CN109234300A

CN109234300A - 一种调控集胞藻生长速度的基因spkD的应用

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Publication number: CN109234300A
Application number: CN201811204448.XA
Authority: CN
Inventors: 毕相东; 陈高; 吕东; 路晓媛; 戴伟; 曹月蕾; 董少杰; 张树林; 张达娟
Original assignee: Tianjin Agricultural University; Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tianjin Agricultural University; Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2019-01-18
Anticipated expiration: 2038-10-16
Also published as: CN109234300B

Abstract

本发明涉及一种调控集胞藻生长速度的基因spkD的应用。调控集胞藻生长速度的基因spkD在提高集胞藻生长速度和/或提高光胁迫后恢复生长速度中的应用；所述基因spkD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次公开了铜绿微囊藻PCC 7806的spkD基因在提高集胞藻生长速率的重要作用，构建的转基因集胞藻在正常培养条件下6天培养期内较野生型的比生长率平均提高13.97％，而在光限制胁迫后光恢复阶段(6天培养期)集胞藻spkD基因过量表达的突变株与野生型均表现出超补偿生长性能，超补偿生长阶段集胞藻突变株较野生型的比生长率平均提高7.13％。

Description

一种调控集胞藻生长速度的基因spkD的应用

技术领域

本发明涉及一种调控集胞藻生长速度的基因spkD的应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

蓝藻(Cyanobacteria)是一类具有光合自养能力的原核生物。经30多亿年漫长的进化，蓝藻的信号转导系统能够迅速地感知外界环境的变化，并通过精准调控藻细胞的分裂、分化等功能基因的表达，使细胞对外界环境的变化做出积极快速的响应，从而在各种逆境中得以生存下来。丝氨酸/苏氨酸激酶系统(serine/threonine kinases system,STKs)是原核生物两个主要的信号转导系统之一。STKs激酶可直接磷酸化或通过磷酸化作用激活胞质中可溶性蛋白激酶间接地磷酸化信号通路中的下游目标蛋白，进而精确地调控细胞的各项生命活动。

蓝藻细胞可以利用简单的无机物合成有机物，所表达的外源基因产物不形成包涵体，并且多数蓝藻及其提取物对人畜无毒，是转基因研究的良好受体。集胞藻PCC 6803(Synechocystis sp.PCC6803)做为一种单细胞蓝藻，具有培养条件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，是很好的蓝藻基因工程受体。

如中国专利文献CN107400673A(申请号201710879771.6)公开了一种对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803突变株及其应用。乙醇耐受相关基因为slr0599，其碱基序列为SEQID No.7所示。突变株为PCC 6803△slr0599已于2017年8月4日保存在于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC14333，分类学命名集胞藻Synechocystis sp.。

然而，集胞藻PCC 6803在规模化培养中存在生长速度远低于常见细菌类原核表达载体[如大肠杆菌(Escherichia coli)]，因此，严重制约其作为外源基因表达载体规模化应用于生产药物等高附加值产品。因此，若能有效提高集胞藻PCC 6803的生长速率，将对利用蓝藻基因工程技术生产药物等高附加值产品具有非常重要的意义。

韩国专利文献KR100660616B1(申请号KR1020060010126)公开了一种利用蓝藻合胞藻PCC6803的葡萄糖激酶控制植物生长发育的方法。该方法可以发现集胞藻PCC6803的葡萄糖激酶基因对植物的葡萄糖信号转导途径起作用，利用该基因可提高植物的光合能力，为探索其调节tas的机制提供了线索。

该方法虽然可以调控集胞藻的生长，但仍然无法满足实际的市场需求。因此，寻找新的调控途径成为该领域的研究热点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种调控集胞藻生长速度的基因spkD及其应用。通过在集胞藻PCC6803过量表达来源于铜绿微囊藻PCC7806的spkD基因可显著提高集胞藻在正常光照培养条件下的比生长率，同时可提高集胞藻在光限制胁迫后光恢复阶段的比生长率。

本发明技术方案如下：

调控集胞藻生长速度的基因spkD在提高集胞藻生长速度和/或提高光胁迫后恢复生长速度中的应用；所述基因spkD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述基因spkD来源于铜绿微囊藻PCC7806，共1074bp。

根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：

(1)以集胞藻PCC 6803psbA2ORF前500bp片段序列作为启动子片段，与上述调控集胞藻生长速度的基因spkD进行基因融合，制得融合片段Promotor+spkD；

所述启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)制备同源重组上游臂slr1285U基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(3)制备同源重组下游臂slr1285D基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(4)通过对质粒pBluscript SK plus进行SmaI内切酶酶切，然后PCR扩增大肠杆菌T1T2终止子，经SmaI内切酶酶切PCR扩增产物后，连接酶切产物，制得质粒p5S T1T2；

对质粒pKK233-2的T1T2终止子进行PCR扩增的引物序列如下：

T1T2-F:5’-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’；

T1T2-R:5’-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’；

(5)用KpnI内切酶酶切步骤(2)制得的同源重组上游臂slr1285U基因片段，与同样经KpnI内切酶酶切的步骤(4)制得的质粒p5S T1T2连接，制得质粒p5S T1T2-s1r1285U；

(6)用SacI内切酶酶切步骤(3)制得的同源重组下游臂s1r1285D基因片段，与同样经SacI内切酶酶切的步骤(5)制得的质粒p5S T1T2-s1r1285U连接，制得质粒p5ST1T2-s1r1285UD；

(7)用BamHI内切酶酶切质粒p5S-kan，回收卡那霉素kan片段，与同样经BamHI内切酶酶切的步骤(6)制得的质粒p5S T1T2-s1r1285UD连接，制得质粒p5ST1T2-kan-s1r1285UD；

(8)将步骤(1)制得的融合片段Promotor+spkD经SalI、ECoRI内切酶酶切后，与同样经SalI、EcoRI内切酶酶切的步骤(7)制得的质粒p5S T1T2-kan-slr1285UD连接，制得重组载体p5S1285UDspkD；

(9)将步骤(8)制得的重组载体p5S1285UDspkD转化集胞藻PCC6803，经筛选，制得转基因集胞藻。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(1)中，调控集胞藻生长速度的基因spkD以铜绿微囊藻PCC7806基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得，PCR扩增引物核苷酸序列如下：

spkD-fpsbA2P-F：5’-TAAGGAATTATAACCAAATGACGGATTTAATTCTAC-3’；

spkD-EcoRI-R：5’-CGCGAATTCTCAAAATGAGAATTGCTG-3’；

PCR扩增体系如下：

2×Taq plus MasterMix 10μL，模板DNA 1μL，引物spkD-fpsbA2P-F 1μL，引物spkD-EcoRI-R 1μL，ddH₂O 8μL，共计20μL。

PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸l min，35个循环后；72℃终延伸10min，4℃保存。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(1)中，启动子片段以集胞藻PCC 6803的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得，PCR扩增引物核苷酸序列如下：

Promotor-SalI-F:5’-AATGTCGACTGCCCAGATGCAGGCCTTC-3’；

Promotor-R:5'-GTAGAGCAGTTCACGCATTTGGTTATAATTCCTTAT-3'；

PCR扩增体系如下：

2×Taq plus MasterMix 10μL，模板DNA1μL，引物Promotor-SalI-F 1μL，引物Promotor-R1μL，ddH₂O 8μL，共计20μL。

PCR扩增程序如下：

根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，同源重组上游臂slr1285U基因片段以集胞藻PCC 6803的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得，PCR扩增引物核苷酸序列如下：

S1r1285U-KpnI-F:5’-ATAGGTACCGAAACCTGGGTGAGTCTGGCT-3'；

S1r1285U-KpnI-R:5’-ATAGGTACCTGTTGGAAGGTTGCTGATTACT-3'；

PCR扩增体系如下：

2×Taq plus MasterMix 10μL，模板DNA1μL，引物S1r1285U-KpnI-F 1μL，引物S1r1285U-KpnI-R 1μL，ddH₂O 8μL，共计20μL。

PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸l min，35个循环；72℃终延伸l0min，4℃保存。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(3)中，同源重组下游臂slr1285D基因片段以集胞藻PCC 6803的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得，PCR扩增引物核苷酸序列如下：

s1r1285D-SacI-F:5'-ATAGAGCTCTTTAGTGAAAAAATATTGAC-3'；

s1r1285D-SacI-R:5'-ATAGAGCTCGTCATCAGCCAGCAAAATTGC-3'；

PCR扩增体系如下：

2×Taq plus MasterMix 10μL，模板DNA1μL，引物s1r1285D-SacI-F 1μL，引物s1r1285D-SacI-R 1μL，ddH₂O 8μL，共计20μL。

PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸l min，35个循环后；72℃终延伸10min，4℃保存。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(4)中，对质粒pKK233-2的T1T2终止子进行PCR扩增的扩增体系如下：

2×Taq plus MasterMix 10μL，模板DNA1μL，引物T1T2-F 1μL，引物T1T2-R 1μL，ddH₂O8μL，共计20μL。

PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后；72℃终延伸10min，4℃保存。

有益效果

1.本发明首次公开了铜绿微囊藻PCC 7806的spkD基因在提高集胞藻生长速率的重要作用，构建的转基因集胞藻在正常培养条件下6天培养期内较野生型的比生长率平均提高13.97％，而在光限制胁迫后光恢复阶段(6天培养期)集胞藻spkD基因过量表达的突变株与野生型均表现出超补偿生长性能，超补偿生长阶段集胞藻突变株较野生型的比生长率平均提高7.13％；

2.采用本发明所述基因spkD可以构建重组集胞藻，其可以大幅提升集胞藻的生长速度及抗逆性能，进而提高了利用集胞藻规模化生产药物等高附加值产品的可行性。

附图说明

图1集胞藻PCC6803的铜绿微囊藻PCC7806spkD基因过量表达载体结构图；

图2集胞藻PCC6803的铜绿微囊藻spkD基因过量表达藻株PCR扩增检测电泳图；

图中：1、野生型基因组DNA PCR扩增结果，所用引物对为(Promotor-SalI-F，spkD-EcoRI-R)；2、P+SpkD突变株基因组DNA PCR扩增结果，所用引物对为(Promotor-SalI-F，spkD-EcoRI-R)；3、野生型基因组DNA PCR扩增结果，所用引物对为(spkD-fpsbA2P-F，T1T2-R)；4、P+SpkD突变株基因组DNA PCR扩增结果，所用引物对为(spkD-fpsbA2P-F，T1T2-R)；5、野生型基因组DNA PCR扩增结果，所用引物对为(Promotor-SalI-F，s1r1285D-SacI-R)；6、P+SpkD突变株基因组DNA PCR扩增结果，所用引物对为(spkD-fpsbA2P-F，s1r1285D-SacI-R)；

图3集胞藻PCC6803的铜绿微囊藻spkD基因过量表达藻株与野生型在正常光照培养条件下的比生长率差异特征曲线图；

图4集胞藻PCC6803的铜绿微囊藻spkD基因过量表达藻株与野生型在光限制胁迫后光恢复阶段的超补偿生长特征曲线图。

具体实施方式

以下实施例描述了本发明铜绿微囊藻PCC7806spkD基因在提高集胞藻PCC6803生长速率及抗逆性能方面的应用。下面结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

原料来源

大肠杆菌菌株(Escherichia coli)DH5α及快速连接载体T3购自北京全式金生生物技术有限公司；

野生型铜绿微囊藻PCC7806、集胞藻PCC6803购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库；

质粒pbluescript SK购自天津博美科生物技术有限公司；

质粒pBluescript-Kan购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；

其它所使用的酶、试剂及试剂盒等均为市售产品。

实施例1

构建转集胞藻PCC6803的铜绿微囊藻PCC7806spkD基因过量表达载体的spkD基因cDNA片段、psbA2启动子片段，同源重组上游片段s1r1285U cDNA片段和同源重组下游片段s1r1285D cDNA片段。

集胞藻PCC 6803psbA2启动子片段克隆：根据GenBank登录的集胞藻PCC6803：(登录号：BA000022,AP012205)中将psbA2ORF前500bp作为启动子序列，设计引物：

Promotor-SalI-F:5’-AATGTCGACTGCCCAGATGCAGGCCTTC-3’；

Promotor-R:5'-GTAGAGCAGTTCACGCATTTGGTTATAATTCCTTAT-3'；

PCR反应结束后进行电泳切胶回收，连接到T3载体克隆载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。获得集胞藻PCC 6803psbA2启动子片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

扩增大肠杆菌T1T2终止子的质粒pKK233-2(购自Clontech公司)：根据GenBank登陆的大肠杆菌T1T2片段序列设计引物：

T1T2-F:5’-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’；

T1T2-R:5’-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’；

扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后；72℃终延伸10min，4℃保存；

Promotor+spkD片段克隆：

提取铜绿微囊藻PCC7806基因组DNA，根据GenBank登录的铜绿微囊藻PCC7806spkD基因序列(登录号：AM778950.1，片段长度为1073bp)设计引物：

spkD-fpsbA2P-F：5’-TAAGGAATTATAACCAAATGACGGATTTAATTCTAC-3’；

spkD-EcoRI-R：5’-CGCGAATTCTCAAAATGAGAATTGCTG-3’；

扩增程序如下：

PCR反应结束后进行电泳切胶回收，获得铜绿微囊藻PCC 7806spkD基因片段，核苷酸序列SEQ ID NO.1所示。

分别取psbA2启动子片段和铜绿微囊藻PCC 7806spkD基因片段2μL为模板，进行融合PCR反应，所用程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸5min，2个循环；加入引物Promotor-SalI-F和spkD-EcoRI-R各0.5μL，进行如下程序：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，25个循环；72℃延伸l0min，4℃保存。连接到T3载体克隆载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。获得Promotor+spkD片段。

同源重组上游臂s1r1285U基因片段克隆：

根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803slr1285序列(登录号为：CP003265.1)上游1627bp到上游624bp处作为上游臂，设计扩增引物：

s1r1285U-KpnI-F:5’-ATAGGTACCGAAACCTGGGTGAGTCTGGCT-3'；

sr1285U-KpnI-R:5’-ATAGGTACCTGTTGGAAGGTTGCTGATTACT-3'；

扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸l min，35个循环；72℃终延伸l0min，4℃保存。PCR反应结束后进行电泳切胶回收，获得同源重组上游臂s1r1285U基因片段。

同源重组下游臂s1r1285D基因片段克隆：

根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803slr1285序列(登录号为：CP003265.1)上游611bp到s1r1285ORF 392bp处作为下游臂，设计扩增引物：

s1r1285D-SacI-F:5'-ATAGAGCTCTTTAGTGAAAAAATATTGAC-3'；

s1r1285D-SacI-R:5'-ATAGAGCTCGTCATCAGCCAGCAAAATTGC-3'；

扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸l min，35个循环后；72℃终延伸10min，4℃保存。PCR反应结束后进行电泳切胶回收，获得同源重组下游臂s1r1285D基因片段。

实施例2

质粒pBluscript SK plus-T1T2的制备：

扩增大肠杆菌T1T2终止子的质粒pKK233-2(购自Clontech公司)，在其5’端引入PstI酶切位点，在其3’端引入BamHI酶切位点，所用引物为：

T1T2-F:5’-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’；

T1T2-R:5’-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’；

扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后；72℃终延伸10min，4℃保存；获得基因片段经PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescriptSK连接，得到质粒pBluescript SK T1T2。

实施例1制得的同源重组上游臂slrl285U基因片段用KpnI单酶切，回收s1r1285U基因片段；用同样的方法单酶切质粒pBluescript SK T1T2，回收载体片段1。连接回收的s1r1285U基因片段和载体片段1，转化大肠杆菌DH5α。通过筛选阳性克隆，获得前期载体，命名为pBluescript SK T1T2-s1r1285U。

连接反应体系为：

T4DNA连接酶1μL，载体片段3μL，目的片段3μL,10×T4DNA ligation Buffer 2μL，ddH₂O 11μL，总反应体系为20μL。6℃连接过夜。

实施例1制得的同源重组下游臂s1r1285D基因片段用SacI单酶切，回收s1r1285D基因片段；用同样的方法单酶切pBluescript SK T1T2-s1r1285U回收载体片段2。连接回收的s1r1285D基因片段和载体片段2，转化大肠杆菌DH5α。通过筛选阳性克隆，获得前期载体，命名为pBluescript SK T1T2-s1r1285UD。

连接反应体系为：

T4DNA连接酶1μL，载体片段3μL，目的片段3μL,10×T4DNA ligation Buffer 2μL，ddH₂O 11μL，总反应体系为20μL。16℃连接过夜。

将质粒pBluescript-Kan用BamHI单酶切，回收卡那霉素抗性Kan片段，质粒pBluescriptSKT1T2-s1r1285UD用BamHI单酶切，回收载体片段3。连接回收的Kan片段和载体片段3，转化大肠杆菌DH5α，通过酶切筛选阳性克隆，获得卡那霉素抗性载体，命名为pBluescript SK T1T2-Kan-s1r1285UD。

连接反应体系为：

T4DNA连接酶1μL，载体片段3μL，目的片段3μL，10×T4DNA ligation Buffer 2μL，ddH₂O 11μL，总反应体系为20μL。16℃连接过夜。

将实施例1中得到的阳性克隆Promotor+spkD质粒DNA用SalI、EcoRI酶切，回收基因片段Promotor+spkD。同样，对含有T1T2终止子且具有卡那霉素抗性的质粒pBluescriptSKT1T2-Kan-s1r1285UD进行SalI、EcoRI单酶切，回收载体片段4。连接基因片段Promotor+spkD和载体片段4，转化大肠杆菌DH5α。

连接反应体系为：

T4DNA连接酶1μL，载体片段3μL，目的片段3μL,10×T4DNA ligation Buffer 2μL，ddH₂O 11μL，总反应体系为20L。16℃连接过夜。

通过酶切筛选阳性克隆，获得集胞藻PCC6803原核表达载体，命名为表达载体p5S1285UDspkD，如图1所示。

通过自然转化方法(Williams,J.G.K.,1988.Construction of specificmutationsin photosystemII photosynthetic reaction center by geneticengineering methods in Synechocystis 6803.Methods Enzymol.l67:766-778.)将构建好的载体导入集胞藻PCC6803中，经抗生素筛选，鉴定得到转基因阳性集胞藻，步骤如下：

取对数培养期(OD₇₃₀＝0.6)的集胞藻PCC6803培养液30m1，在室温条件下，4500g离心8min，弃上清；加新鲜BG-11液体培养基洗涤一次后，加新鲜BG-11液体培养基至终浓度OD₇₃₀＝4.8，并立刻用来转化；将收集的藻液分装到到1.5m1EP管中(每管400μL)，每管加5-10μg质粒，弱光条件下光照温育6小时，期间摇晃一次。将混合物涂到含有卡那抗生素(50μg/ml)的BG-11平板培养基上。约10天可见转化子。制得含铜绿微囊藻PCC7806spkD基因过表达载体p5S1285UD spkD的转基因集胞藻PCC6803。

实施例3

铜绿微囊藻spkD基因过量表达藻株PCR检测

以含表达载体p5S1285UD spkD的转基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803为材料，提取总DNA进行PCR检测分析。具体方法如下：

采用中性酚试剂(购自工nvitrogen公司)并利用玻璃珠震荡法从spkD基因过表达的集胞藻和野生型集胞藻中提取DNA。具体操作步骤如下：取50m1OD₇₃₀＝1.8的蓝藻，4℃，5000rpm离心10min收集藻细胞，加入0.4mL中性酚接0.4mL BG-11液体培养基，然后加入适量的直径为0.17mm左右的玻璃珠(购自sigma公司)至玻璃珠界面上方有0.5mL的悬浮液。通过涡旋振荡器以最大速率震荡1min，4℃，11900rpm离心10min，取上清液至新的1.5m1离心管中，加入0.5mL苯酚/三氯甲烷/异戊醇(体积比25:24:1)，颠倒混匀15s，静置3-5min，4℃，11900rpm离心10-15min。取上清到新的1.5m1离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min。4℃，11900rpm离心10min。去上清，加入1ml 75％乙醇(V/V)，颠倒振荡几次，4℃，7500rpm离心10min。弃上清，室温下敞口晾干至沉淀透明，加入适量ddH₂O溶解沉淀，制得spkD基因过表达的集胞藻和野生型集胞藻总DNA。

以spkD基因过量表达转基因集胞藻基因组DNA和野生型集胞藻DNA为模板，以S1r1285U-KpnI-F和S1r1285D-SacI-R为引物，进行PCR扩增，具体扩增程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后；72℃终延伸10min，4℃保存。电泳检测PCR产物如图2所示。

实施例4

过表达铜绿微囊藻PCC7806spkD基因集胞藻PCC 6803生长性能测定

将野生型集胞藻PCC 6803和spkD基因过量表达转基因藻株分别接种于50m1BG-11液体培养基中，调节OD₇₃₀＝0.1，于30℃，在光照强度40μmol/m²·s持续光照条件下振荡培养(180rpm)，分别于1天，2天，3天，4天，5天，6天取样，采用血球计数板计数藻细胞数目，采用公式μ＝(lnN_t-lnN₀)/t(Nt是t时间的藻细胞密度，N₀藻细胞的初始密度，t是培养时间)计算比生长率，结果表明在正常光照培养条件下过表达spkD基因集胞藻较野生型的比生长率平均提高13.97％。

实施例5

过表达铜绿微囊藻PCC7806spkD基因集胞藻PCC 6803在光限制胁迫下生长性能的测定。

将野生型集胞藻PCC6803和基因spkD过量表达转基因藻株分别接种于50m1BG-11液体培养基中，调节OD₇₃₀＝2.0，于30℃，在光照强度0μmol/m²·s黑暗条件下振荡培养(180rpm)6d，随后将野生型集胞藻PCC 6803和spkD基因过量表达转基因藻株调至相同细胞密度(OD₇₃₀＝1.0)，光恢复阶段以相同初始密度未受光限制胁迫的野生型集胞藻PCC6803为空白对照，分别于1天，2天，3天，4天，5天，6天取样，采用血球计数板计数藻细胞数目。采用公式μ＝(lnN_t-lnN₀)/t(Nt是t时间的藻细胞密度，N₀藻细胞的初始密度，t是培养时间)计算比生长率，结果表明在光限制胁迫(0μmol/m²·s，6d)后，野生型集胞藻PCC6803和spkD基因过量表达转基因藻株的生长速率均显著超过未受光限制胁迫的野生型集胞藻PCC6803(P<0.05、P<0.05)，即两者均表现出明显的超补偿生长性能；光恢复阶段spkD基因过量表达转基因藻株较受胁迫后光恢复阶段野生型集胞藻6803的比生长率平均提高7.13％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 天津农学院

山东省农业科学院生物技术研究中心

<120> 一种调控集胞藻生长速度的基因spkD的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1074

<212> DNA

<213> 铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)

<400> 1

atgacggatt taattctaca aaatcgttac aaagtcctgc gattaattgc cgatggtggt 60

ttcggagaga cttttttggc agaagatagc caaatgcctt caaaacgtct ctgtctgatt 120

aaacagctaa aaccgattaa tgacaatccc caggttcaca atcttgtcaa agaaaggttt 180

gagcgagaag cggctatcct ggaaaaattg agcgaaaata gtccccaaat tcccaaacta 240

tacgcttatt ttgaggaaaa taatcaattt tatttagtcg aggaatttat cgagggagaa 300

actctcagcc aaagaataca gagtaaagga gtttttagcg atgatcaagt caaagagatt 360

ttagttagta ttctacaggt tttaatttat gttcacggac aaaaaattat ccatcgagat 420

ataaaacccg ataatatcat tctacggatt tatgataatt taccgatcct aattgatttc 480

ggtgcggtta aagaaactat gggaacggtg gtttctaatt cgggccattc tcttaattct 540

attgttatcg gtactccggg ttttatgcca tcagaacagg cgatcggtcg tccggtttat 600

agtagtgatc tctacgcttt aggattgacg gctatttatc tactaaccgg caaaactcct 660

gaaatgttag agagcgatcc gatgacagga aaaatttatt ggcggcagtt cgctttaaat 720

actaatatca gtttagcagc tgtgttagat aaaactattt cactgcgctc taacgaacgt 780

tatttaaccg caaaagagat gttagaagcg ctacaaaata ccccatcaat tgtagcaaca 840

aatatcgtta tccccgctgc tactcccgct cctactcaag taatttctcc tgtaacttca 900

aaacctgttt ctaatccccg cactttacct gaatgggtga aagcgataat tatagggagt 960

atgatcggta ctggcatttt aggtggtttt gtcttaagtc attatctctc aaattcttct 1020

ggagataaat caatttctcc gtcaccttcc ccagagcagc aattctcatt ttga 1074

<210> 2

<211> 357

<212> PRT

<213> 集胞藻(Microcystis aeruginosa)

<400> 2

Met Thr Asp Leu Ile Leu Gln Asn Arg Tyr Lys Val Leu Arg Leu Ile

1 5 10 15

Ala Asp Gly Gly Phe Gly Glu Thr Phe Leu Ala Glu Asp Ser Gln Met

20 25 30

Pro Ser Lys Arg Leu Cys Leu Ile Lys Gln Leu Lys Pro Ile Asn Asp

35 40 45

Asn Pro Gln Val His Asn Leu Val Lys Glu Arg Phe Glu Arg Glu Ala

50 55 60

Ala Ile Leu Glu Lys Leu Ser Glu Asn Ser Pro Gln Ile Pro Lys Leu

65 70 75 80

Tyr Ala Tyr Phe Glu Glu Asn Asn Gln Phe Tyr Leu Val Glu Glu Phe

85 90 95

Ile Glu Gly Glu Thr Leu Ser Gln Arg Ile Gln Ser Lys Gly Val Phe

100 105 110

Ser Asp Asp Gln Val Lys Glu Ile Leu Val Ser Ile Leu Gln Val Leu

115 120 125

Ile Tyr Val His Gly Gln Lys Ile Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Asp

130 135 140

Asn Ile Ile Leu Arg Ile Tyr Asp Asn Leu Pro Ile Leu Ile Asp Phe

145 150 155 160

Gly Ala Val Lys Glu Thr Met Gly Thr Val Val Ser Asn Ser Gly His

165 170 175

Ser Leu Asn Ser Ile Val Ile Gly Thr Pro Gly Phe Met Pro Ser Glu

180 185 190

Gln Ala Ile Gly Arg Pro Val Tyr Ser Ser Asp Leu Tyr Ala Leu Gly

195 200 205

Leu Thr Ala Ile Tyr Leu Leu Thr Gly Lys Thr Pro Glu Met Leu Glu

210 215 220

Ser Asp Pro Met Thr Gly Lys Ile Tyr Trp Arg Gln Phe Ala Leu Asn

225 230 235 240

Thr Asn Ile Ser Leu Ala Ala Val Leu Asp Lys Thr Ile Ser Leu Arg

245 250 255

Ser Asn Glu Arg Tyr Leu Thr Ala Lys Glu Met Leu Glu Ala Leu Gln

260 265 270

Asn Thr Pro Ser Ile Val Ala Thr Asn Ile Val Ile Pro Ala Ala Thr

275 280 285

Pro Ala Pro Thr Gln Val Ile Ser Pro Val Thr Ser Lys Pro Val Ser

290 295 300

Asn Pro Arg Thr Leu Pro Glu Trp Val Lys Ala Ile Ile Ile Gly Ser

305 310 315 320

Met Ile Gly Thr Gly Ile Leu Gly Gly Phe Val Leu Ser His Tyr Leu

325 330 335

Ser Asn Ser Ser Gly Asp Lys Ser Ile Ser Pro Ser Pro Ser Pro Glu

340 345 350

Gln Gln Phe Ser Phe

355

<210> 3

<211> 550

<212> DNA

<213> 集胞藻(Synechocystis sp.)

<400> 3

tgcccagatg caggccttct ggcgatcgcc atggtgagca acgattgcgg ctttagcgtt 60

ccagtggata tttgctgggg gttaatgaaa cattgtggcg gaacccaggg acaatgtgac 120

caaaaaattc agggatatca ataagtatta ggtatatgga tcataattgt atgcccgact 180

attgcttaaa ctgactgacc actgacctta agagtaatgg cgtgcaaggc ccagtgatca 240

atttcattat ttttcattat ttcatctcca ttgtccctga aaatcagttg tgtcgcccct 300

ctacacagcc cagaactatg gtaaaggcgc acgaaaaacc gccaggtaaa ctcttctcaa 360

cccccaaaac gccctctgtt tacccatgga aaaaacgaca attacaagaa agtaaaactt 420

atgtcatcta taagcttcgt gtatattaac ttcctgttac aaagctttac aaaactctca 480

ttaatccttt agactaagtt tagtcagttc caatctgaac atcgacaaat acataaggaa 540

ttataaccaa 550

<210> 4

<211> 1000

<212> DNA

<213> 集胞藻(Synechocystis sp.)

<400> 4

gaaacctggg tgagtctggc ttgggtatag agcaacaaaa ttctctgcag ttggggagac 60

tgctcaaact ctcgtaaaag tatatgggca cttagtttcc aagcttcccc ttgcacctgg 120

acgatgacct ggcttgtggt ttgttttccc cccagaataa tgggcaatcc caccattcct 180

tcattgccaa ttaaaccaat ttctgtggtg gagccatctt ccataattga gacaacggaa 240

atcatagctg tattgggaaa ataggcaaat tccatcacct cattgggctc gtatagtact 300

gtgccggtct tgtagacaac ttttttgaga tggggcgcta aacgtttata agcttcgacg 360

gggaggagtc ctaataactg atttaatttt atgggaggat tattggtcat tggcaatgca 420

attaattaaa aatggcatct caattcacta acaatcataa gggttgtatg ctaacgccac 480

ttagattcat ttgaattaaa atgtttatga ctccttgtct cccaaagctt ggaaaaattt 540

actctgcacg ataagctgat ctctgtatag agtaaggatt gtgcgcaaac gggacgccgg 600

tcaggcccaa accaagagtt tatcttcgga actacattct tatctgtacg aaacaggact 660

ttaggagaat ttattaatag aaaattttcc ggccatagtc aatatcaagg cgatttagtc 720

tcgacttcaa cctttttact ctgtaattca taaatctttt aatccgattt agtgaaaata 780

atcaattctc tatggcctcg atgatggcga tcgccaaaac ttgatagctg gtgccgattt 840

tatttttttc ggtaactaag tatctctatt agacttgata caaaacagga ttctacagtg 900

agaaatacta aatttattag cgtttttttc tgtctgtgtt gggtccgatt tcactgtggg 960

ggcgatcgcc aagggtggag taatcagcaa ccttccaaca 1000

<210> 5

<211> 1003

<212> DNA

<213> 集胞藻(Synechocystis sp.)

<400> 5

tttagtgaaa aaatattgac attaagatat cttaattgac tctcggtgat ctcttcttca 60

aaaggagtga agtcatgacc agttctagca ttgatggcgt gggggtggca tttttagtac 120

gggtttagac cggcgatcgg ttgcttaaaa ataacagggt gacggagttc ttccgctgga 180

tatgttcacc gtaggaggac aattgctcgg agtagttgac accaccagtg caaaacctta 240

attaggtaat tagattttaa aaccgcataa actcataatt tctattggat cgtacctgcg 300

ccaatgatca tagtgttaat gcatcacaaa aatgattgag gaattaacgt agttttgccc 360

tggtcaagac ggagagcggt ataggtttgt catcctttct tcgcgccttt gcgtccatcc 420

gtcggatttt gttcggtttt acgcctaagg gggaaaggaa aatgggctta ccatcaggga 480

gagaggccac acaagactgc tgagtctgtt aaattgcagt ggcaaaaagt ttgctatttc 540

ctattccctt tcagaacatc gtcccccgtt gttaccgctg ttaactttcc catcctaaaa 600

atctggttcc cgtgaatgaa gtttgcctaa agttgagtga tttgtttgtg tcttccggtt 660

ggggaggata tgaccgaggg cgggctcccc agtgggccca tcccagagca cagcaacaat 720

ggtttggggc gatcgccgct ttggaaccat ttttaagaca aactttgccc aatgttgggg 780

gagaattacc gggaatttgt ttgacgggcc ctgccccagt gctgaaagat gcggtgctgg 840

tgcgaaattt ttaccaaggc attgccaccc cctgggaaga gttttccccc tggccctgtt 900

tagctggcga ggaatccgaa tggagtgctg tcccccccat gcgggaaatt cccctgtttc 960

cccaggaccc cttggcggaa gagcaatttt gctggctgat gac 1003

Claims

1.调控集胞藻生长速度的基因spkD在提高集胞藻生长速度和/或提高光胁迫后恢复生长速度中的应用；所述基因spkD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)以集胞藻PCC 6803 psbA2 ORF前500bp片段序列作为启动子片段，与上述调控集胞藻生长速度的基因spkD进行基因融合，制得融合片段Promotor+spkD；

所述启动子片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

对质粒pKK233-2的T1T2终止子进行PCR扩增的引物序列如下：

T1T2-F:5’-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’；

T1T2-R:5’-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’；

(6)用SacI内切酶酶切步骤(3)制得的同源重组下游臂s1r1285D基因片段，与同样经SacI内切酶酶切的步骤(5)制得的质粒p5S T1T2-s1r1285U连接，制得质粒p5S T1T2-s1r1285UD；

(7)用BamHI内切酶酶切质粒p5S-kan，回收卡那霉素kan片段，与同样经BamHI内切酶酶切的步骤(6)制得的质粒p5S T1T2-s1r1285UD连接，制得质粒p5S T1T2-kan-s1r1285UD；

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，调控集胞藻生长速度的基因spkD以铜绿微囊藻PCC7806基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得，PCR扩增引物核苷酸序列如下：

spkD-fpsbA2P-F：5’-TAAGGAATTATAACCAAATGACGGATTTAATTCTAC-3’；

spkD-EcoRI-R：5’-CGCGAATTCTCAAAATGAGAATTGCTG-3’；

PCR扩增体系如下：

2×Taq plus MasterMix 10μL，模板DNA 1μL，引物spkD-fpsbA2P-F 1μL，引物spkD-EcoRI-R 1μL，ddH₂O 8μL，共计20μL；

PCR扩增程序如下：

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，启动子片段以集胞藻PCC6803的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得，PCR扩增引物核苷酸序列如下：

Promotor-SalI-F:5’-AATGTCGACTGCCCAGATGCAGGCCTTC-3’；

Promotor-R:5'-GTAGAGCAGTTCACGCATTTGGTTATAATTCCTTAT-3'；

PCR扩增体系如下：

2×Taq plus MasterMix 10μL，模板DNA1μL，引物Promotor-SalI-F 1μL，引物Promotor-R 1μL，ddH₂O 8μL，共计20μL；

PCR扩增程序如下：

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，同源重组上游臂slr1285U基因片段以集胞藻PCC 6803的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得，PCR扩增引物核苷酸序列如下：

S1r1285U-KpnI-F:5’-ATAGGTACCGAAACCTGGGTGAGTCTGGCT-3'；

S1r1285U-KpnI-R:5’-ATAGGTACCTGTTGGAAGGTTGCTGATTACT-3'；

PCR扩增体系如下：

2×Taq plus MasterMix 10μL，模板DNA1μL，引物S1r1285U-KpnI-F 1μL，引物S1r1285U-KpnI-R 1μL，ddH₂O 8μL，共计20μL；

PCR扩增程序如下：

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，同源重组下游臂slr1285D基因片段以集胞藻PCC 6803的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得，PCR扩增引物核苷酸序列如下：

s1r1285D-SacI-F:5'-ATAGAGCTCTTTAGTGAAAAAATATTGAC-3'；

s1r1285D-SacI-R:5'-ATAGAGCTCGTCATCAGCCAGCAAAATTGC-3'；

PCR扩增体系如下：

2×Taq plus MasterMix 10μL，模板DNA1μL，引物s1r1285D-SacI-F 1μL，引物s1r1285D-SacI-R 1μL，ddH₂O 8μL，共计20μL；

PCR扩增程序如下：

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，对质粒pKK233-2的T1T2终止子进行PCR扩增的扩增体系如下：

2×Taq plus MasterMix 10μL，模板DNA1μL，引物T1T2-F 1μL，引物T1T2-R 1μL，ddH₂O8μL，共计20μL；

PCR扩增程序如下：