液で培養する培養工程と、培養工程の後に受精させる受精工程と、を備えていることを特徴とする。
　本発明のブタの採卵方法は、ホルモン剤を投与して卵胞を発育させる。ホルモン剤の適切な期間の投与によって、複数の卵子が、採取までの間、親ブタの体内でほぼ同程度に発育する。この結果、採取した卵子は受精卵として移植可能な状態（胚盤胞）に達するまでの発生率が高く、また凍結と融解を行った場合の回復率が高い。
　本発明のブタの採卵方法は、超音波診断装置によって卵胞の状態を確認することで、適切な発育状態の卵子を多数採取できる。具体的には、排卵数の少ないミニブタであっても、一回の採卵で３０-４０個程度の卵子を採取することができ、その約５０％程度が胚盤胞まで発生する。つまり、１回の採卵で１５個程度の胚盤胞が得られる。
　また、本発明のブタの卵採取工程は、腹壁に穿刺することで卵子を採取する。穿刺による採卵は従来の開腹手術と比較すると、非侵襲的な処置であり、処置をうけるブタの負担が軽減されていて、早期の回復が可能となる。この結果、同じ個体から複数回の採卵が可能となり、従来よりも効率の良い採卵が可能となる。また、貴重なブタの遺伝子資源を早期に確保することができる。
　卵採取工程における穿刺には、一般的なプローブを使用することができる。超音波診断装置もまた、通常獣医師が使用する超音波診断装置を使用することができ、特別な器具を必要とせずに、採卵を行うことができる。
　本発明の受精卵作製方法は、採取した体内成熟卵を６～１２時間成熟培養液で培養することで、より高い成功率で受精卵（胚盤胞）を作製することができる。
図１は、ブタの採卵方法の実施例を示すフローチャートである。 図２は、ブタの受精卵作製方法の実施例を示すフローチャートである。 図３は、卵胞確認工程と卵採取工程で、超音波診断装置によって観察を行われている仰臥位のブタを示す図である。 図４は、超音波診断装置によって得られるブタの卵巣と卵胞の超音波画像の図面代用写真である。 図５（ａ）は、採卵直後の成熟した卵子の写真であり、図５（ｂ）はブタの発生した受精卵（胚盤胞）の図面代用写真である。 図６（ａ）は体細胞核移植法での遺伝子改変法のフローチャートであり、図６（ｂ）は受精卵への遺伝子操作による遺伝子改変法のフローチャートである。
発明の実施の形態
　本発明のブタの採卵方法は、卵胞発育工程と、卵胞確認工程と、卵採取工程を備えている。以下にブタの採卵方法と受精卵作製方法の好適な実施形態を列記する。
（１）本発明の採卵方法は、イノシシ科のブタ（ミニブタを含む）に適用可能である。
（２）本発明の採卵方法を開始する時期は、発情開始日から１２日ないし１３日後である。発情開始日は、背圧試験または雄ブタを使用した方法により確認する。
（３）卵胞発育工程の第一の投与工程で投与されるホルモン剤は、黄体退行作用を持つ、プロスタグランジンＦ２α製剤（ジノプロスト、クロプロステノール）である。最も好適なホルモン剤は、ジノプロスト（商品名　動物用プロナルゴンＦ注射液　Ｚｏｅｔｉｓ　ＪＰ）である。
（４）卵胞発育工程の第二の投与工程で投与されるホルモン剤は、卵胞刺激ホルモン作用を持つ、卵胞刺激ホルモン、ウマ絨毛性性腺刺激ホルモンである。最も好適なホルモン剤は、卵胞刺激ホルモン（商品名　アントリン１０　共立製薬）である。
（５）卵胞発育工程の第三の投与工程で投与されるホルモン剤は、排卵促進作用を持つ、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンである。最も好適なホルモン剤は、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（商品名ゴナトロピン あすか製薬）である。
（６）卵胞確認工程では、ホルモン剤を所定の期間投与したブタに麻酔を掛けた状態で超音波診断装置により卵巣の位置と卵巣の中の卵胞の発育状態を確認する。
（７）卵採取工程では、超音波診断装置で観察を続けつつ、ブタの鼠径部と臍との間に穿刺して卵を採取する。
（８）本発明のブタの受精卵作製方法は、卵丘細胞の膨化が認められた体内成熟卵を採取し、採取した体内成熟卵を６～１２時間成熟培養液で培養し、培養工程の後に受精させ受精卵を作製し、胚盤胞に発生させる。好適な成熟培養液は、ブタ卵子成熟用基本培地（POM）(機能性ペプチド研究所)である。
　実施例として、本発明のブタの採卵方法と受精卵作製方法を、ミニブタＰを用いて具鹸化した例を、図面を参照しつつ説明する。本実施例では、ミニブタＰの採卵から受精卵作製までを連続した一連の方法で行った。なお、本実施例に記載の事項は例示を目的としたものであり、請求の範囲の限定を意図したものではない。
　図１に、本実施例で行ったブタの採卵方法のフローチャートを示す。図２に、受精卵作製方法のフローチャートを示す。
　本実施例では、最初に工程Ｓ１で、卵採取を行うミニブタＰに対して一連の方法を適用する時期を確認した。本実施例の採卵方法の開始時期は、発情開始日から１２日ないし１３日後である。発情開始日は、背圧試験または雄ブタを使用した方法により確認した。
　採卵方法の開始時期に到達したミニブタＰに対して、工程Ｓ２から工程Ｓ４からなる卵胞発育工程で、それぞれ異なるホルモン剤を投与して、卵胞を発育させた。最初に、第一の投与工程で、黄体退行作用を持つプロスタグランジンＦ２α（動物用プロナルゴンＦ注射薬）を、１日間、朝夕１２時間間隔で投与した（工程Ｓ２）。
　次に、工程Ｓ３で、卵胞発育工程の第二の投与工程を行った。第二の投与工程では、卵胞刺激ホルモン作用を持つ、卵胞刺激ホルモン（アントリン１０）を３日間，朝夕１２時間おきに漸減的に投与した。
　さらに、工程Ｓ４で、卵胞発育工程の第三の投与工程を行った。第三の投与工程では、排卵促進作用を持つ、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ゴナトロピン）を１日間夕に投与した。
　卵胞発育工程の終了後、卵胞確認工程（工程Ｓ５）で、ミニブタＰに麻酔を掛けて仰臥位に寝かせ、超音波診断装置を用いて体外から卵巣の位置と卵巣の中の卵胞の発育を確認した。図３にミニブタＰの観察を行う位置を示す。図４に、観察によって得られたブタの卵巣と卵胞の超音波画像の図面代用写真を示す。図４に示すように、工程Ｓ２から工程Ｓ４のホルモン剤投与によって、複数の卵子が卵巣内でほぼ同程度の発育状態で存在している。
　卵胞の発育を確認した後、工程Ｓ６の卵採取工程では、図３に示したように超音波診断装置のプローブ１を鼠径部と臍との間にあてて観察を続けつつ、延長チューブに接続したカテラン針または採卵針である卵採取用の針２を用いて、最後位乳頭Ｐ１の近くから穿刺した。超音波ガイドにしたがって卵胞に穿刺し、針２とは逆側の延長チューブに接続したシリンジを引くことで卵を採取した。採卵後のミニブタＰには抗生物質を投与し、感染を制御した。
　得られた卵は、引き続き、受精卵の作製に使用した。
　受精卵作製には、採取した卵のうち、卵丘細胞の膨化が認められた体内成熟卵を使用する。図５（a）に示したように採卵した卵子のほとんどは成熟している。本実施例では、採取した体内成熟卵を６～１２時間成熟培養液で培養した（工程Ｓ７）。成熟培養液としては、ブタ卵子成熟用基本培地（POM）（機能性ペプチド研究所）を用いた。
　培養工程の後に受精卵作製並びに発生工程を行った（工程Ｓ８）。図５（ｂ）に、作製した受精卵（胚盤胞）の図面代用写真を示す。
　本実施例の採卵方法によって、一度に３０個から４０個の体内成熟卵を採卵することができた。今回用いたミニブタＰの平均産子数は５頭であるが、本実施例の採卵方法を、平均産子数が１０を超える家畜ブタに適用すれば、６０－８０個の体内成熟卵を採取できる蓋然性が高い。
　さらに、本実施例の受精卵作製方法を実施した後、胚盤胞が形成された率は、約６０％であった。これは、受精卵を開腹手術によって得る従来法の実績である胚盤胞形成率６０％に匹敵する高い成功率である。
　本実施例の受精卵作製方法によって胚盤胞形成率が高くなる一つの要因は、培養工程の時間にある。成熟培養液で培養する時間は６～１２時間が最適であり、６時間未満では、従来法との差は確認されなかった。同時に、１２時間を超えて成熟を行った場合、胚盤胞形成率が著しく低下したことが確認された。たとえば、２４時間培養した場合、胚盤胞形成率は１０％であった。
　図６に、本実施例の受精卵作成方法と共に行う遺伝子改変処置のフローチャートを示す。図６（ａ）は体細胞核移植法での遺伝子改変法であり、図６（ｂ）は受精卵への遺伝子操作による遺伝子改変法である。
　体細胞核移植法では、採取した卵子（新鮮もしくは冷凍保存させた卵子）をすぐに，もしくは成熟培養（工程Ｓ７）後、遺伝子を操作したドナー細胞を用いた体細胞核移植処置を施す（工程Ｓ１１）ことで、再構築受精卵を作製する（工程Ｓ１２）。この受精卵をレシピエント雌に移植することで、遺伝子改変産子が得られる。
　受精卵への遺伝子操作による遺伝子改変法では、採取した卵子を成熟培養（工程Ｓ７）後、媒精により受精させ（工程Ｓ１３）、受精卵を作製する（工程Ｓ１４）。受精から１０～１６時間経過した受精卵に、マイクロインジェクションやエレクトロポレーションによる遺伝子改変処置を行う（工程Ｓ１５）。作成した受精卵をレシピエント雌に移植することで、遺伝子改変産子が得られる（工程Ｓ１６）。
　なお、ブタのＥＳ細胞やｉＰＳ細胞と本法で採取した卵子に由来する受精卵とのキメラによる遺伝子改変ブタの作出もこれと同様の手順で実施できる（工程Ｓ１５）。
　体細胞核移植法で遺伝子改変処置を行う場合、複数の遺伝子を改変することができる。また、出生した子豚の遺伝子が確実に改変されている。しかし、奇形などの発生確率が高まる。
　受精卵への遺伝子操作による遺伝子改変の場合、処置した個体における奇形などの発生率は低いが、確実に目的とする遺伝子が操作されている確証は持てない。
　これらの遺伝子改変処置の手法は、目的に応じて使い分けられるものである。本発明の受精卵作成方法による遺伝子改変で得られた産子は、通常の食肉処理場に由来する卵巣・卵子を用いた遺伝子改変法における懸念点である、１）遺伝子改変個体の両親を特定できないこと、を解消でき、また、２）清浄性を担保できない卵巣・卵子を用いることに付随する遺伝子改変個体の微生物汚染、を減ずることができる。
　本実施例で説明したブタの採卵方法と受精卵作製方法の構成は、適宜変更が可能である。例えば、卵胞刺激ホルモンの漸減的な投与の替わりに妊馬血清性腺刺激ホルモンや抗インヒビン抗体の投与で卵胞を成熟させることは可能である。
　本発明に係るブタの採卵方法と受精卵作製方法は、養豚においてブランドブタなどの貴重な遺伝子資源の保存、受精卵移植の普及による育種の加速、種豚の受精卵での輸出入に適用することが可能である。また、本技術によって、トレーサビリティーならびに衛生状態を担保した遺伝子改変／ゲノム編集ブタの作製が可能となる。これにより、ヒトへ移植する細胞や臓器を生産するブタとして適切なブタの作製が可能となる。
　Ｐ　・・　ミニブタ
　Ｐ１　・・　最後位乳頭
　１　・・　超音波診断装置のプローブ
　２　・・　卵採取用の針
 

Claims (5)

  1. 　ブタの採卵方法であって、
    　ブタにホルモン剤を投与して卵胞を発育させる卵胞発育工程と、
    　超音波診断装置によって、体外から卵巣の位置と当該卵巣の中の卵胞の状態を確認する卵胞確認工程と、
    　前記ブタの鼠径部と臍との間に穿刺して卵を採取する卵採取工程と、
    を備えていることを特徴とする採卵方法。
  2. 　前記卵胞確認工程は、前記超音波診断装置によって、卵胞の発育を確認することを含む請求項１記載の採卵方法。
  3. 　前記卵胞発育工程は、
    　発情を確認したブタにホルモン剤を投与する工程であって、
    　黄体退行作用を持つホルモンを投与する第一の投与工程と、
    　卵胞刺激ホルモンを投与する第二の投与工程と、
    　ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを投与する第三の投与工程と、を備えていることを特徴とする請求項１記載の採卵方法。
  4. 　前記卵胞発育工程は、
    　第一の投与工程が一日間であり、
    　第二の投与工程が三日間であり、
    　第三の投与工程が一日間であることを特徴とする請求項３記載の採卵方法。
  5. 　ブタの受精卵作製方法であって、
    　卵丘細胞の膨化が認められた体内成熟卵を採取する採取工程と、
    　採取した前記体内成熟卵を６～１２時間成熟培養液で培養する培養工程と、
    　前記培養工程の後に受精させる受精工程と、
    　を備えていることを特徴とする受精卵作製方法。
     
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