CN109182435A - 一种生物源二肽基肽酶-iv抑制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白质提取技术领域，为解决日本黄姑鱼加工过程中产生大量的副产物，资源利用率低的问题，提供一种生物源二肽基肽酶‑IV抑制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将日本黄姑鱼鱼皮预处理得鱼皮粉，然后将鱼皮粉提取胶原蛋白，离心干燥，得日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白；(2)利用复合酶对步骤(1)得到的日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白进行酶解，得日本黄姑鱼鱼皮胶原肽；(3)将日本黄姑鱼鱼皮胶原肽通过二肽基肽酶筛选试剂盒筛选，即得生物源二肽基肽酶‑IV抑制剂。本发明以日本黄姑鱼鱼皮为主要原料，通过较为高效的工艺制得二肽基肽酶‑IV抑制肽，该抑制肽具有很好的抑制二肽基肽酶‑4的作用，具有很好的抗高血糖的功效。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质提取技术领域，尤其涉及一种生物源二肽基肽酶-IV抑制剂的制备方法。
背景技术
糖尿病已成为继恶性肿瘤、心血管之后，第三大严重威胁人类健康和生命的代谢性疾病，它能引发脑血管疾病、冠心病、视网膜病变等多种并发症，甚至死亡。目前，糖尿病的控制与治疗主要是依靠食物控制和药物。治疗糖尿病的药物主要是人工合成的药物，它们都有一定的毒副作用。
肠促胰岛素药物中的二肽基肽酶-4(Dipeptidylpeptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)是一种丝氨酸蛋白酶，能迅速裂解和失活肠促胰岛素、神经肽和细胞因子。DPP-4可特异性切断GLP-1(胰高血糖素样肽-1)肽链N端2位上的丙氨酸或脯氨酸残基，从而使GLP-1失活。GLP-1作为一种重要的肠促胰岛素，除能促进胰岛素分泌及抑制胰高血糖素分泌外，还具有增加饱腻感、减缓胃排空时间、抑制胰岛β细胞凋亡和促进β细胞增殖等作用。由于可被DPP-4迅速降解，GLP-1的体内半衰期极短，若能抑制DPP-4活性则可有效延长GLP-1的作用时间，从而有利于降低血糖水平，具有治疗糖尿病的作用。
DPP-IV抑制肽无论是从有效性还是安全性，对糖尿病都具有较好的疗效。来源于食品蛋白DPP-IV抑制肽具有来源广泛、安全性高、降血糖效果好等优点，已成为关注和研究的热点。
日本黄姑鱼是我国重要的新养殖品种之一，在加工过程中产生大量的副产物，资源利用率低。中国专利文献上公开了“一种日本黄姑鱼鱼皮明胶的制备方法”，其公告号为CN10841037A，该发明提供了一种工艺简单，能够充分利用日本黄姑鱼的下脚料的方法，但是该发明工艺复杂，不利于实现产业化。
发明内容
本发明为了克服日本黄姑鱼加工过程中产生大量的副产物，资源利用率低的问题，提供了一种生物源二肽基肽酶-IV抑制剂的制备方法，通过本发明制备的活性肽生理活性显著，可用于药品、功能食品、食品等领域，因此具有良好的应用前景。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种生物源二肽基肽酶-IV抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将日本黄姑鱼鱼皮预处理得鱼皮粉，然后将鱼皮粉置入2～5wt％的乙酸溶液中，按照每g鱼皮粉中加入0.01～0.03mg胃蛋白酶的添加量加入胃蛋白酶，于温度3～5℃条件下提取胶原蛋白，离心干燥，得日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白；
(2)利用复合酶对步骤(1)得到的日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白进行酶解，得日本黄姑鱼鱼皮胶原肽；
(3)将日本黄姑鱼鱼皮胶原肽通过二肽基肽酶筛选试剂盒筛选，即得生物源二肽基肽酶-IV抑制剂。
步骤(3)中所述通过二肽基肽酶筛选试剂盒筛选的步骤按照二肽基肽酶ⅣELISA试剂盒(供应商为上海江莱生物科技有限公司)的说明书进行。
作为优选，步骤(1)中，所述预处理工艺为：
(a)将鱼皮清洗后，冷冻干燥，粉碎至粒径为25～50μm，得鱼皮冷冻粉；
(b)将步骤(a)得到的鱼皮冷冻粉加入到0.10～0.50mol/L温控型碱性离子液体中，于不同温度条件下超声处理，离心、干燥，得去杂蛋白、脱脂后的鱼皮粉。
鱼皮含有丰富的蛋白质和多种微量元素，其蛋白质主要是大分子的胶原蛋白及粘多糖的成分。温控型碱性离子液体能够实现离子液体体系的温度控制，使反应在高温时均相进行，低温时自动分成两相，方便产物分离、回收。本发明创造性地选用温控型碱性离子液体，一步预处理实现日本黄姑鱼鱼皮的去杂蛋白和脱脂，根据日本黄姑鱼鱼皮的成分，设计不同温度范围的预处理阶段，调控温控型碱性离子液体的性能，通过超声处理得到去杂蛋白、脱脂后的鱼皮粉。
作为优选，所述温控型碱性离子液体为双N－(2－二乙氨基)乙基聚乙二醇双咪唑氢氧根盐。所述双N－(2－二乙氨基)乙基聚乙二醇双咪唑氢氧根盐的结构式为：
作为优选，所述不同温度条件下超声处理的工艺为：先在20～25℃温度下，超声功率密度0.2～0.35w/cm2，超声处理10～20min；然后在10～15℃温度下，超声功率密度0.7～1.5w/cm2，超声处理5～8min；最后在然后在4～8℃温度下，超声功率密度2～2.5w/cm2，超声处理1～3min。
通过温控型碱性离子液体对日本黄姑鱼鱼皮进行预处理，20～25℃温度范围内，温控型碱性离子液体体系为均相，此时可以对鱼皮冷冻粉快速溶解，去杂蛋白，此时进行较低功率密度的超声波处理，能够使得鱼皮中的胶原纤维得到初步伸展；接着降低温度至10～15℃，温控型碱性离子液体的体系部分分离为两相，此时加大超声功率密度，有利于鱼皮中的胶原纤维得到充分伸展，去除杂蛋白的同时，进行脱脂；最后，日本黄姑鱼鱼皮得到去杂蛋白、脱脂后，进一步降低温度至4～8℃，温控型碱性离子液体的体系完全分离为两相，在超声波处理下，便于实现日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白的分离。
作为优选，步骤(2)中，所述复合酶为光响应凝胶因子改性木瓜蛋白酶，所述光响应凝胶因子改性木瓜蛋白酶由光响应凝胶因子与木瓜蛋白酶按照质量比0.05:1复配而得。所述光响应凝胶因子的结构式如下：
本发明所选光响应型凝胶因子优选为二元有机盐凝胶因子，其在紫外光照射下蒽基团会发生二聚而时凝胶破坏，静置后变为沉淀；沉淀重新加热后，又可以回到凝胶态。
作为优选，步骤(2)中，所述酶解工艺为：在日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白中加入蒸馏水，然后加入光响应凝胶因子改性木瓜蛋白酶，所述光响应凝胶因子改性木瓜蛋白酶的添加量为日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白总质量的6％；搅拌均匀得混合液，将混合液置于紫外灯下，先打开紫外灯于紫外光照条件下搅拌反应1～2h；再关闭紫外灯，遮光于黑暗条件下，60～85℃条件下搅拌反应0.5～1h；反应结束后80～100℃灭活5～25min；再将上述反应液5000～8000rpm离心5～10min，收集上清，冷冻干燥得到日本黄姑鱼鱼皮胶原肽。
本发明酶解工艺中采用光响应凝胶因子改性木瓜蛋白酶，赋予复合蛋白酶的形态的可调控性，可在较少加酶量的前提下达到较佳的酶解水平。先在紫外光照射下蒽基团会发生二聚而时凝胶破坏，静置后变为沉淀，大量吸附反应物，然后于黑暗条件下加热，光响应凝胶因子改性木瓜蛋白酶回到凝胶态，使得反应物的分散度提高，从而实现低添加量的快速酶解。
因此，本发明具有如下有益效果：以日本黄姑鱼鱼皮为主要原料，通过较为高效的工艺制得二肽基肽酶-IV抑制肽，该抑制肽具有很好的抑制二肽基肽酶-4的作用，具有很好的抗高血糖的功效。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
本发明以下实施例所用二肽基肽酶筛选试剂盒为二肽基肽酶ⅣELISA试剂盒，供应商为上海江莱生物科技有限公司。
实施例1
(1)将日本黄姑鱼鱼皮预处理：
(a)将鱼皮清洗后，冷冻干燥，粉碎至粒径为25～50μm，得鱼皮冷冻粉；
(b)将步骤(a)得到的鱼皮冷冻粉加入到0.25mol/L温控型碱性离子液体双N－(2－二乙氨基)乙基聚乙二醇双咪唑氢氧化钠中，先在20℃温度下，超声功率密度0.25w/cm2，超声处理15min；然后在12℃温度下，超声功率密度1.0w/cm2，超声处理6min；最后在然后在5℃温度下，超声功率密度2.2w/cm2，超声处理2min；离心、干燥，得去杂蛋白、脱脂后的鱼皮粉；
(2)将鱼皮粉置入2wt％的乙酸溶液中，按照每g鱼皮粉中加入0.01mg胃蛋白酶的添加量加入胃蛋白酶，于温度3℃条件下提取胶原蛋白，离心干燥，得日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白；
(3)取日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白50g，加入500mL蒸馏水，然后加入0.3g光响应凝胶因子改性木瓜蛋白酶，搅拌均匀得混合液，将混合液置于紫外灯下，先打开紫外灯于紫外光照条件下搅拌反应1.5h；再关闭紫外灯，遮光于黑暗条件下，80℃条件下搅拌反应0.8h；反应结束后90℃灭活20min；再将上述反应液7000rpm离心8min，收集上清，冷冻干燥得到日本黄姑鱼鱼皮胶原肽；
(4)将日本黄姑鱼鱼皮胶原肽通过二肽基肽酶筛选试剂盒(ELISA)筛选：
(a)待测样品孔中每孔加入待测样品日本黄姑鱼鱼皮胶原肽100μL，每种样品设3个平行孔；设两个阴性对照孔，每孔加未处理组的细胞裂解液100μL；另设一个空白对照孔，加入纯细胞裂解液100μL。(2)酶标板置4℃，包被过夜；
(b)洗板：吸干孔内反应液，用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后，即甩去)，之后将洗涤液注满板孔，浸泡1-2分钟，间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。
(c)阴性对照孔每孔加入PBS 50μL，样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的兔抗人AIF抗体工作液50μL；
(d)酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min；
(e)洗板，同(d)；
(f)每孔加1:5000稀释的HRP-标记的山羊抗兔抗体工作液100μL；
(g)酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min；
(h)洗板，同(d)；
(i)每孔加TMB显色液100μL，轻轻混匀10s，置37℃暗处反应15-20min；
(j)每孔加100μL 2mol/L H2SO4终止反应；
(k)分别测450nm吸光值W1和630nm吸光值W2，最终测得的OD值为两者之差(W1-W2)，以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰；
(l)数据处理：在得出标本(S)和阴性对照(N)的OD值后，计算S/N值。S/N≥2.1为阳性判定标准；即筛选得到生物源二肽基肽酶-IV抑制剂。
实施例2
(1)将日本黄姑鱼鱼皮预处理：
(a)将鱼皮清洗后，冷冻干燥，粉碎至粒径为50μm，得鱼皮冷冻粉；
(b)将步骤(a)得到的鱼皮冷冻粉加入到0.100mol/L温控型碱性离子液体双N－(2－二乙氨基)乙基聚乙二醇双咪唑氢氧化钾中，先在20℃温度下，超声功率密度0.35w/cm2，超声处理10min；然后在15℃温度下，超声功率密度0.7w/cm2，超声处理5min；最后在然后在4℃温度下，超声功率密度2.5w/cm2，超声处理1min；离心、干燥，得去杂蛋白、脱脂后的鱼皮粉；
(2)将鱼皮粉置入5wt％的乙酸溶液中，按照每g鱼皮粉中加入0.03mg胃蛋白酶的添加量加入胃蛋白酶，于温度5℃条件下提取胶原蛋白，离心干燥，得日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白；
(3)取日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白80g，加入800mL蒸馏水，然后加入0.4g光响应凝胶因子改性木瓜蛋白酶，搅拌均匀得混合液，将混合液置于紫外灯下，先打开紫外灯于紫外光照条件下搅拌反应2h；再关闭紫外灯，遮光于黑暗条件下，60℃条件下搅拌反应1h；反应结束后80℃灭活5min；再将上述反应液5000rpm离心10min，收集上清，冷冻干燥得到日本黄姑鱼鱼皮胶原肽；
(4)将日本黄姑鱼鱼皮胶原肽通过二肽基肽酶筛选试剂盒(ELISA)筛选，筛选步骤与实施例1相同，即得生物源二肽基肽酶-IV抑制剂。
实施例3
(1)将日本黄姑鱼鱼皮预处理：
(a)将鱼皮清洗后，冷冻干燥，粉碎至粒径为25μm，得鱼皮冷冻粉；
(b)将步骤(a)得到的鱼皮冷冻粉加入到0.50mol/L温控型碱性离子液体双N－(2－二乙氨基)乙基聚乙二醇双咪唑氢氧化钠中，先在25℃温度下，超声功率密度0.2w/cm2，超声处理10min；然后在10℃温度下，超声功率密度1.5w/cm2，超声处理8min；最后在然后在8℃温度下，超声功率密度2.5w/cm2，超声处理1min；离心、干燥，得去杂蛋白、脱脂后的鱼皮粉；
(2)将鱼皮粉置入4wt％的乙酸溶液中，按照每g鱼皮粉中加入0.02mg胃蛋白酶的添加量加入胃蛋白酶，于温度4℃条件下提取胶原蛋白，离心干燥，得日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白；
(3)取日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白50g，加入500mL蒸馏水，然后加入0.3g光响应凝胶因子改性木瓜蛋白酶，搅拌均匀得混合液，将混合液置于紫外灯下，先打开紫外灯于紫外光照条件下搅拌反应1.5h；再关闭紫外灯，遮光于黑暗条件下，85℃条件下搅拌反应0.5h；反应结束后100℃灭活5min；再将上述反应液8000rpm离心5min，收集上清，冷冻干燥得到日本黄姑鱼鱼皮胶原肽；
(4)将日本黄姑鱼鱼皮胶原肽通过二肽基肽酶筛选试剂盒(ELISA)筛选，筛选步骤与实施例1相同，即得生物源二肽基肽酶-IV抑制剂。
对实施例1-3制得的日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白源二肽基肽酶抑制肽-IV的DPP-IV抑制活性的检测。
(1)检测原理
采用以甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺(Gly-Pro-PNA)为底物的发色底物法筛选DPP-IV抑制剂，该方法的检测原理为在碱性条件下DPP-IV催化底物Gly-Pro-p-nitroanilide水解,生成黄色的对硝基苯胺,后者在波长405nm处有特征性吸收峰,通过酶标仪在405nm处测得的吸光度大小反映酶活性高低。
(2)检测结果如表1所示：
表1.检测结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (6)
1.一种生物源二肽基肽酶-IV抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将日本黄姑鱼鱼皮预处理得鱼皮粉，然后将鱼皮粉置入2～5wt％的乙酸溶液中，按照每g鱼皮粉中加入0.01～0.03mg胃蛋白酶的添加量加入胃蛋白酶，于温度3～5℃条件下提取胶原蛋白，离心干燥，得日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白；
(2)利用复合酶对步骤(1)得到的日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白进行酶解，得日本黄姑鱼鱼皮胶原肽；
(3)将日本黄姑鱼鱼皮胶原肽通过二肽基肽酶筛选试剂盒筛选，即得生物源二肽基肽酶-IV抑制剂。
2.根据权利要求1所述的一种生物源二肽基肽酶-IV抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预处理工艺为：
(a)将鱼皮清洗后，冷冻干燥，粉碎至粒径为25～50μm，得鱼皮冷冻粉；
(b)将步骤(a)得到的鱼皮冷冻粉加入到0.10～0.50mol/L温控型碱性离子液体中，于不同温度条件下超声处理，离心、干燥，得去杂蛋白、脱脂后的鱼皮粉。
3.根据权利要求2所述的一种生物源二肽基肽酶-IV抑制剂的制备方法，其特征在于，所述温控型碱性离子液体为双N－(2－二乙氨基)乙基聚乙二醇双咪唑氢氧根盐。
4.根据权利要求2所述的一种生物源二肽基肽酶-IV抑制剂的制备方法，其特征在于，所述不同温度条件下超声处理的工艺为：先在20～25℃温度下，超声功率密度0.2～0.35w/cm2，超声处理10～20min；然后在10～15℃温度下，超声功率密度0.7～1.5w/cm2，超声处理5～8min；最后在然后在4～8℃温度下，超声功率密度2～2.5w/cm2，超声处理1～3min。
5.根据权利要求1所述的一种生物源二肽基肽酶-IV抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述复合酶为光响应凝胶因子改性木瓜蛋白酶。
6.根据权利要求5所述的一种生物源二肽基肽酶-IV抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶解工艺为：在日本黄姑鱼鱼皮胶原蛋白中加入蒸馏水，然后加入光响应凝胶因子改性木瓜蛋白酶，搅拌均匀得混合液，将混合液置于紫外灯下，先打开紫外灯于紫外光照条件下搅拌反应1～2h；再关闭紫外灯，遮光于黑暗条件下，60～85℃条件下搅拌反应0.5～1h；反应结束后80～100℃灭活5～25min；再将上述反应液5000～8000rpm离心5～10min，收集上清，冷冻干燥得到日本黄姑鱼鱼皮胶原肽。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Han Tao Inventor after: Tang Yunping Inventor after: Jiang Xiaoxia Inventor after: Ding Guofang Inventor after: Yu Fangmiao Inventor after: Yang Zuisu Inventor after: Huang Fangfang Inventor after: Chen Yan Inventor before: Tang Yunping Inventor before: Jiang Xiaoxia Inventor before: Ding Guofang Inventor before: Yu Fangmiao Inventor before: Yang Zuisu Inventor before: Huang Fangfang Inventor before: Chen Yan |