CN109239290A - 一种增塑剂对海洋中藻类生长影响的研究方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增塑剂对海洋中藻类生长影响的研究方法，包括如下步骤：首先，溶剂丙酮的最小无效应浓度测定，其次加入不同浓度丙酮对球等鞭金藻进行培养，每天测定藻密度，至藻类生长的稳定期；然后绘制藻的生长曲线，计算最小无效应浓度；再次观察增塑剂对球等鞭金藻的生长的影响；最后考察增塑剂对球等鞭金藻的生理特征的影响。本发明参考了已有的增塑剂对淡水藻类的生态毒性的研究，经过对比实验分析和预实验，并结合实验成本等角度综合而得到的。对于四种增塑剂，分别确定了其浓度梯度，并通过试剂盒法测定过氧化氢、超氧阴离子、羟基自由基的含量，以此探讨增塑剂对球等鞭金藻的生理特征的影响。

Description

一种增塑剂对海洋中藻类生长影响的研究方法

技术领域

本发明涉及增塑剂毒性分析技术领域，尤其涉及一种增塑剂对海洋中初级生产力生长影响的研究方法。

背景技术

从2011年5月25日起，台湾含塑化剂DEHP的污染产品呈现出滚雪球式的发展。台卫生部门统计显示，截至6月11日，受事件牵连厂商近300家，产品已经超过960项，酿成了重大的食品安全问题，给台湾美食蒙上了阴影；酒鬼酒在2012年11月19日被爆查出塑化剂超标2.6倍，国内受这件事件影响，引发社会恐慌，人们纷纷对制酒有关股权进行抛售撤资，导致白酒股大跌。塑化剂风波愈演愈烈，影响范围甚广，甚至连幼儿使用的感冒糖浆都传出含塑化剂，这让许多民众提心吊胆，人心惶惶。

邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalate Acid Esters,PAEs)是一类大多数无味呈油状的液体，广泛应用于增塑剂。正是由于在工业上的广泛应用，邻苯二甲酸酯类化合物已成为地球上最普遍存在的环境污染物之一，目前在大气、水体、土壤中均可检测到。在20世纪70年代，其他国家已经开展了对增塑剂的相应研究，但我国对增塑剂并未予以极大的重视。而在近年来，社会上各种食品问题相继曝光，其中一部分便是由于添加了一定的增塑剂，产生了对人体及环境的危害。因此在近年来，国内对增塑剂的研究又再次得到了国家和人民的关注。邻苯二甲酸酯的一般化学结构是由一个刚性平面芳烃和两个可塑的非线性脂肪侧链组成，常温下呈无色油状粘稠液体。作为一类环境内分泌干扰物在环境中的不断暴露，它对人类和生物内分泌系统及身体健康造成严重的危害，它已经成为21世纪全球的环境问题。例如，有研究报告称，将啮齿动物暴露于DBP中会引起睾丸萎缩，或是生殖力下降；美国环境卫生署科学研究所用大剂量DEHP喂养的雄性小白鼠和雄性大鼠输精管退化，前肢下垂体细胞肥大。猴子(狨)在多次接受含有DEHP的血浆后，肝组织发生病变。因此对于增塑剂的研究应投入更大的精力。

目前增塑剂对藻类的影响大多针对于淡水藻，而对海洋中的藻类的研究较少，相关研究方法和数据都比较匮乏，人们对增塑剂对海洋中藻类的影响尚缺乏深入的认识。因此本发明将为增塑剂对于藻类的影响的研究扩大了一定的范围，提供了在海洋领域中增塑剂对初级生产者藻类产生的影响的研究方法，能够为此领域提供更多的实验方法，有效的数据和实验依据。

发明内容

本发明对邻苯二甲酸酯类化合物的毒性评价，提供了一种增塑剂对海洋中初级生产力球等鞭金藻生长影响的研究方法，该方法能拟从对影响酶活性及自由基方面探究作用机制，从而为PAEs毒性评估提供实验及数据支持。

本发明的技术方案是一种增塑剂对海洋中藻类生长影响的研究方法，包括如下步骤：

1)溶剂丙酮的最小无效应浓度测定：

加入不同浓度丙酮对球等鞭金藻进行培养，每天测定藻密度，至藻类生长的稳定期；

绘制藻的生长曲线，计算最小无效应浓度；

2)观察增塑剂对球等鞭金藻的生长的影响:

在海水培养基中接种藻种，分别加入不同梯度的增塑剂，分别对球等鞭金藻连续培养，每天对球等鞭金藻的生长数量进行观察并记录，计算抑制率，并利用绘图软件做出抑制率和增塑剂浓度的图像，求出EC₅₀的值；

3)增塑剂对球等鞭金藻的生理特征的影响：

在海水培养基中接种15mL藻种，分别加入96hEC₅₀的3倍浓度的BBP,96hEC₅₀的3倍浓度的DBP，对球等鞭金藻进行培养，同时设置对照组，培养至第4天，测定SOD、CAT，过氧化氢和羟基自由基含量。

本发明还包括分析测试方法，具体如下：

(1)藻密度采用血球计数法测定；

(2)SOD酶活性采用试剂盒法测定；

(3)CAT酶活性采用试剂盒法测定；

(4)羟基自由基含量采用试剂盒法测定；

(5)过氧化氢含量采用试剂盒法测定。

本发明具有如下优点：

1)本发明增塑剂对海洋中初级生产力球等鞭金藻生长影响的研究方法是针对邻苯二甲酸酯类化合物的毒性评价而提出的，目前相关方案研究较少，尤其是关于海洋生态系统数据十分匮乏，因此本发明对邻苯二甲酸酯类化合物的研究具有实际应用的意义与价值。

2)本发明增塑剂对海洋中初级生产力球等鞭金藻生长影响的研究方法参考了已有的增塑剂对淡水藻类的生态毒性的研究，经过对比实验分析和预实验，并结合实验成本等角度综合而得到的。对于四种增塑剂，分别确定了其浓度梯度，并通过试剂盒法测定过氧化氢、超氧阴离子、羟基自由基的含量，以此探讨增塑剂对球等鞭金藻的生理特征的影响。

3)本发明方法揭示了典型增塑剂对海洋中初级生产力等鞭金藻的生长影响的规律，比较常见增塑剂对藻类的毒性强弱，阐明增塑剂对海洋中藻类的生理特征的影响，包括细胞结构、酶活性、自由基等揭示增塑剂对藻类的毒性机理，为海洋中增塑剂类有机污染物的防控提供依据。

附图说明

图1是典型增塑剂对海洋中初级生产力等鞭金藻生长影响研究方法的实验流程；

图2是丙酮对球等鞭金藻的生长的影响；

图3是DMP对球等鞭金藻的生长的影响；

图4是DEP对球等鞭金藻的生长的影响；

图5是BBP对球等鞭金藻的生长的影响；

图6是BBP对球等鞭金藻的生长抑制率曲线；

图7是DBP对球等鞭金藻的生长的影响；

图8是DBP对球等鞭金藻的生长抑制率曲线；

图9是BBP对球等鞭金藻·OH的影响；

图10是DBP对球等鞭金藻·OH的影响；

图11是BBP对球等鞭金藻H₂O₂的影响；

图12是DBP对球等鞭金藻H₂O₂的影响；

图13是BBP对球等鞭金藻SOD的影响；

图14是DBP对球等鞭金藻SOD的影响；

图15是BBP对球等鞭金藻CAT的影响；

图16是DBP对球等鞭金藻CAT的影响。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明：

本发明的典型增塑剂对海洋中初级生产力等鞭金藻生长影响研究方法的实验流程如图1所示。本发明具体步骤如下：

1、溶剂丙酮的最小无效应浓度测定

在500mL锥形瓶中加入200mL海水培养基，接种15mL藻种，加入0,0.1,0.2,0.5,1,2mL丙酮对球等鞭金藻进行培养，每天测定藻密度，至藻类生长的稳定期。绘制藻的生长曲线，计算最小无效应浓度。

2、观察增塑剂对球等鞭金藻的生长的影响。

在500mL锥形瓶中加入200mL海水培养基，接种15mL藻种，分别加入0,40,80,120,160,200mg·L^-1DMP,0,40,80,120,160,200mg·L^-1DEP,0,1,2,4,6,8mg·L^-1BBP,0,0.5,1,2,4,8mg·L^-1DBP对球等鞭金藻连续培养，每天对球等鞭金藻的生长数量进行观察并记录，计算抑制率，并利用绘图软件做出抑制率和增塑剂浓度的图像，求出EC₅₀的值。

3、增塑剂对球等鞭金藻的生理特征的影响

在500mL锥形瓶中加入200mL海水培养基，接种15mL藻种，分别加入9.57mg·L^-1(96hEC₅₀的3倍浓度)BBP,11.58mg·L^-1(96hEC₅₀的3倍浓度)DBP对球等鞭金藻进行培养(同时设置对照组)，培养至第4天，取10ml测定SOD、CAT,取10ml测定过氧化氢和羟基自由基含量。

4、分析测试方法

(1)藻密度采用血球计数法测定，测定时取1mL，经Lugol’s试剂固定后，滴入血球计数板，在光学显微镜下，10×40倍，根据如下公式计算细胞密度:

N＝N_i/5×25×10⁴×f

式中:N—细胞密度，个/mL；Ni—血球计数板25个方格所数的5个方格中细胞总数；f—稀释倍数。

在光学显微镜下数取血球计数板上下室的藻类细胞数并计算细胞密度N_上和N_下，则细胞平均密度为:

N_平均＝(N_上+N_下)/2

(2)SOD酶活性采用试剂盒法测定：测定时，取10ml培养液，离心(4000rpm，10min)收集藻细胞，加入1mL的4℃的50mmol/L pH 7.8的磷酸缓冲液，在冰浴条件下超声波破碎藻细胞。按照试剂盒的说明加入各反应试剂，混匀，在恒温培养箱(30℃)中反应40min后，加入2mL显色剂，室温反应10min后，以双蒸水调零，在550nm处，以1cm光径测定各管的吸光度值。

(3)CAT酶活性采用试剂盒法测定：测定时，取10ml培养液，离心(4000rpm，10min)收集藻细胞，加入1mL的4℃的50mmol/L pH 7.8的磷酸缓冲液，在冰浴条件下超声波破碎藻细胞。按照试剂盒的说明加入各反应试剂，混匀，37℃水浴中反应1min(以秒表计准确时)后，加入1mL显色剂，混匀，以双蒸水调零，在405nm处，以0.5cm光径测定各管的吸光度值。

(4)羟基自由基含量采用试剂盒法测定：测定时取10ml培养液，离心(4000rpm，10min)收集藻细胞，加入1mL的4℃的50mmol/L pH 7.8的磷酸缓冲液，在冰浴条件下超声波破碎藻细胞。按照试剂盒的说明加入各反应试剂，混匀，于37℃水浴中反应1min(以秒表计准确时)后，加入显色剂2mL，室温反应20min后，以双蒸水调零，在550nm处,以1cm光径测定各管的吸光度值。

(5)过氧化氢含量采用试剂盒法测定：测定时取10ml培养液，离心(4000rpm，10min)收集藻细胞，加入1mL的4℃的50mmol/L pH 7.8的磷酸缓冲液，在冰浴条件下超声波破碎藻细胞。按照试剂盒的说明加入各反应试剂，混匀，以双蒸水调零，在405nm处,以1cm光径测定各管的吸光度值。

在96h的培养周期内，溶剂丙酮对球等鞭金藻的生长影响如图2所示，DMP对球等鞭金藻的生长影响如图3所示，DEP对球等鞭金藻的生长影响如图4所示。

在96h的培养周期内，BBP对球等鞭金藻的生长影响如图5所示，通过计算96h各浓度BBP对球等鞭金藻的抑制率，利用Origin绘图软件，绘制生长抑制率曲线，如图6所示，计算出EC₅₀值，为3.19mg/L。

DBP对球等鞭金藻的生长影响如图7所示，通过计算96h处各浓度DBP对球等鞭金藻的抑制率，利用Origin绘图软件，绘制生长抑制率曲线，如图8所示，计算出EC₅₀值，为3.86mg/L。

不同增塑剂对球等鞭金藻的96hEC₅₀值的测定值如表1所示。

表1增塑剂对球等鞭金藻的96hEC₅₀值的测定

增塑剂	96hEC<sub>50</sub>(mg/L)
		DMP	&gt;200mg/L
DEP	&gt;200mg/L
		BBP	3.19mg/L
DBP	3.86mg/L

在96h的培养周期内，BBP与DBP对球等鞭金藻细胞内羟自由基·OH的影响分别如图九、图10所示；BBP与DBP对球等鞭金藻细胞内过氧化氢H₂O₂的影响分别如图11、图12所示；BBP与DBP对球等鞭金藻细胞内SOD的影响分别如图13、图14所示；BBP与DBP对球等鞭金藻细胞内CAT的影响分别如图15、图16所示。

可以看出4种典型增塑剂针对球等鞭金藻的毒性比较为：BBP>DBP>DEP>DMP。在96h的培养周期内，在高浓度增塑剂的作用下，球等鞭金藻细胞内·OH、H₂O₂含量不断升高，同时SOD、CAT活性升高，72h后由于在逐渐积累的活性氧作用下部分失活，最终使藻细胞产生氧化损伤而死亡。

实验结果表明，该发明研究方法能够准确判断出各增塑剂对于海洋中初级生产力球等鞭金藻的生长的影响，有效地探讨评价了邻苯二甲酸酯类化合物对海洋生态系统的毒性影响。

Claims (2)

1.一种增塑剂对海洋中藻类生长影响的研究方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)溶剂丙酮的最小无效应浓度测定：

加入不同浓度丙酮对球等鞭金藻进行培养，每天测定藻密度，至藻类生长的稳定期；

绘制藻的生长曲线，计算最小无效应浓度；

2)观察增塑剂对球等鞭金藻的生长的影响:

在海水培养基中接种藻种，分别加入不同梯度的增塑剂，分别对球等鞭金藻连续培养，每天对球等鞭金藻的生长数量进行观察并记录，计算抑制率，并利用绘图软件做出抑制率和增塑剂浓度的图像，求出EC₅₀的值；

3)增塑剂对球等鞭金藻的生理特征的影响：

在海水培养基中接种15mL藻种，分别加入96hEC₅₀的3倍浓度的BBP,96hEC₅₀的3倍浓度的DBP，对球等鞭金藻进行培养，同时设置对照组，培养至第4天，测定SOD、CAT，过氧化氢和羟基自由基含量。

2.根据权利要求1所述的一种增塑剂对海洋中藻类生长影响的研究方法，其特征在于，还包括分析测试方法，具体如下：

(1)藻密度采用血球计数法测定；

(2)SOD酶活性采用试剂盒法测定；

(3)CAT酶活性采用试剂盒法测定；

(4)羟基自由基含量采用试剂盒法测定；

(5)过氧化氢含量采用试剂盒法测定。