CN109182358B - 适用于水稻秸秆还田的芽孢杆菌纤维素酶基因fib1x - Google Patents

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Abstract

适用于水稻秸秆还田的芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X，属于耕作栽培技术领域，利用细菌处理秸秆的周期则非常短，一般几天即可完成，这样即可避免焚烧秸秆带来的空气污染、其他处理方式带来的多种问题。所以对短翅草螽所有肠道菌进行测定纤维素酶活力的水解圈实验，发现芽孢杆菌(Bacillus sp.)的纤维素酶的活力最强。接着，通过基因的PCR扩增、DNA回收、连接反应、大肠杆菌热激转化、大肠杆菌质粒DNA提取、基因的诱导表达、蛋白电泳检测、序列测定及分析，得到芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X的核酸序列为Seq ID No：1，最后测定芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X表达蛋白的酶活力，结果显示酶活力较高。

Description

适用于水稻秸秆还田的芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X
技术领域
本发明涉及一种适用于水稻秸秆还田的芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X，属于耕作栽培技术领域。
背景技术
秸秆还田是当今世界上普遍重视的一项培肥地力的增产措施，在杜绝了秸秆焚烧所造成的大气污染的同时还有增肥增产作用。秸秆还田能增加土壤有机质，改良土壤结构，使土壤疏松，孔隙度增加，容量减轻，促进微生物活力和作物根系的发育。秸秆还田增肥增产作用显著，一般可增产5％～10％，但若方法不当，也会导致土壤病菌增加，作物病害加重及缺苗(僵苗)等不良现象。因此采取合理的秸秆还田措施，才能起到良好的还田效果。短翅草螽(Conocephalus japonicum Redtenbacher)是草食性的直翅目昆虫，在其肠道中生活着与纤维素分解相关的很多细菌。秸秆还田最本质的技术就是将秸秆中的纤维素快速分解掉。如何利用细菌的繁殖周期短、易操作的特点，从一些植食性的直翅目昆虫肠道中寻找合适的细菌，找到其表达蛋白具有纤维素酶活力的基因，确定基因的表达蛋白具有纤维素酶活力，将细菌应用到秸秆还田把秸秆中的纤维素快速分解成为急需解决的一大难题？如果能够在短翅草螽肠道中找到分泌活性较高的纤维素酶的肠道菌，并将该菌通过基因工程的手段确定其相关基因，该相关基因的表达蛋白对纤维素具有高分解活力，那么即可以为秸秆还田提供一种好的处理技术，即利用该细菌处理粉碎或整体的秸秆。由于细菌的繁殖周期非常短，利用细菌处理秸秆的周期则非常短，一般几天即可完成，这样即可避免焚烧秸秆带来的空气污染、其他处理方式带来的多种问题。所以对短翅草螽所有肠道菌进行测定纤维素酶活力的水解圈实验，发现芽孢杆菌(Bacillus ap.)的纤维素酶的活力最强。接着，通过基因的PCR扩增、PCR反应体系、PCR反应条件、DNA回收、连接反应、大肠杆菌热激转化、大肠杆菌质粒DNA提取、基因的诱导表达、蛋白电泳检测、序列测定及分析，得到芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X的核酸序列为Seq ID No：1，最后测定芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X表达蛋白的酶活力，结果显示酶活力较高。所以，发明适用于水稻秸秆还田的芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X是必要的。
发明内容
为了克服如何利用细菌的繁殖周期短、易操作的特点，从一些植食性的直翅目昆虫肠道中寻找合适的细菌，找到其表达蛋白具有纤维素酶活力的基因，确定基因的表达蛋白具有纤维素酶活力，将细菌应用到秸秆还田把秸秆中的纤维素快速分解的难题，本发明提供了一个适用于水稻秸秆还田的芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X，适用于水稻秸秆还田的芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X利用细菌处理秸秆的周期则非常短，一般几天即可完成，这样即可避免焚烧秸秆带来的空气污染、其他处理方式带来的多种问题。所以对短翅草螽所有肠道菌进行测定纤维素酶活力的水解圈实验，发现芽孢杆菌(Bacillus sp.)的纤维素酶的活力最强。接着，通过基因的PCR扩增、PCR反应体系、PCR反应条件、DNA回收、连接反应、大肠杆菌热激转化、大肠杆菌质粒DNA提取、基因的诱导表达、蛋白电泳检测、序列测定及分析，得到芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X的核酸序列为Seq ID No：1，最后测定芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X表达蛋白的酶活力，结果显示酶活力较高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
适用于水稻秸秆还田的芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X的核酸序列为Seq ID No：1，具体构建及验证过程如下：
1.基因的PCR扩增：将从中国黑龙江省五常水稻田由曾宪楠在2017年8月抓获的短翅草螽(Conocephalus japonicum Redtenbacher)肠道中提取的芽孢杆菌(Bacillus sp.)基因组DNA，使用FIB1X-5/FIB1X-3引物对进行PCR扩增，引物序列见表1。参照GenBank中公布的Fiber基因编码区的N端和C端序列同源性，设计合成一对特异性引物FIB1X5/FIB1X3，分别在5’端引入NdeI和SalI酶切位点(箭头所示)，用于扩增全长基因。根据全长基因的不同位点设计合成FIB1X51、FIB1X52、FIB1X31、FIB1X32四条引物，在5’端引入BamHI和SalI酶切位点(箭头所示)，用于构建缺失基因。
2.PCR反应体系：KOD聚合酶反应体系50μL，KOD酶1μL，引物对(10mmol/L)1μL，模板1μL，10x PCR Buffer 5μL，MgSO43μL，dNTP 5μL，ddH2O补足至50μL。
3.PCR反应条件，详见表2。
4.DNA回收：(1)使用灭菌解剖刀切下含目的DNA片段的凝胶，置于1.5mL离心管中；(2)加入3倍体积溶胶的溶胶缓冲液A，置于50℃水浴锅中水浴10min左右；(3)待溶胶完全溶解后加入0.5个A溶胶缓冲液体积的B溶液；(4)混匀后转入回收柱，12000r/min离心1min；(5)去除残留液体，加入洗脱缓冲液W1500μL，12000r/min离心1min；(6)去除残留液体，洗脱缓冲液W2700μL，洗脱两次；(7)将30μL的TE溶液加入回收柱中，室温静置2min；(8)将上步回收柱12000r/min离心1min，备用。如需要可以重复7-8步骤一次。
5.连接反应：将DNA胶回收产物与pEB载体按照以下连接体系进行连接反应。充分混匀后，16℃连接4h或4℃条件下连接过夜。目的片段DNA 4μL，载体DNA 1μL，连接试剂盒Solution I 5μL。
6.大肠杆菌热激转化：将连接产物全量加入到100μL大肠杆菌JM109的感受态细胞中，混匀，冰浴30min以上，取出离心管，42℃准确热击90s，再冰浴3min，加入900μL LB液体培养基37℃培养1h左右，取200μL于LB固体平板涂布，加入相应的抗生素，X-gal溶液40μL，IPTG溶液4μL，37℃培养过夜，进行蓝白班筛选，筛选出方向连接正确的阳性克隆，以PEB载体的正向引物pEBF和所克隆基因的反向引物进行PCR鉴定。提取阳性克隆菌株的质粒，转入大肠杆菌Rosetta菌株感受态细胞中。经PCR、酶切等鉴定后再通过序列测定，鉴定出的正确重组转化子进行诱导和表达目的蛋白。
7.大肠杆菌质粒DNA提取：(1)挑取阳性转化子于LB液体培养基中培养过夜，取1-4ml菌液于12000r/min离心1min，弃去上清；(2)加入250μL含有50mg/mlRNANase的S1溶液悬浮沉淀；(3)加入250μL细菌裂解液S2并充分缓慢温和地上下翻转4-6次，直到溶液透明清亮为止，这一步骤不应该超过5分钟；(4)加入350μL S3中和液并充分温和地上下翻转6-8次，12000r/min下离心10分钟；(5)随后吸取上清，然后转移到制备管中，在12000r/min条件下离心1分钟并弃掉滤液；(6)随后加入500μL洗涤液W1，12000r/min条件下离心1分钟并弃掉滤液；(7)随后加入700μL，W2，洗去多余盐分，12000r/min条件下离心1分钟，之后重复一次；(8)将收集柱转移到新1.5ml离心管上，收集柱中央滴加60-80μL预热至65℃的TE缓冲液或灭菌水，静止5分钟，12000r/min条件下离心1分钟，风干并保存在-20℃备用。
8.基因的诱导表达：(1)将大肠杆菌的单菌落接种于LB液体培养基37℃条件下220rpm活化12-16h；(2)采用1％接种量接种阳性表达菌株于200mL LB液体培养基的锥形瓶中，37℃条件下，220rpm振荡培养大约2h至OD600＝0.6左右；之后加入1M的IPTG200μL；放置于摇床上150rpm低速培养，16-30℃低温条件下诱导大约4-16h，菌株不同条件也不同；(3)将诱导的培养液在6000rpm的条件下离心5min并收集菌体，用预冷的10mmol/L Tris·Cl(pH调至8.0左右)悬浮菌体2-3次；(4)在冰水混合物中超声波破碎菌体，超声波3s，停3s，50ml悬浮菌液大约超声10min；(5)在4℃和12000rpm条件下离心10min分别收集上清和沉淀，沉淀组分依然用10mmol/L Tris·Cl悬浮。之后分别进行蛋白电泳检测即SDS-PAGE。
9.蛋白电泳检测：电泳：将粗蛋白样品与3x上样Buffer按2∶1混匀，沸水浴处理10min，取待测样品液10mL上样，电泳仪设置120V预电泳10-15min，然后进行150V恒压电泳1h。染色：电泳结束后取出蛋白凝胶，放入50mLSI溶液中，置微波炉加热30s，60rpm振荡5min；将胶取出后放入SII和SIII的混合液中(每50mL SII加200L SIII)，再微波炉加热30s后取出摇床60rpm振荡至蛋白胶条带清晰可见，凝胶成像系统成像。
10.序列测定及分析：由美国Virongy中国公司完成序列测定，用Clone Manager、Omiga、NCBI BLAST、DNAMAN等软件分析序列，结果为Seq ID No：1(图1)。
11.表达蛋白(纤维素酶)分解纤维素酶活力测定：首先绘制葡萄糖标准曲线，然后配制不同浓度的表达蛋白(纤维素酶)标准液，测定时分别吸取0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml，0.6ml上述标准液，用水补足至1ml即为不同浓度的标准液。接着采用滤纸酶活(FPA)测定方法测定表达蛋白(纤维素酶)的酶活力。方法：取1ml酶液，加1ml 0.1mol/L、Ph4.6的醋酸缓冲液，预热到50℃，加入1条1x6cm的滤纸(50±1mg)，50℃保温1h。取出，沸水浴灭活5min，冷却至室温，用3mlDNS试剂显色后稀释3倍，测OD值(520nm)。OD值越大，说明酶活力越强。最后进行酶活力计算：从标准曲线中查出葡萄糖μmol数；
Figure BSA0000170745630000041
Figure BSA0000170745630000042
其中，60为保温时间(酶与底物作用时间，min)；Ew为粗酶液的体积(ml)；μ是指在特定条件下，每分钟催化水稻秸秆纤维素水解成1μmol葡萄糖的酶量。经测定，芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X的表达蛋白(纤维素酶)的酶活力最高值为3879.91μ/ml。可见，芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X的表达蛋白具有较强的分解纤维素的能力。
本发明的有益效果为：本发明适用于水稻秸秆还田的芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X，利用细菌处理秸秆的周期则非常短，一般几天即可完成，这样即可避免焚烧秸秆带来的空气污染、其他处理方式带来的多种问题。所以对短翅草螽所有肠道菌进行测定纤维素酶活力的水解圈实验，发现芽孢杆菌(Bacillus sp.)的纤维素酶的活力最强。接着，通过基因的PCR扩增、PCR反应体系、PCR反应条件、DNA回收、连接反应、大肠杆菌热激转化、大肠杆菌质粒DNA提取、基因的诱导表达、蛋白电泳检测、序列测定及分析，得到芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X的核酸序列为Seq ID No：1，最后测定芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X表达蛋白的酶活力，结果显示酶活力较高。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步说明。
图1为适用于水稻秸秆还田的芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X的核酸序列(Seq IDNo：1)。
具体实施方式
实施例一
1.基因的PCR扩增：
将从中国黑龙江省五常水稻田由曾宪楠在2017年8月抓获的冻存在冰箱里的短翅草螽(Conocephalus japonicum Redtenbacher)肠道中提取的芽孢杆菌(Bacillus sp.)基因组DNA，使用FIB1X-5/FIB1X-3引物对进行PCR扩增，引物序列见表1。参照GenBank中公布的Fiber基因编码区的N端和C端序列同源性，设计合成一对特异性引物FIB1X5/FIB1X3，分别在5’端引入NdeI和SalI酶切位点(箭头所示)，用于扩增全长基因。根据全长基因的不同位点设计合成FIB1X51、FIB1X52、FIB1X31、FIB1X32四条引物，在5’端引入BamHI和SalI酶切位点(箭头所示)，用于构建缺失基因。
表1：引物序列
Figure BSA0000170745630000051
2.PCR反应体系
Figure BSA0000170745630000052
3.PCR反应条件
表2：PCR反应条件
Figure BSA0000170745630000053
4.DNA回收
(1)使用灭菌解剖刀切下含目的DNA片段的凝胶，置于1.5mL离心管中；
(2)加入3倍体积溶胶的溶胶缓冲液A，置于50℃水浴锅中水浴10min左右；
(3)待溶胶完全溶解后加入0.5个A溶胶缓冲液体积的B溶液；
(4)混匀后转入回收柱，12000r/min离心1min；
(5)去除残留液体，加入洗脱缓冲液W1500μL，12000r/min离心1min；
(6)去除残留液体，洗脱缓冲液W2700μL，洗脱两次；
(7)将30μL的TE溶液加入回收柱中，室温静置2min；
(8)将上步回收柱12000r/min离心1min，备用。如需要可以重复7-8步骤一次。
5.连接反应
将DNA胶回收产物与pEB载体按照以下连接体系进行连接反应。充分混匀后，16℃连接4h或4℃条件下连接过夜。
目的片段DNA 4μL
载体DNA 1μL
连接试剂盒Solution I 5μL
6.大肠杆菌热激转化
将连接产物全量加入到100μL大肠杆菌JM109的感受态细胞中，混匀，冰浴30min以上，取出离心管，42℃准确热击90s，再冰浴3min，加入900μL LB液体培养基37℃培养1h左右，取200μL于LB固体平板涂布，加入相应的抗生素，X-gal溶液40μL，IPTG溶液4μL，37℃培养过夜，进行蓝白班筛选，筛选出方向连接正确的阳性克隆，以PEB载体的正向引物pEBF和所克隆基因的反向引物进行PCR鉴定。提取阳性克隆菌株的质粒，转入大肠杆菌Rosetta菌株感受态细胞中。经PCR、酶切等鉴定后再通过序列测定，鉴定出的正确重组转化子进行诱导和表达目的蛋白。
7.大肠杆菌质粒DNA提取
(1)挑取阳性转化子于LB液体培养基中培养过夜，取1-4ml菌液于12000r/min离心1min，弃去上清；
(2)加入250μL含有50mg/mlRNANase的S1溶液悬浮沉淀；
(3)加入250μL细菌裂解液S2并充分缓慢温和地上下翻转4-6次，直到溶液透明清亮为止，这一步骤不应该超过5分钟；
(4)加入350μL S3中和液并充分温和地上下翻转6-8次，12000r/min下离心10分钟；
(5)随后吸取上清，然后转移到制备管中，在12000r/min条件下离心1分钟并弃掉滤液；
(6)随后加入500μL洗涤液W1，12000r/min条件下离心1分钟并弃掉滤液；
(7)随后加入700μL，W2，洗去多余盐分，12000r/min条件下离心1分钟，之后重复一次；
(8)将收集柱转移到新1.5ml离心管上，收集柱中央滴加60-80μL预热至65℃的TE缓冲液或灭菌水，静止5分钟，12000r/min条件下离心1分钟，风干并保存在-20℃备用。
8.基因的诱导表达
(1)将大肠杆菌的单菌落接种于LB液体培养基37℃条件下220rpm活化12-16h；
(2)采用1％接种量接种阳性表达菌株于200mL LB液体培养基的锥形瓶中，37℃条件下，220rpm振荡培养大约2h至OD600＝0.6左右；之后加入1M的IPTG200μL；放置于摇床上150rpm低速培养，16-30℃低温条件下诱导大约4-16h，菌株不同条件也不同；
(3)将诱导的培养液在6000rpm的条件下离心5min并收集菌体，用预冷的10mmol/LTris·Cl(pH调至8.0左右)悬浮菌体2-3次；
(4)在冰水混合物中超声波破碎菌体，超声波3s，停3s，50ml悬浮菌液大约超声10min；
(5)在4℃和12000rpm条件下离心10min分别收集上清和沉淀，沉淀组分依然用10mmol/L Tris·Cl悬浮。之后分别进行蛋白电泳检测即SDS-PAGE。
9.蛋白电泳检测
电泳：将粗蛋白样品与3x上样Buffer按2∶1混匀，沸水浴处理10min，取待测样品液10mL上样，电泳仪设置120V预电泳10-15min，然后进行150V恒压电泳1h。
染色：电泳结束后取出蛋白凝胶，放入50mLSI溶液中，置微波炉加热30s，60rpm振荡5min；将胶取出后放入SII和SIII的混合液中(每50mL SII加200L SIII)，再微波炉加热30s后取出摇床60rpm振荡至蛋白胶条带清晰可见，凝胶成像系统成像。
表3 SDS聚丙烯酰氨凝胶制备表
Figure BSA0000170745630000071
10.序列测定及分析
由美国Virongy中国公司完成序列测定，用Clone Manager、Omiga、NCBI BLAST、DNAMAN等软件分析序列，结果为Seq ID No：1(图1)。
11.表达蛋白(纤维素酶)对水稻秸秆粉具有强分解能力活性测定
首先绘制葡萄糖标准曲线，然后配制不同浓度的表达蛋白(纤维素酶)标准液，测定时分别吸取0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml，0.6ml上述标准液，用水补足至1ml即为不同浓度的标准液。接着采用滤纸酶活(FPA)测定方法测定表达蛋白(纤维素酶)对水稻秸秆粉的分解能力。方法：取1ml酶液，加1ml 0.1mol/L、Ph4.6的醋酸缓冲液，预热到50℃，加入1条1x6cm的滤纸(50±1mg)，50℃保温1h。取出，沸水浴灭活5min，冷却至室温，用3mlDNS试剂显色后稀释3倍，测OD值(520nm)。OD值越大，说明酶活力越强。最后进行酶活力计算：从标准曲线中查出葡萄糖μmol数；
Figure BSA0000170745630000072
其中，60为保温时间(酶与底物作用时间，min)；Ew为粗酶液的体积(ml)；μ是指在特定条件下，每分钟催化水稻秸秆纤维素水解成1μmol葡萄糖的酶量。经测定，芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X的表达蛋白(纤维素酶)的酶活力最高值为3879.91μ/ml。可见，芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X的表达蛋白具有较强的分解纤维素的能力。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。
Figure BSA0000170745630000091
Figure BSA0000170745630000101
Figure ISA0000170745650000011
Figure ISA0000170745650000021

Claims (1)

1.适用于水稻秸秆还田的芽孢杆菌纤维素酶基因FIB1X，其特征在于基因FIB1X的核苷酸序列如Seq ID No：1所示。
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