CN109207516A - 一种药物诱导的基因转录激活方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体公开了一种药物诱导的基因转录激活方法。通过转染(ERT2)n‑TALE‑ADs系统或共转染HIT TALE‑SunTag体系至细胞质内，在特定需要的时间利用4‑OHT和/或TAM和/或他们的衍生物进行药物诱导，实现特定基因的转录激活；所述(ERT2)n‑TALE‑ADs系统为可表达(ERT2)n‑TALE‑ADs融合蛋白的载体；所述HIT TALE‑SunTag体系为可分别表达融合蛋白(1)与融合蛋白(2)中的一种或多种的载体组合：(1)NLS‑TALE‑GCN4或ERT2‑TALE‑GCN4或(ERT2)n‑TALE‑GCN4，(2)ScFv‑ERT2‑ADs或ScFv‑(ERT2)n‑ADs。本发明基于ERT2的融合实现了4‑OHT诱导的TALE转录激活体系。该体系有助于对动态生物学过程进行有效地精确地控制，对于生物医药的研究和开发应用也有很大的价值。

Description

一种药物诱导的基因转录激活方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种药物诱导的基因转录激活方法。
背景技术
从靶向基因组编辑到转录调控，TALE蛋白以被广泛应用于不同领域。Tal蛋白包括一系列的重复区域，每个重复区域包含33-34个氨基酸。中间重复可变的双氨基酸序列区域(repeat variable diresidues，RVDs)决定了最先结合的碱基。简单的一对一的“Tal密码”连接在一起决定了Tal阵列与DNA结合的特异性，因此当TAL与基因或表观调控相关的效应因子融合时，可以靶向到特定基因位点发挥作用。例如，当TALE与转录激活结构域(activator domain，AD)如VP64融合时，靶向启动子序列的Tal阵列可以介导特异性地基因转录激活。
许多生物过程是受到高度动态的分子反应来调控的。因此，为了更精确的理解这些过程，条件的和可诱导的调控系统显得尤为必要。现阶段一种广泛应用的药物诱导技术是通过配体结合激发雌激素受体蛋白(Estrogen Receptor，ER)从细胞质到细胞核的转运过程(Metzger，D.，Clifford，J.，Chiba，H.&Chambon，P.Conditional site-specificrecombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Crerecombinase.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America92，6991-6995，1995)。在没有激素配体的情况下，ER与热激蛋白(hsp90)结合定位于细胞质中。一旦配体与ER结合，ER与hsp90解离，并转运到细胞核中。
ERT2是一种带有三个氨基酸突变G400V/M543A/L544A的人为突变体，与ER相比，其对合成的雌激素拮抗剂4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-OHT)更为敏感，并且不会与内源的ER配体β-雌二醇结合，这一特性对降低背景活性是至关重要的(Feil，R.，Wagner，J.，Metzger，D.&Chambon，P.Regulation of Cre recombinase activity by mutatedestrogen receptor ligand-binding domains.Biochemical and biophysical researchcommunications237，752-757，1997)。ERT2与Cre重组酶的融合已经被广泛应用到条件性和可诱导的基因组工程中，这一应用有利于研究者从时空顺序上更精确地解析分子功能。
目前，利用TALE实现药物诱导的转录激活方面的研究已有一些成功的报道，但在应用上具有一定的局限性。转录水平的调控方式通常应答速度较慢，且组织特异性启动子的选择相对较少，相比之下，针对翻译后蛋白活性的调节可能是更为理想的方式。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种药物诱导的基因转录激活方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种药物诱导的基因转录激活方法，通过转染(ERT2)n-TALE-ADs系统或共转染HIT TALE-SunTag体系至细胞质内，在特定需要的时间利用他莫昔芬(tamoxifen，TAM)和/或4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-OHT)和/或他们的衍生物进行药物诱导，实现特定基因的转录激活；
所述(ERT2)n-TALE-ADs系统为可表达(ERT2)n-TALE-ADs融合蛋白的载体；其中，n＝2-5，ADs为转录效应因子组合，所述转录效应因子选自V、P、R、H中的一种或多种；
所述HIT TALE-SunTag体系为可分别表达融合蛋白(1)与融合蛋白(2)中的一种或多种的载体组合：
(1)NLS-TALE-GCN4或ERT2-TALE-GCN4或(ERT2)n-TALE-GCN4，
(2)ScFv-ERT2-ADs或ScFv-(ERT2)n-ADs，
上述融合蛋白由左至右均为N端至C端。
其中，ADs为转录效应因子组合，所述转录因子选自V、P、R、H中的一种或多种；V为VP64，P为P65，R为Rta，H为HSF1，nERT2为n个串联的ERT2，TALE为针对靶标基因的类转录激活因子效应物，NLS为核定位信号，GCN4为来自酵母转录激活因子GCN4的一段抗原表位短肽，ScFv为抗GCN4肽的单链抗体可变区。ScFV和GCN4的序列参考文献(Tanenbaum等，Aprotein-tagging system for signal amplification in gene expression andfluorescence imaging.Cell 159，635-646(2014)。
在上述技术方案中，GCN4为5-30个拷贝的来自酵母转录激活因子GCN4的一段抗原表位短肽，优选为10个拷贝的GCN4短肽。
上述元件皆为本领域常用的功能元件，可按照本领域常规选择进行使用，本发明对此不再作进一步的限定。
在本发明的具体实施方式中，通过实验验证了使用2个串联的ERT2融合TALE和ADs的效果，以及2个串联的ERT2参与HIT TALE-SunTag体系的效果。对于本领域技术人员来说，在该实验结论的基础上，可以根据本领域常规技术知识毫无疑义的推知，当将2个串联的ERT2替换为3-5个串联的ERT2也可具有相同/相似的技术效果。将上述(ERT2)n-TALE-ADs系统或HIT TALE-SunTag体系转染至细胞质内，在细胞质内表达所述融合蛋白或融合蛋白组合，在特定需要时间，在动物体内或细胞生长环境中引入4-OHT和/或TAM和/或他们的衍生物，则细胞质内的融合蛋白将进入细胞核，TALE将识别目标DNA并与其结合，通过与TALE直接相连的转录因子的作用，或者通过与TALE相连的GCN4肽与其对应的ScFv抗体的结合募集所连接的转录因子到靶位点发挥转录激活作用。
本发明经实验研究发现，相对于现有技术，采用前述方法能够更加有效的实现药物诱导对转录激活的调控作用，操作更为灵活方便，且保持较低的背景活性。
第二方面，本发明提供了一种用于基因转录激活的药物诱导型融合蛋白，所述融合蛋白自N端至C端由以下元件依序相连：2-5个串联的ERT2、针对靶标基因的TALE和ADs。
进一步地，所述ADs优选为VP64、P65和HSF1的转录因子组合，所述串联的ERT2优选为2个，即2ERT2-TALE-VPH。
进一步地，各元件之间通过3～20个氨基酸的linker相连，linker通常为构象自由的序列，例如连续的Gly-Ser。
应当理解的是，所述融合蛋白由于linker的自由性，其编码基因并不局限于特定的核苷酸序列。
进一步地，所述融合蛋白的编码基因，及含有所述编码基因的载体也属于本发明的保护范围。
所述载体可以是DNA载体、RNA载体、蛋白质载体、慢病毒载体、腺病毒载体或普通质粒载体等。
在本发明的实验研究中，使用慢病毒慢病毒pRRL.sin-18.ppy载体。
本发明还提供了另一种用于基因转录激活的药物诱导型融合蛋白组合，包括融合蛋白(1)与融合蛋白(2)中的一种或多种：
(1)NLS-TALE-GCN4或ERT2-TALE-GCN4或(ERT2)n-TALE-GCN4，
(2)ScFv-ERT2-ADs或ScFv-(ERT2)n-ADs，
其中，ADs为转录效应因子组合，所述转录效应因子选自V、P、R、H中的一种或多种；TALE为针对靶标基因的类转录激活因子效应物，(ERT2)n为n个串联的ERT2，n＝2-5；NLS为核定位信号，GCN4为来自酵母转录激活因子GCN4的一段抗原表位短肽，ScFv为抗GCN4肽的单链抗体可变区。
进一步地，编码所述融合蛋白组合的载体组合，及含有所述载体组合的载体或含有所述载体组合中载体的载体组合也属于本发明的保护范围。
本发明涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明基于ERT2的融合实现了4-OHT诱导的TALE转录激活体系。该体系有助于对动态生物学过程进行有效地精确地控制，对于生物医药的研究和开发应用也有很大的价值。通过应用HIT TALE-SunTag体系可以实现最高效的转录激活。在没有4-OHT的情况下HITTALE-SunTag体系没有检测到任何背景激活信号，这与直接融合策略的较高背景活性形成鲜明的对比。HIT TALE-SunTag体系的结果表明最优化的策略是让功能性的效应因子受到严格的药物调控并让TAL最大化结合靶向序列。VPH的组合在不同的策略中都显示了相当高的活性，并且在HIT TALE-SunTag体系中将VPH分开变为V+PH的组合显示了更高的分子间协同效应。本发明也证明了，基于HIT TALE-SunTag体系的药物诱导的基因的转录激活是可逆的，撤除药物后基因的表达水平可快速下调，并可在再次加药处理后恢复到激活状态。同时，HIT TALE-SunTag对于4-OHT具有高度的选择性，避免了內源雌激素受体β-雌二醇的干扰，且表现出对4-OHT诱导的快速应答。这些特性对于更为灵活的应用HIT TALE-SunTag体系对特定基因的转录调控极为重要。相似的设计可以应用到其他类型的功能调控例如转录抑制和表观遗传的调控。
附图说明
图1为本发明实施例1中的激活的Sox2基因mRNA水平定量PCR检测图。
图2为本发明实施例1中ERT2融合在TALE-VP64的N端激活的mCherry报告基因荧光检测图。
图3为本发明实施例1中ERT2融合在TALE-VP64两端对mCherry激活的荧光检测图。
图4为本发明实施例1中的激活的Sox2基因mRNA水平定量PCR检测图。
图5为本发明实施例1中的激活的Sox2基因mRNA水平定量PCR检测图。
图6为本发明实施例1中的激活的Sox2基因mRNA水平定量PCR检测图。
图7为本发明实施例1中的激活的Sox2基因mRNA水平定量PCR检测图。
图8为本发明实施例1中的激活的Sox2基因mRNA水平定量PCR检测图。
图9为本发明实施例1中的激活的Sox2、Klf4、cMyc和Neurog2基因定量PCR检测图。
图10为本发明实施例1中对HIT TALE-SunTag体系受药物诱导的可逆性，对药物的选择性和应答速度的检测图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例是利用一个靶向人內源SOX2基因启动子区14-bp序列的TAL作为代表来构建药物诱导的TALE系统，该TALE来自Feng Zhang实验室，含有12.5个重复的Tal序列(Addgene plasmids#35388)。在TALE的N端分别融合一个或者两个串联的ERT2，再将多个转录激活结构域(ADs)，包括VP64(V)，P65(P)，Rta(R)和HSF1(H)，以不同的组合方式融合到Sox2TALE的C末端。V和H都是以质粒(来自Feng Zhang实验室，Addgene plasmids#353885and#61426 19)为模板扩增得到，而P和R是由公司(Genewiz)合成，序列参考自Chavez A.et.Al.的报导(Chavez，A.et al.Highly efficient Cas9-mediatedtranscriptional programming.Nature methods12，326-328(2015).)。TALE-SunTag系统相关质粒，是将10个拷贝的GCN4片段融合到ERT2-Sox2TALE或2ERT2-Sox2TALE或者3xNLS-Sox2TALE的C末端而构建的。此外，我们还将一系列不同组合的转录激活因子克隆到ScFv-sfGFP-GB1-ERT2或ScFv-sfGFP-GB1-2ERT2的C末端。ScFv-sfGFP-GB1和10×GCN4元件根据Tanenbaum M.E.et.al.报导(Tanenbaum，M.E.，Gilbert，L.A.，Qi，L.S.，Weissman，J.S.&Vale，R.D.A protein-tagging system for signal amplification in gene expressionand fluorescence imaging.Cell159，635-646(2014).)中的序列由公司(Genewiz)合成。具体为：将一个ERT2或两个串联的ERT2分别融合到一代的TALE-VP64的N端，分别得到ERT2-TALE-VP64和2ERT2-TALE-VP64，二者均实现了4-OHT诱导的靶基因激活。激活的实验通过检测内源的SOX2的表达和SOX2靶向序列调控的mCherry的报告系统完成(图1，图2)。不过，由实验结果可以看到，在没有4-OHT的刺激下，直接融合的设计始终有较高的背景活性。
本实施例还同时验证了，将两个ERT2分别融合到TALE-VP64的N端和C端(图3a)，并在mCherry报告系统内检测TALE对mCherry的激活效率。结果发现，当ERT2融合到TALE-VP64的C端时，mCherry无法被有效激活(图3b)，因此排除了在融合蛋白C端加入ERT2实现药物诱导的转录激活的设计。
据报道，VP64和其他的ADs(包括P65(P)，Rta(R)和HSF1(H))的协同作用可以产生更高的激活效率。因此本发明将不同组合的ADs串联融合到TALE-VP64的C末端。
首先，融合P65(P)，RTA(R)到ERT2-TALE-VP64和2ERT2-TALE-VP64的C末端，这样就形成了一个之前报道过的组合(VPR)。实验发现，在不经过4-OHT的处理下，与一个ERT2的设计相比，融合两个ERT2的设计虽然药物诱导效率有所降低，但是可以进一步降低背景活性(图4)。考虑到降低药物诱导系统的背景活性是至关重要的，因此，在之后的实验中，集中检测2ERT2与不同的ADs的组合的转录激活活性。三个不同的设计包括(图5a)：
(1)2ERT2-TALE-VP64-P65-Rta(即2ERT2-TALE-VPR)；
(2)2ERT2-TALE-VP64-P65-HSF1(即2ERT2-TALE-VPH)；
(3)2ERT2-TALE-VP64-P65-HSF1-Rta(即2ERT2-TALE-VPHR)。
在4-OHT的刺激下，VPH相比VPR表现出了更高的转录激活活性。并且经过进一步的实验发现，在VPH的C末端进一步融合R并没有进一步提高VPH的活性。然而在没有4-OHT的处理下，所有的组合依然存在一定的背景活性(图5b)。
随后，假设如果一个TAL能招募更多的ADs，可能会提高转录激活活性。为此，结合SUperNova TAGging(SunTag)标记系统设计了一系列的可诱导的TALE，在设计中TAL阵列融合10个串联重复的GCN4片段GCN4片段可以被一个单链抗体可变区(ScFv)特异性识别，通过这一特异性的识别，GCN4可以招募多个与ScFv融合的ADs。当TAL-10×GCN4和ScFv-ADs都与ERT2连接同时受到4-OHT的调控时，不经过4-OHT处理的细胞基因激活的背景活性显著降低，与阴性对照无显著差异(图6)。对比发现将带有核定位信号(NLS)片段的ScFv-VP64(N-VP64)与ERT2-TALE-GCN4一起转染进细胞时，没有经过4-OHT处理的细胞显示非常高的背景活性(图6)。这一结果显示药物对ADs的调控对于低的背景活性是关键的。在药物的诱导下，串联融合的两个ERT2与一个ERT2相比显示了更高的转录激活活性。因此在接下来的试验中采用了2ERT2-TALE-(GCN4)10。
接下来，将HIT TALE-SunTag体系的单个的AD(VP64)替换成串联的ADs组合(VPR，VPH，VPHR)。意外发现，与VP64相比，只有VPH显示了明显的激活效果的提高(图7a)。同时，观察到在ScFv-ADs质粒中融合两个ERT2并没有显著提高诱导效应，也没有对背景活性有任何影响(图7b)，所以在接下来的试验中将ADs与单个ERT2融合。
在HIT TALE-SunTag体系中，多个GCN4的重复允许我们将最有效的VPH组合进一步分割成如V+PH，V+P+H等不同形式，这可能会形成更加有效的分子间协同作用。实际上，通过共同转染2ERT2-TALE-(GCN4)10、ScFv-ERT2-VP64和ScFv-ERT2-PH，获得了更高水平的转录激活活性，这一结果表明与同样的ADs简单的串联融合相比，在邻近的GCN4位点上招募VP64和PH产生了更高的分子间协同作用(图8a)。当用NLS替换2ERT2-TALE-(GCN4)10中的2ERT2时也发现了同样的效果(图8b)。比较发现V+P+H并没有产生更好的活性，原因可能是因为只能招募有限数量的ADs(图8a)。进一步实验表明，与2ERT2-TALE-(GCN4)10相比，NLS-TALE-(GCN4)10显著地增强了激活活性，同时也没有提高背景活性。这一结果表明对于ADs的严格药物调控是必须的，同时增加TALE向细胞核的转运可以提高激活活性。因此，对于HITTALE-SunTag体系，最终获得的最优化的组合是NLS-TALE-(GCN4)10和ScFv-ERT2-VP64和ScFv-ERT2-PH联合使用。
接下来将不同策略中最优化的组合包括2ERT2-TALE-VP64，2ERT2-TALE-VPH，和优化后的HIT TALE-SunTag放在一起比较。结果再一次验证了HIT TALE-SunTag体系具有最高的激活活性和最低的背景活性(图8c)。
最终，检测优化的HIT TALE-SunTag体系是否可以适用于其他基因的激活。我们将靶向Klf4，cMyc，和Neurog2基因启动子区的TAL连入最优化的HIT TALE-SunTag体系中，构建了不同的NLS-TALE-(GCN4)10载体，并将其与ScFv-ERT2-VP64和ScFv-ERT2-PH联合使用激活相应的内源基因，结果显示，本发明所优化的HIT TALE-SunTag体系可以针对不同基因实现严格、有效、特异的药物诱导的转录激活(图9)。
除了激活的特异性和效率，药物诱导的可逆性、对药物的选择性以及应答速度等指标也是药物诱导转录激活体系中需要明确的重要特性。为了检测这些指标，本发明建立了一个表达HIT-TALE-SunTag体系所有元件和Gaussia荧光素酶的稳定细胞系。在这一系统中，TALE可与Gaussia荧光素酶启动子区的特异序列结合，进而募集转录因子激活Gaussia的表达，通过检测荧光素酶的活性高低来判断是否实现了药物诱导的转录激活。
用4-OHT处理HIT-TALE-SunTag稳定细胞系后，荧光素酶信号逐渐提高，而在撤去4-OHT后则快速下降到本底水平，之后又可以随着重新加药处理后回升到正常激活状态(图10a，10b)。同持续加药和不加药处理的实验组对比，荧光素酶活性变化曲线有明显差异。不同浓度的4-OHT也得到同样的结果。这些结果显示HIT-TALE-SunTag体系的转录激活调控是可逆的。
随后，本实施例分别检测了HIT-TALE-SunTag体系对4-OHT和β-雌二醇的选择性应答。结果发现，当用两种药物分别处理稳定表达荧光素酶报告质粒的HIT-TALE-SunTag细胞系时，可以观察到荧光素酶信号对4-OHT的选择性应答(图10c)。药物诱导的HIT-TALE-SunTag体系可以利用更低浓度的4-OHT实现最大水平的转录激活活性。
最后，本实施例检测了HIT-TALE-SunTag体系对药物诱导的应答速度，发现4-OHT处理一个小时就可以引起荧光素酶信号的显著升高，并且随着药物处理时间的延长，荧光素酶信号也随之增强，证明HIT-TALE-SunTag可以在短时间内对药物诱导快速反应，实现基因的转录激活。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种药物诱导的基因转录激活方法，其特征在于，通过转染(ERT2)n-TALE-ADs系统或共转染HIT TALE-SunTag体系至细胞质内，在特定需要的时间利用4-OHT和/或TAM和/或他们的衍生物进行药物诱导，实现特定基因的转录激活；
所述(ERT2)n-TALE-ADs系统为可表达(ERT2)n-TALE-ADs融合蛋白的载体；其中，n＝2-5，ADs为转录效应因子组合；
所述HIT TALE-SunTag体系为可分别表达融合蛋白(1)与融合蛋白(2)中的一种或多种的载体组合：
(1)NLS-TALE-GCN4或ERT2-TALE-GCN4或(ERT2)n-TALE-GCN4，
(2)ScFv-ERT2-ADs或ScFv-(ERT2)n-ADs，
其中，n＝2-5，ADs为转录效应因子组合；
上述融合蛋白由左至右为N端至C端，各元件之间可以通过3～20个氨基酸的linker相连；
其中，(ERT2)n为n个串联的ERT2，GCN4为5-30个拷贝的来自酵母转录激活因子GCN4的一段抗原表位短肽，ScFv为抗GCN4肽的单链抗体可变区，TALE为针对靶标基因的类转录激活因子效应物。
2.一种用于基因转录激活的药物诱导型融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白自N端至C端由以下元件依序相连：2-5个串联的ERT2、针对靶标基因的TALE和ADs。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，各元件之间可以通过3～20个氨基酸的linker相连。
4.权利要求2或3所述融合蛋白的编码基因。
5.含有权利要求4所述编码基因的载体。
6.一种用于基因转录激活的药物诱导型融合蛋白组合，其特征在于，包括如下(1)与(2)中的一种或多种：
(1)NLS-TALE-GCN4或ERT2-TALE-GCN4或(ERT2)n-TALE-GCN4，
(2)ScFv-ERT2-ADs或ScFv-(ERT2)n-ADs，
其中，ADs为转录效应因子组合；TALE为针对靶标基因的类转录激活因子效应物，(ERT2)n为n个串联的ERT2，n＝2-5。
7.编码权利要求6所述融合蛋白组合的载体组合。
8.含有权利要求7所述载体组合的载体。
9.含有权利要求7所述载体组合中载体的载体组合。
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