CN109206530A - 黑蒜果聚醣的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑蒜果聚醣的制备方法，包含以下步骤：步骤一：使大蒜于第一预定温度及第一预定时间下进行发酵，并获得第一发酵物；步骤二：使第一发酵物于第二预定温度及第二预定时间下进行发酵，并获得一第二发酵物；步骤三：使用溶剂淀析第二发酵物，并获得黑蒜果聚醣；其中，第二预定温度高于第一预定温度、第二预定时间大于第一预定时间且溶剂包含C₁‑C₅的低级醇，本发明具有制程简单且不需加入添加剂的特点。

Description

黑蒜果聚醣的制备方法

技术领域

本发明涉及一种黑蒜果聚醣的制备方法，具体而言为一种利用两阶段发酵法制备黑蒜果聚醣的方法。

背景技术

自古以来，大蒜是一种药食两用的常见植物，富含多种维生素、氨基酸、醣类、硫化合物与无机盐类。其中，能从大蒜中提取的有效活性成分包含属于菊醣类的黑蒜果聚醣。黑蒜果聚醣具有增强免疫能力、加速新陈代谢、促进细胞生长、增强T细胞、B细胞与巨噬细胞活性、缓解疲劳、抗衰老、抗氧化、抗癌与防癌等特性。所以黑蒜果聚醣被作为多种疾病的治疗药物或辅助药物，例如：用于治疗心脑血管疾病、传染性疾病与抗金属性中毒等。除此之外，由于黑蒜果聚醣能够增强动物体免疫功能，所以通过添加黑蒜果聚醣于饲料中，能够降低动物疾病的发病率，且可提升食用肉的质量。

黑蒜果聚醣又可依照分子大小分为大分子果聚醣与小分子果聚醣。小分子果聚醣能改善肠道内微生物种群比例，是肠内双歧杆菌的活化增殖因子，可减少与抑制肠内腐败物质的产生、有害细菌的生长等，以调节肠道内的平衡。此外，其能促进微量元素，例如：铁、钙等的吸收，以防止骨质疏松症。亦可以减少肝脏毒素，并于肠道中生成具有抗癌的有机酸。因此，含有小分子果聚醣的相关产品深具商业利用价值。

目前，于生产小分子果聚醣的制程中，通常会借由调整环境pH值以增加小分子果聚醣的产率。举例而言：可加入包含盐酸、乳酸、柠檬酸或醋酸等食用级酸降低环境pH值进行反应后，再调整pH值至中性以获得小分子果聚醣产物，或可在大蒜中加入氯化钙与助凝剂后进行萃取以获得产物。然而，此些小分子果聚醣的制程较为复杂，不易进行大批量的工业化生产，且于制程中加入的添加剂会增加产品的生产成本。因此，有必要发展能简化制程且未加入额外添加剂的小分子果聚醣的制备方法。

发明内容

鉴于上述习知问题，本发明的目的在于提供一种制程简单且不需加入添加剂的黑蒜果聚醣的制备方法。

为实现上述目的，本发明的解决方案是：

一种黑蒜果聚醣的制造方法，包含以下步骤：

步骤一：使一大蒜于一第一预定温度及一第一预定时间下进行发酵，并获得一第一发酵物；

步骤二：使该第一发酵物于一第二预定温度及一第二预定时间下进行发酵，并获得一第二发酵物；以及

步骤三：使用一溶剂淀析该第二发酵物，并获得一黑蒜果聚醣；

其中，该第二预定温度高于该第一预定温度，该第二预定时间大于该第一预定时间且该溶剂包含C₁-C₅的低级醇。

该黑蒜果聚醣为分子量小于4000Da的小分子果聚醣。

该大蒜为冷冻大蒜。

该溶剂包含乙醇。

该溶剂与该第二发酵物的体积比为1：4至1：6。

该第一预定温度为35℃至50℃。

该第二预定温度为70℃至90℃。

该第一预定时间为3天至8天。

该第二预定时间为17天至30天。

采用上述技术方案后，本发明黑蒜果聚醣的制备方法具有下述优点：

(1)本发明仅需利用发酵来制备果聚醣，而无需添加剂，为一种制程相较单纯的制备方法，因此能够降低多步骤制程中的成本、时间与人力的问题，以利工业化的大批量生产。

（2）本发明利用两阶段发酵法制备黑蒜果聚醣。首先，进行第一阶段发酵的目的为使大蒜细胞壁软化。借由让大蒜在最适合酵素活性的35℃至50℃中发酵，促使大蒜细胞中的水解酵素活化，并借此水解大蒜细胞壁。而后，进行第二阶段发酵的目的为使大分子果聚醣水解成小分子果聚醣。借由让经过第一阶段发酵处理后的第一发酵物，在70℃至90℃的高温下进行水解，以获得更多的小分子果聚醣。因此，本发明能有效提高小分子果聚醣的产率。

(3)本发明将大蒜先进行冷冻处理，使得大蒜的细胞壁受到冰晶的破坏，在接续进行发酵及淀析步骤后，获得更多的小分子果聚醣。

(4)本发明使用低级醇进行淀析，因此能够简单地借由调整低级醇的浓度，获得不同分子量的果聚醣。其中，本发明的较佳实施例中系使用乙醇进行淀析，由于乙醇相较于其它低级醇对人体无毒性，因此能提升使用者对于食用黑蒜果聚醣的健康风险的信心。

(5)本发明使大蒜在经过发酵熟化过程中，借由在熟化时提供的高温热力催化以及像是果聚醣酵素、淀粉酵素等的包含于大蒜中酵素的分解，让大蒜中的果聚醣逐渐分解为小分子的单醣与双醣，从而促进梅纳反应的进行，并逐渐增加黑蒜的甜度，为大蒜提供更加适宜的口感。熟成后的大蒜作为黑蒜成品，相较于加工前的新鲜大蒜，还原糖含量提高了几十倍，并超过干重的60%。果聚醣酵素可将果聚醣分解为小分子还原糖，作为参与梅纳反应的反应物，使黑蒜甜度增加。其中，果聚醣的分子结构主要为β(2→1)型糖苷键，并带有少量2-6支链的果聚醣。

附图说明

图1为本发明的黑蒜果聚醣的制备方法的一实施例的流程图。

图2为本发明的黑蒜果聚醣的制备方法的一实施例的熟成装置图。

图3为本发明的黑蒜果聚醣的制备方法的一实施例的总发酵时间与果聚醣含量的关系图。

图4为本发明的黑蒜果聚醣的制备方法的一实施例的FTIR分析图。

图5为本发明的黑蒜果聚醣的制备方法的一实施例的细胞活性分析图。

图6为本发明的黑蒜果聚醣的制备方法的一实施例的ROS量化分析图。

【符号说明】

S10、S20、S30 步骤一、步骤二、步骤三

2 熟成装置

21 温度调节器

22 监控系统

23 层架。

具体实施方式

为使上述目的、技术特征及实际实施后的效益更易于使本领域的技术人员理解，将于下文中以实施例搭配图式更详细地说明。

参照图1，其为本发明的黑蒜果聚醣的制备方法的一实施例的流程图。

步骤一S10中，使大蒜于第一预定温度及第一预定时间下进行发酵，并获得第一发酵物。其中，可进一步包含大蒜的前处理步骤，所述前处理步骤包含清洗、浸泡、挤压、切碎、压碎、压辗、研磨或任何对于本领域的技术人员所习知的处理方式。其中，大蒜可以选用新鲜大蒜、脱水大蒜、冷冻大蒜、蒜梗或是已萃取其它大蒜的有效成分后的大蒜残渣或废液等。由于冷冻大蒜的制备过程中，空气中的水分子会凝固成冰晶，产生冰晶刺穿大蒜细胞壁的现象，故使用冷冻大蒜能进一步辅助水解大蒜细胞壁。较佳地，大蒜为冷冻大蒜。

其中，可进一步控制发酵时的温度、时间及相对湿度等参数，以使大蒜细胞壁被水解得更为完全。由于大蒜内含的果聚醣水解酵素、淀粉水解酵素与纤维素水解酵素的最佳活性温度约为35℃至50℃，因此当大蒜保持于此温度范围时，能够更加完全地水解大蒜细胞壁。较佳地，第一预定温度为35℃至50℃；更佳地，第一预定温度为43℃至50℃。若第一预定温度低于35℃，则酵素活性不佳，若第一预定温度高于50℃时，则由于温度过高使酵素受到破坏。较佳地，第一预定时间为3天至8天；更佳地，第一预定时间为4至6天。若第一预定时间小于3天，则大蒜细胞壁尚未被水解完成；若第一预定时间大于8天，则多余的时间会导致后续制程的延宕。较佳地，相对湿度为70%以上；更佳地，相对湿度为80%以上。若相对湿度低于60%时，则会产生干掉、硬化的负面效果。

步骤二S20中，使第一发酵物于第二预定温度及第二预定时间下进行发酵，并获得第二发酵物。其中，可进一步控制发酵时的温度、时间及相对湿度等参数，以使大分子果聚醣更完全地被水解为小分子果聚醣。当步骤S20的整体制程温度较高时，能够借由热能促进大分子果聚醣分解为小分子果聚醣的反应。较佳地，第二预定温度为70℃至90℃；更佳地，第二预定温度为75℃至85℃。若第二预定温度低于70℃，则产生小分子果聚醣产量较低的负面效果，若第二预定温度高于90℃时，则产生苦味、硬化的负面效果。较佳地，第二预定时间为17天至30天；更佳地，第二预定时间为18至23天。若第二预定时间小于17天，则产生小分子果聚醣产量较低的负面效果；若第二预定时间大于24天，则产生小分子果聚醣产量较低的负面效果。较佳地，相对湿度为70%以上；更佳地，相对湿度为80%以上。若相对湿度低于60%时，则会产生干掉、硬化的负面效果。

步骤三S30中，使用溶剂淀析第二发酵物，并获得黑蒜果聚醣。其中，溶剂包含C₁-C₅的低级醇。较佳地，溶剂包含乙醇；更佳地，溶剂为60%至80%的乙醇。较佳地，溶剂与第二发酵物的体积比为1：4至1：6；更佳地，溶剂与第二发酵物的体积比为1：2至1：8，当体积比小于1：2时，会产生互溶的负面效果；当体积比大于1：8时，则会产生凝聚及变性的负面效果。其中，借由上述方法获得的黑蒜果聚醣为分子量小于4000Da的小分子果聚醣。其中，借由上述方法获得的黑蒜果聚醣的小分子果聚醣的含量至少大于25%。

参照图2，其为本发明的黑蒜果聚醣的制备方法的一实施例的熟成装置图。

如图所示，将大蒜置于熟成装置2中进行发酵。借由控制温度调节器21调整发酵温度，并以监控系统22监控熟成装置2内的参数是否达到设定值。其中，内部层架23具有循环上下移动的功能，以使熟成装置2内的大蒜均匀且完全地进行发酵。

在一实施例中，于如图2所示的熟成装置2中置入冷冻大蒜，并在控制温度40℃及相对湿度85~95%下发酵，接着在温度85℃及相对湿度85~95%之下发酵。其中，总发酵时间为5天代表第一预定时间为2天，第二预定时间为3天；总发酵时间为10天代表第一预定时间为5天，第二预定时间为5天；总发酵时间为15天代表第一预定时间为7天，第二预定时间为8天；总发酵时间为20天代表第一预定时间为10天，第二预定时间为10天；以及总发酵时间为25天代表第一预定时间为12天，第二预定时间为13天。并针对总发酵时间进行分析，其结果如图3所示。

参照图3，其为本发明的黑蒜果聚醣的制备方法的一实施例的总发酵时间与果聚醣含量的关系图。可知，在总发酵时间时间为25天时，所获取的果聚醣含量超过500mg/g以上，为总发酵时间为5天的果聚醣含量的两倍以上, 随着发酵时间增加，所得的果聚醣含量亦会随着增加，若发酵时间太少，所得的果聚醣含量会过低。

在一实施例中，接续上述，选用总发酵时间为25天的参数，并分别使用不同浓度的酒精淀析发酵后的果聚醣以进行后续分析。其中，酒精与发酵后的果聚醣以体积比为4：1的比例进行淀析，淀析时间为24小时。以浓度40%、50%、60%及80%的酒精进行淀析的果聚醣，依序分别代称为BG-40、BG-50、BG-60及BG-80。

多醣分子量分析

首先，将保存在20%乙醇溶液中的DEAE-Sepharose 6 离子胶体倒入烧杯内，再加入大量去离子水并缓慢搅拌，于室温下静置待胶体沉降至烧杯底端，再以倾倒方式将烧杯内的悬浮液移除，并重复上述步骤数次，确保DEAE-Sepharose 6 离子胶体溶液中的乙醇溶液已全部置换成去离子水，即可开始充填(packing)胶体。

接着，架设管柱(column)，并安装下部的集液器(adapter)，下部的集液器(adapter)的作用为收集冲提液，再将胶体缓慢的延着管壁倒入，胶体沉降完毕后安装下部的集液器，以去离子水平衡至pH值为7后开始进行实验。分别配置1%的BG-40、BG-50、BG-60及BG-80，1%的果聚醣溶液上样量为1mL，移动相流速为0.5mL/min，移动相为去离子水、0.1MNaCl 、0.2M NaCl、0.3M NaCl 与 0.4M NaCl 冲提1%的果聚醣溶液，各移动相各收集 30管，每管收集 6 分钟，再以酚硫酸法逐管检验多醣含量，并将所测得果聚醣含量示于表1。

表1

组别	果聚醣含量(%)	分子量(Da)
			BG-40	25~28%	2000~3000
BG-50	30~32%	1500~2000
			BG-60	32~35%	1300~1500
BG-80	25~28%	1000~1300

参照表1，可知利用乙醇与水分子具有较高的亲和力，而造成水溶性多醣物质溶解度降低且使分子间互相聚集时，当达到一定浓度乙醇，乙醇分子中的羟基会与多醣的羟基形成互不相溶状态，以沉淀形式淀析出果聚醣。当果聚醣的分子量越大时，在乙醇浓度较低的情况下即能被析出，因此可借由调整乙醇浓度使溶液系统中不同分子量的果聚醣淀析。其中，BG-60淀析出的果聚醣含量比其它组别更高。

果聚糖检测方式

果聚醣(cas: 9013-95-0)标准品取1.25 mg溶于3 mL的 0.3N的NaOH 中，搅拌30min后，加入含0.5M的NaCl的50mmol/L的pH 11.5的磷酸氢二钠-氢氧化钠(Na₂HPO₄-NaOH)缓冲液，并定容至25 mL，再将此溶液稀释成不同浓度标准品(50、40、30、20 及10 μg/mL)。各浓度标准品取 2mL，加入0.2 mL的1 mg/mL的苯胺蓝(aniline blue)试剂，混合静置2 h后，进行荧光强度检测，并制作标准曲线。

功效性评估

(1)螯合亚铁离子能力的分析：取2 mL 不同浓度的待测样品溶液，加入1.7mL 的蒸馏水及0.1ML的2mmol/LFeCl₂后，震荡混合均匀，再加入0.2 mL的5mmol/L菲洛嗪(Ferrozine)，震荡混合后，放置于室温下避光反应10 分钟后，取出于分光光度计波长562nm下测试吸光値，并以L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)作为对照组进行比较。

螯合金属能力(%) ＝(( 控制组吸光值-样品吸光值)/控制组吸光值)×100%。

(2)还原力的分析：取1mL 不同浓度的待测样品溶液，加入 0.75mL 蒸馏水后，加入1mL磷酸钠缓冲溶液(sodium phosphate buffer)(0.2 M，pH 6.6)，震荡混合均匀，再加入1mL 铁氰化钾(potassium ferricyanide)(1%)，震荡混合均匀，置于 50 ℃ 下反应20分钟后，加入1 mL的三氯乙酸 (trichloroacetic acid) (10%)，再加入 0.25 mL FeCl₃(0.1%) 于上述溶液，震荡混合均匀，于分光光度计波长700 nm 下，测定吸光值，并以L-抗坏血酸作为对照组进行比较。

(3)清除DPPH自由基能力的分析：取1 mL 新鲜配置的0.1mmol/L DPPH 溶液(溶剂为50%乙醇)，依序加入1 mL 不同浓度的待测样品溶液，经振荡混合均匀后，放置于室温下避光静置20分钟后，于分光光度计的波长517nm下测试吸光值，并以L-抗坏血酸作为对照组进行比较。

自由基捕捉效应百分率(%) = (1-(样品吸光值/控制组吸光值))×100 %。

果聚醣螯合亚铁离子能力的分析

表2

组别	IC<sub>50</sub>(ppm)
		BG-40	700~1000
BG-50	1100~1300
		BG-60	1300~1500
BG-80	1500~2000

果聚醣还原力的分析

表3

组别	IC<sub>50</sub>(ppm)
		BG-40	650~800
BG-50	1000~1200
		BG-60	1300~1500
BG-80	1400~1700

果聚醣清除DPPH自由基能力的分析

表4

组别	IC<sub>50</sub>(ppm)
		BG-40	400~700
BG-50	600~900
		BG-60	1000~1100
BG-80	1300~1500

参照表2、表3及表4，可知BG-80的螯合亚铁离子的能力、还原力以及清除自由基的能力皆相较其它组别更佳，且由表1的分子量结果可知80%乙醇沉淀出的果聚醣的分子量最小，代表浓度80%的乙醇能有效纯化小分子果聚醣，且分子量较小的果聚醣体具有较佳的抗氧化能力。

官能基分析

将BG-40、BG-50、BG-60及BG-80分别使用傅立叶转换红外光谱仪(FTIR)进行测试，其测试结果如图4所示。

参照图4，其为本发明的黑蒜果聚醣的制备方法的一实施例的FTIR分析图，可知吸收波数范围从4000cm^-1 到750cm^-1。其中，BG-40在890cm^-1显示具有α醣苷键，在1105cm^-1的吸收带表示有C-OH 键结，在1020cm^-1显示C-O伸缩，在1,058cm^-1显示β葡聚醣。其中，BG-50在1647cm^-1显示OH 键，在949至1026cm^-1之间为α键结特定吸收波峰，在1105cm^-1的吸收带表示有C-OH 键结，在1047至1080cm^-1之间为C-O-C 键的收缩震动，在3359 cm^-1显示N-H吸收波峰。其中，BG-60在1457cm^-1显示CH₂吸收峰，在1047至1080cm^-1显示C-O-C 键的收缩震动，在966cm^-1显示α键结特定吸收波峰，在1647cm^-1的吸收带表示有O-H 键结。其中，BG-80在1456cm^-1的吸收带有CH₂键结，在983至995cm^-1具有α键结吸收波峰，在1105cm^-1的吸收带表示有C-OH。因此，可知BG-40、BG-50、BG-60与BG-80之间存在明显差异，故而代表酒精分级沉淀能有效地自果聚醣中分离具有特定官能团的片段，且得知α醣苷键、β葡聚醣、O-H 键、C-OH 键、C-O-C键官能基皆与抗氧化之间有极大的关联性。此外，由于在前述分析中显示BG-80的清除DPPH自由基以及抗氧化的能力明显优于其它酒精浓度所淀析的果聚醣片段，因此可证实利用80%酒精浓度能够有效的分离出具有抗氧化活性的果聚醣片段。

细胞存活率

接续上述，分别将BG-40与BG-80进行细胞存活率分析。利用测试细胞体外毒性最为普遍的微量色度分析法的MTT分析法进行。将含有不同浓度(0、25、50、100及200μg/mL的果聚醣的10%胎牛血清(FBS)培养液培养24小时以进行人类角质细胞(HaCaT)存活试验。其中，控制组为未加入果聚醣的对照组，并将控制组的细胞数作为100%。其分析结果如图5所示。

参照图5，其为本发明的黑蒜果聚醣的制备方法的一实施例的细胞活性分析图。可知随着果聚醣浓度的提高，细胞存活率有逐渐降低的现象，低于80%的细胞存活率则显示细胞毒性的产生。其中，果聚醣浓度达到200μg/mL时，HaCaT细胞的存活率仍皆大于80%。

细胞内活性氧化物 (ROS) 产量测定分析

接续上述，选用浓度200μg/mL的果聚醣作为基准，进行下述抗发炎实验。由于自由基诱导剂(AAPH，2,2'-azobis(2-amidinopropane) hydrochloride)会产生活性氧自由基(ROS)，并对皮肤造成伤害，因此清除这些自由基可以预防及保护皮肤所造成的氧化损伤。利用AAPH模拟在氧化逆境的情况，进而模拟发炎反应，并利用活性氧检测试剂(DCFH-DA，Dichlorofluorescin diacetate)检视ROS含量及反应。

此外，BG-80的抑制荧光表现效果优于BG-40。接续上续，将ROS含量进行量化，并示于图6中。

参照图6，其为本发明的黑蒜果聚醣的制备方法的一实施例的ROS量化分析图。可知，在利用AAPH诱导自由基产生且未给予果聚醣的状态下，ROS含量为未经AAPH诱导且未给予果聚醣的细胞，亦即控制组的含量的大约5 倍，表示HaCaT细胞因AAPH 引起细胞内自由基反应，而遭受氧化逆境，证实会导致ROS含量明显增加。然而，在给予不同浓度的果聚醣的条件下，ROS明显降低。其中，在最高浓度为200μg/mL 时，BG-80 的ROS 含量仅为BG-40 的0.84倍，代表BG-80具有良好的降低ROS含量的效果。

综上所述，本发明的黑蒜果聚醣的制备方法能够借由两阶段发酵制程，获得更多的小分子果聚醣，且本发明所制得的小分子量果聚醣有细胞毒性低、螯合亚铁离子能力佳、抗氧化及可清除自由基等特点。

以上所述仅为举例性，而非为限制性。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于权利要求范围中。

Claims (9)

1.一种黑蒜果聚醣的制造方法，其特征在于，包含以下步骤：

步骤一：使一大蒜于一第一预定温度及一第一预定时间下进行发酵，并获得一第一发酵物；

步骤二：使该第一发酵物于一第二预定温度及一第二预定时间下进行发酵，并获得一第二发酵物；以及

步骤三：使用一溶剂淀析该第二发酵物，并获得一黑蒜果聚醣；

其中，该第二预定温度高于该第一预定温度，该第二预定时间大于该第一预定时间且该溶剂包含C₁-C₅的低级醇。

2.如权利要求1所述黑蒜果聚醣的制造方法，其特征在于：该黑蒜果聚醣为分子量小于4000Da的小分子果聚醣。

3.如权利要求1所述黑蒜果聚醣的制造方法，其特征在于：该大蒜为冷冻大蒜。

4.如权利要求1所述黑蒜果聚醣的制造方法，其特征在于：该溶剂包含乙醇。

5.如权利要求1所述黑蒜果聚醣的制造方法，其特征在于：该溶剂与该第二发酵物的体积比为1：4至1：6。

6.如权利要求1所述黑蒜果聚醣的制造方法，其特征在于：该第一预定温度为35℃至50℃。

7.如权利要求1所述黑蒜果聚醣的制造方法，其特征在于：该第二预定温度为70℃至90℃。

8.如权利要求1所述黑蒜果聚醣的制造方法，其特征在于：该第一预定时间为3天至8天。

9.如权利要求1所述黑蒜果聚醣的制造方法，其特征在于：该第二预定时间为17天至30天。