CN109207403A - 一种快捷优化单细胞微生物培养基组成的方法 - Google Patents

一种快捷优化单细胞微生物培养基组成的方法 Download PDF

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张慧潓
郝鹏泽
夏进涛
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Abstract

本发明涉及一种快捷优化单细胞微生物培养基组成的方法，所述方法为将需要优化的培养基成分配制成溶液，用灭菌滤纸片浸泡，然后覆盖在浸泡过单细胞微生物菌液的滤纸片上，筛选待优化培养基组成。本发明可以清晰而快捷地发现促进单细胞微生物功能表达的培养基组成成分，优化培养基。本发明与液体发酵优化培养基配方的方法相比较，具有快速、简便优势。

Description

一种快捷优化单细胞微生物培养基组成的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种快捷优化单细胞微生物培养基组成的方法。
背景技术
细菌是地球上数量多、种类多的一类单细胞原核微生物，与人类关联密切。部分细菌是病原体，部分细菌则为人类利用：如细菌用作生产乳酪、酸奶、抗生素等。酵母是一种单细胞真核微生物，已知种类达1000余种酵母，一些酵母已经成为工农业生产菌种。
细菌和酵母这两类单细胞微生物在工农业生产中具有非常重要的价值，而细菌和酵母赖以生存的培养基对菌体生物量、代谢产物种类和产量影响明显。培养基中含有的碳源、氮源、无机盐、生长调节剂等种类差异可以导致微生物产量与质量变化，因此，微生物产品生产需要对微生物的培养基进行优化，特别是培养基组成成分优化，以期获得最佳经济效益。
目前对微生物培养基组成进行优化的方法基本上采用液体培养，改变碳源、氮源、无机盐、生长因子等培养基组成成分种类，研究培养基组成成分种类对微生物特定代谢产物影响程度，发现关键的影响成分，达到培养基优化的目的。液体发酵法需要使用摇瓶或者试管，发酵后的代谢产物需要进行定性(定量)检测，操作程序多、消耗时间长、费用高。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种快捷优化单细胞微生物培养基组成的方法。适用于细菌和酵母这两类单细胞微生物，且它们的功能可以借助于颜色或者透明圈进行判断。
本发明技术方案如下：
一种快捷优化单细胞微生物培养基组成的方法，所述方法为将需要优化的培养基成分配制成溶液，用灭菌滤纸片浸泡，然后覆盖在浸泡过单细胞微生物菌液的滤纸片上，筛选待优化培养基组成。
优选地，所述单细胞微生物包括能够产生色素或产生酶类或产生透明圈或其他功能的细菌或酵母菌。
优选地，所述方法包括以下步骤：
1)采集样本；
2)单细胞微生物筛选：样本稀释后，接种于单细胞微生物筛选培养基的平皿上培养，挑选得到能够展示某种功能的单细胞微生物，所述某种功能包括能够产生色素或产生酶类或产生透明圈或其他；
3)挑选单菌落：将步骤2)得到的能够展示某种功能的单细胞微生物挑出，划线形成单菌落，划线获得单细胞微生物单菌落；
4)将步骤3)得到的单细胞微生物单菌落制成菌悬液；
5)将需要优化的培养基成分制成溶液；
6)将灭菌滤纸片沾上所述步骤4)的菌悬液，得到带菌滤纸片，放置在平皿上；
7)将需要优化的培养基成分配制成溶液，用灭菌滤纸片浸泡，得到待优化的培养基组分溶液浸泡后的灭菌滤纸，然后覆盖在步骤6)带菌滤纸片上培养；
8)记录产色素、产酶或者产生透明圈的时间先后或者圈的大小来筛选待优化培养基组成成分，得到优化后的培养基组成。
进一步优选地，所述步骤1)从自然环境的土壤、水体或者动植物体中采集样品。
进一步优选地，所述步骤2)、步骤7)的培养时间为1-10d。
进一步优选地，所述步骤3)划线次数为2-4次。
进一步优选地，所述步骤6)灭菌滤纸直径d＝4-8mm，直径10cm的平皿放置3-10片带菌滤纸片。
进一步优选地，所述步骤7)将需要优化的培养基成分种类为若干个时，则依次重叠覆盖在带菌滤纸片上。
本发明有益效果如下：
1、本发明采用琼脂平皿培养法，既可以进行培养基组成的单因子实验，也可以进行多因子实验；实验结果直接从平皿上产生的颜色(或者显色后能够显示的颜色)评判；如果产生透明圈，可以通过产生的透明圈进行评价。
2、采用平皿直接观察培养基组成成分对细菌(酵母)代谢的影响，避免了液体发酵法所需的多个发酵容器以及测试发酵液中目的产物有无与多寡的繁琐。本发明一个平皿(d＝10cm)可以测试3-10个单一物质(单因子)对细菌(酵母)功能影响，也可以在一个平皿里标记3-10点进行多种培养基组成物质测试(多因子)。因此，对于细菌和酵母这两类单细胞微生物，且它们的功能可以借助于颜色或者透明圈进行判断，这些微生物培养基组成成分优化，本发明具有操作方便、快速、低费用等优势，可以推广使用。
3、将需要优化的培养基成分多种时，则依次重叠覆盖在带菌滤纸片上。这样可以测试多种培养基组成成分共同存在时，对功能菌的功能表达是协同促进作用还是具有不利的拮抗作用。
附图说明
图1为实施例1茶多酚转化微生物培养及培养基组成成分优化示意图；
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
一种快捷优化单细胞微生物培养基组成的方法，该方法包括以下步骤：
1)采集敞开放置14d的茶多酚提取液样本。
2)样品进行10倍系列稀释，将10-1、10-2、10-3涂布于含有茶多酚琼脂培养基上，30℃培养，每隔8h观察茶多酚变黑情况[茶多酚琼脂培养基：茶多酚提取物0.8％，琼脂2％]。
3)培养40h后，平皿里出现黑色斑点，用接种针将黑色处微生物挑出，划线接种于营养琼脂培养基中，30℃培养36h，得到单菌落。再将每个单菌落接种于茶多酚琼脂培养基中(每个单菌落接种一个点，直径10cm的平皿可以接种5-10个点)，30℃培养36h。将形成黑色圈最大的菌落挑出，划线纯化，获得纯种，镜检为细菌。
4)将茶多酚转化细菌制成菌悬液，菌含量为103-104CFU/mL。
5)将碳源(葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖)配制成5g/L的溶液，氮源(蛋白胨、磷酸二氢铵)和无机盐(氯化钠、磷酸氢二钾)配制成1.5g/L的溶液，分别灭菌，备用，灭菌蒸馏水作为空白对照。
6)用镊子将灭菌滤纸片(d＝5mm)沾上菌悬液，间距基本一致地放置在预先准备的茶多酚琼脂平皿上，直径10cm的平皿放置5片/皿，共准备15个平皿，分成A、B、C三组，每组3个平皿。
7)用灭菌滤纸浸泡葡萄糖溶液和蒸馏水，然后分别覆盖在带菌滤纸片上，每个平皿上放置4片葡萄糖溶液滤纸和1片吸附蒸馏水滤纸；再用滤纸分别吸附蛋白胨、磷酸二氢铵和蒸馏水，2片蛋白胨溶液吸附滤纸分别覆盖在2片葡萄糖溶液滤纸上，另外2片吸附磷酸二氢铵滤纸分别覆盖在剩余的2片葡萄糖溶液滤纸上，1片吸附蒸馏水滤纸覆盖在先前的蒸馏水滤纸上；然后1片吸附氯化钠溶液滤纸片覆盖在蛋白胨溶液滤纸上，另1片吸附氯化钠溶液滤纸片覆盖在磷酸二氢铵滤纸上；再者，1片吸附磷酸氢二钾溶液滤纸片覆盖在蛋白胨溶液滤纸上，另1片吸附磷酸氢二钾溶液滤纸片覆盖在磷酸二氢铵滤纸上；1片吸附蒸馏水滤纸覆盖在先前的蒸馏水滤纸上。此为A组，3个平皿重复实验。可溶性淀粉溶液为B组实验，蔗糖溶液为C组实验，A、B、C三组实验的碳源不同，其它操作一致，如图1。培养基组成成分多因子测试见表1。
表1培养基组成成分
8)30℃培养，每隔8h观察黑色产生情况，32h时，蔗糖+蛋白胨+磷酸氢二钾纸片处微生物生长迅速，出现黑色，40h时此处平均黑色圈最大(直径达16mm)。
9)该细菌转化茶多酚培养基组成优化，以蔗糖+蛋白胨+磷酸氢二钾最佳。
实施例2
一种快捷优化单细胞微生物培养基组成的方法，该方法包括以下步骤：
1)采集葡萄园土壤样本。
2)土壤样品10倍系列稀释，取10-2、10-3涂布于含氯霉素的YPD培养基平皿上，28℃培养48h[YPD培养基：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，琼脂粉2％，121℃灭菌20min；待培养基冷却至50-60℃时，加入除菌的氯霉素溶液，混匀，使得氯霉素含量为0.05％]。标记每个YPD平皿上生长的单菌落，将单菌落分别以点状方式转接于淀粉酶筛选培养基上[淀粉酶筛选培养基：可溶性淀粉2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，NaCl 0.5％，琼脂2％]。28℃培养24h，喷稀碘液显色，静置3min测量透明圈直径大小，将透明圈较大的单菌落所对应的YPD平皿上单菌落划线纯化，获得高产淀粉酶微生物，镜检为酵母。
4)将筛选获得的酵母制成菌悬液，菌含量为102-103CFU/mL。
5)将MgCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、CaCl2配制成Mg2+、Cu2+、Ca2+浓度均为30mmol/L的溶液，灭菌备用，灭菌蒸馏水作为空白对照。
6)用镊子将灭菌滤纸片(d＝5mm)沾上菌悬液，间距基本一致地放置在预先准备的淀粉酶筛选培养基平皿上，直径10cm的平皿放置4片/皿，共准备3个平皿。
7)用不同灭菌滤纸浸泡Mg2+、Cu2+、Ca2+离子和蒸馏水，然后覆盖在带菌滤纸片上，每个平皿上放置1片同一测试离子滤纸和1片吸附蒸馏水滤纸，共使用3个平皿。
8)28℃培养24h，喷稀碘液显色，静置3min测量透明圈直径大小，浸泡CaCl2溶液的滤纸透明圈直径均值最大(为21mm)。
9)三种无机盐中CaCl2促进该酵母产生淀粉酶效果最佳，所以培养基优化时需加入一定量的CaCl2。
实施例3
一种快捷优化单细胞微生物培养基组成的方法，该方法包括以下步骤：
1)采集池塘水体及底泥。
2)样品10倍系列稀释，水体取10-1、10-2(底泥取10-3、10-4、10-5)涂布于溶磷菌筛选培养基NBRIP上[NBRIP组成：葡萄糖1％，Ca3(PO4)2 0.5％，MgCl2·6H2O0.5％，MgSO4·7H2O0.025％，KCl 0.02％，(NH4)2SO4 0.01％，Agar 1.5％]，28℃培养10d。将形成透明圈最大菌落挑出(霉菌除外)，划线纯化，获得纯种，镜检为细菌。
4)将筛选获得的细菌制成菌悬液，菌含量为102-103CFU/mL。
5)将氮源(硫酸铵、硝酸钾、尿素)配制成浓度为0.2g/L溶液，灭菌备用，灭菌蒸馏水作为空白对照。
6)用镊子将灭菌滤纸片(d＝5mm)沾上菌悬液，间距基本一致地放置在预先准备的氮源测试培养基平皿上[氮源测试培养基组成：葡萄糖1％，Ca3(PO4)2 0.5％，MgCl2·6H2O0.5％，MgSO4·7H2O 0.025％，KCl 0.02％，Agar 1.5％]，直径10cm的平皿放置4片/皿，共准备3个平皿。
7)用不同灭菌滤纸浸泡硫酸铵溶液、硝酸钾溶液、尿素溶液和蒸馏水，然后覆盖在带菌滤纸片上，每个平皿上放置1片同一测试溶液滤纸和1片吸附蒸馏水滤纸，共使用3个平皿。
8)28℃培养8d，测量透明圈直径大小，尿素溶液产生的透明圈直径均值最大(为16mm)。
9)尿素作为该溶磷菌的氮源优于硝酸钾和硫酸铵，所以培养基中需要加入尿素作为氮源替代传统的硫酸铵(经典的NBRIP培养基氮源为硫酸铵)。
对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种快捷优化单细胞微生物培养基组成的方法，其特征在于：所述方法为将需要优化的培养基成分配制成溶液，用灭菌滤纸片浸泡，然后覆盖在浸泡过单细胞微生物菌液的滤纸片上，筛选待优化培养基组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述单细胞微生物包括能够产生色素或产生酶类或产生透明圈或其他功能的细菌或酵母菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1）采集样本；
2）单细胞微生物筛选：样本稀释后，接种于单细胞微生物筛选培养基的平皿上培养，挑选得到能够展示某种功能的单细胞微生物，所述某种功能包括能够产生色素或产生酶类或产生透明圈或其他；
3）挑选单菌落：将步骤2）得到的能够展示某种功能的单细胞微生物挑出，划线形成单菌落，划线获得单细胞微生物单菌落；
4）将步骤3）得到的单细胞微生物单菌落制成菌悬液；
5）将需要优化的培养基成分制成溶液；
6）将灭菌滤纸片沾上所述步骤4）的菌悬液，得到带菌滤纸片，放置在平皿上；
7）将需要优化的培养基成分配制成溶液，用灭菌滤纸片浸泡，得到待优化的培养基组分溶液浸泡后的灭菌滤纸，然后覆盖在步骤6）带菌滤纸片上培养；
8）记录产色素、产酶或者产生透明圈的时间先后或者圈的大小来筛选待优化培养基组成成分，得到优化后的培养基组成。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1）从自然环境的土壤、水体或者动植物体中采集样品。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤2）、步骤7）的培养时间为1-10 d。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤3）划线次数为2-4次。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤6）灭菌滤纸直径d = 4-8 mm，直径10 cm的平皿放置3-10片带菌滤纸片。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤7）将需要优化的培养基成分种类为若干个时，则依次重叠覆盖在带菌滤纸片上。
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