CN109164066A - 一种基于G-wire纳米结构的共振光检测试剂盒及检测miRNA-122的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于G‑wire纳米结构的共振光检测试剂盒及检测miRNA‑122的方法；其中共振光检测试剂盒包括共振光探针、Mg2+、K+、缓冲溶液。本发明通过诱导G‑wire的形成实现了实际样品中miRNA‑122的检测。线性范围为50pM‑300nM，检测限为6.1pM，表明该共振光检测试剂盒具有高灵敏度和高选择。此外，该方法避免了复杂的修饰过程，并且对细胞裂解液中的靶标有良好响应，可以进一步应用在生物医学和临床诊断上。
Description
技术领域
本发明涉及分子检测领域，特别涉及一种基于G-wire纳米结构的共振光检测试剂盒及检测miRNA-122的方法。
背景技术
G-四连体DNA由富G的DNA分子组成，通过Hoogsteen氢键作用将四个鸟嘌呤(G)残基结合成G-四连体(G4)。在具有特定金属阳离子的情况下，G-四连体会自发地组装成G-wire，由于G-wire结构具有独特的光学和电化学特性，所以被用于生物分子和离子的检测。Ye等人开发了一种将光电化学与G-wire结构相结合的方法用于miRNA的检测，但该方法需要复杂的制备工艺和基底材料，从而增加了操作的复杂性[Ye,C.,Wang,M.Q.,Luo,H.Q.,Li,N.B.Anal.chem.2017,89,11697-11702]。Ren等人通过将G-wire与特定的T-Hg2+-T结构以及Exo-III辅助目标物循环相结合，构建了一个放大的共振瑞利散射光(RRS)适配体传感器用于检测Hg2+，但这种方法需要使用酶，使得整个实验系统的反应条件更加苛刻[Ren,W.,Zhang,Y.,Chen,H.G.,Gao,Z.F.,Li,N.B.,Luo,H.Q.Anal.chem.2016,88,1385-1390]。另外，上述检测方法在设计上都具有昂贵和耗时的缺点，因此，基于G-wire结构来开发一种低成本、免标记、免酶并且具有高灵敏度与高选择性的检测试剂盒来实现对生物分子的检测是非常有意义的。
发明内容
本发明首次通过将G-wire纳米结构与共振光散射技术相结合构建了一种共振光检测试剂盒，可以实现对生物分子高效、快速、高灵敏的检测。以miRNA-122为目标物，本发明所采取的技术方案是：
一种基于G-wire纳米结构的共振光检测试剂盒，包括DNA1、DNA2、Mg2+、K+、缓冲溶液。其中：
所述DNA序列号为：
DNA1:
DNA2:
进一步地，DNA1的粗斜体碱基是miRNA-122的互补序列；DNA2的粗斜体碱基是DNA1的互补序列；DNA2的下划线碱基是DNA1粗斜体碱基的错配碱基。
进一步地，K+有利于G-四连体的形成，Mg2+可以促使G-四连体进一步自组装成丝状的G-wire。
一种基于G-wire纳米结构的共振光检测试剂盒及检测miRNA-122的方法，其特征包括以下步骤：
(1)将浓度和体积都是2μM、100μL的DNA1、DNA2在离心管中混合得到双链DNA(dsDNA)；
(2)将100μL不同浓度的目标miRNA溶液加入到混合物中，摇匀后，在37℃下反应40分钟。
(3)将200mM MgCl2和200mM KCl加入到溶液中，然后在4℃下孵育2小时
(4)进行低聚物溶液共振光散射强度的测定。
进一步地，记录的共振光散射光谱通过同步扫描获得，扫描在220.0nm-700.0nm范围内进行，发射波长等于激发波长(λem＝λex)，发射和激发的狭缝宽度均为3.0nm。并且，增强的共振光强度(ΔIRLS)是通过ΔIRLS＝IRLS-IRLS0获得的，其中IRLS和IRLS0分别是存在和不存在目标miRNA溶液时的系统的共振光强度。
一种基于G-wire结构的共振光检测试剂盒对miRNA-122的检测原理如图1所示。DNA1序列与目标miRNA互补。DNA2序列由富-G的DNA片段和DNA1的互补序列组成。DNA1与DNA2杂交形成双链DNA(dsDNA)，从而富-G的DNA片段被锁住。在目标miRNA存在下，通过DNA1与miRNA-122的特异性结合打开dsDNA。因此，DNA2中富-G的DNA片段将大量游离在溶液中。这些释放出来的片段在K+作用下将会折叠成平行的G-四连体并在Mg2+的存在下进一步自组装成丝状的G-wire，引起体积增大，从而引起共振光散射强度增强，因此可以将共振光散射光谱信号作为免标记的miRNA-122检测的读出信号。如果不存在miRNA-122，DNA2中富-G的DNA片段仍与DNA1杂交，导致富-G的DNA片段被锁定，以至于不能形成G-线，从而极大地避免了假阳性结果。
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益效果在于：
1、设计的检测试剂盒为低成本的，并且易于获得，检测过程大大简化，无需繁琐的基材准备。
2、本发明设计的检测试剂盒可用于快速筛查样本中是否含有目标物；也可以用于检测其他核酸。
3、本发明设计的检测试剂盒对细胞裂解液中的靶标有良好的响应，且对于同一家族中的不同样品有良好的区分度。
附图说明
【图1】为检测试剂盒的工作原理图。
【图2】为本实验中所需的探针序列。
【图3】为本实验的可行性光谱图及G-wire纳米结构的原子力显微镜图。
【图4】为DNA1与miRNA-122杂交时间优化图
【图5】为反应温度优化图。
【图6】为K+与Mg2+用量优化图。
【图7】为Mg2+在反应体系中的反应时间优化图。
【图8】为共振光试剂盒的灵敏度分析图。
【图9】为共振光检测试剂盒的特异性分析图。’
【图10】为共振光检测试剂盒用于细胞裂解液检测中的分析图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若无特别说明，本发明中所涉及到的实验均为本领域技术人员所熟知的常规操作。
实施例1
一种基于G-wire纳米结构的共振光检测试剂盒在miRNA-122检测中的可行性测定
第一组将200nM的DNA1、DNA2在离心管中混合得到双链DNA(dsDNA)后，测其共振光信号。第二组在第一组的基础上加入目标物，然后测其共振光信号。结果如图3所示，当只有DNA1、DNA2存在时的共振光信号较弱，而加入miRNA-122后的共振光信号明显增强。实验结果表明，在缺少miRNA-122时，不能形成G-wire，仅能产生弱的共振光信号。当加入miRNA-122后，由于miRNA-122与DNA1结合，从而释放出含富-G序列的DNA2。DNA2的富-G序列能够折叠成平行的G-四连体，这些G-四连体可在Mg2+作用下进一步自组装成丝状的纳米G-wire，从而引起体积增大，产生强的共振光信号。并且由图3原子力显微镜可看出G-wire的轴向延伸丝状聚合物，且G-wire为纳米结构。
实施例2
一种基于G-wire纳米结构的共振光检测试剂盒在miRNA-122检测中的优化条件分析
为了获得最佳的检测性能，研究并优化了影响miRNA-122检测的多种因素，包括Mg2+和K+的浓度、反应时间和工作温度。如图4所示，共振光强度变化在60分钟时趋于稳定。因此，选择60分钟作为DNA1和miRNA-122结合的最有效反应时间。如图5所示，在37℃下观察到最高的共振光强度变化(ΔIRLS＝I-I0)。所以，选择37℃作为最佳反应温度。如图6所示，当Mg2+浓度为200mM且K+为200mM时，共振光强度具有最大值，因此，将Mg2+和K+的浓度定为200mM。如图7所示，随着Mg2+反应时间的延长，系统共振光的强度显着增加，2小时后达到稳定，所以共振光检测前的孵育时间选定为2小时。
实施例3
一种基于G-wire纳米结构的共振光检测试剂盒在miRNA-122检测中的灵敏度测定
将DNA1(200nM)、DNA2(200nM)混合物在37℃下孵育40分钟，然后，将不同浓度的miRNA-122溶液加入到混合物中，在37℃下孵育60分钟，再向混合物中加入Mg2+(200mM)和K+(200mM)并在4℃下反应2小时，进行共振光检测。如图8所示，在50pM至300nM范围内的对一系列浓度的miRNA-122溶液进行了测量。得到miRNA-122和共振光强度之间的线性回归方程为ΔI＝1.2981C+32.8620(R2＝0.9930)(其中C是miRNA-122浓度；ΔI＝I-I0，其中I是加入miRNA-122后的RLS强度，I0是加入miRNA-122之前的RLS强度)，根据3σ/k计算出的miRNA-122的检测限为6.1pM，表明该共振光检测试剂盒具有良好的灵敏度。
实施例4
一种基于G-wire纳米结构的共振光检测试剂盒在miRNA-122检测中的特异性测定
为了分析该检测试剂盒对miRNA-122的特异性，在实施例2中的优选状态下，分别检测miRNA家族中的miRNA-141，miRNA-26a，miRNA-199以及miRNA-21。如图9所示，表明本发明所提出的方法对检测miRNA-122具有良好的特异性。
实施例5
一种基于G-wire纳米结构的共振光检测试剂盒用于细胞裂解液中miRNA-122的检测
为了研究该共振光检测试剂盒的实际应用，选取了两组人类细胞，包括肝癌细胞和正常肝细胞。通过Trizol法提取得到总RNA细胞裂解液。如图10所示，用所述共振光检测试剂盒分别对两组细胞裂解液进行检测，结果显示肝癌中miRNA-122的浓度比正常肝细胞中miRNA-122的浓度低。这个结果与文献报道是一致的，表明该方法可用于实际样品的检测，这对于临床诊断有重要的意义，具有很大的应用潜力。
Claims (6)
1.一种基于G-wire纳米结构的共振光检测试剂盒及检测miRNA-122的方法，其特征在于，共振光检测试剂盒包括：共振光探针、Mg2+、K+、缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述的一种基于G-wire纳米结构的共振光检测试剂盒，其特征在于，所述的共振光探针序列号为：
DNA1:5'-CAAACACCATTGTCACACTCCA-3'
DNA2:5'-AGGGTGGGGTGGGACAGGGGTGTTTG-3'
3.根据权利要求2所述的共振光探针序列，其特征在于：
DNA1的粗斜体碱基是miRNA-122的互补序列；DNA2的粗斜体碱基是DNA1的互补序列；DNA2的下划线碱基是DNA1粗斜体碱基的错配碱基。
4.根据权利要求1所述的一种基于G-wire结构的共振光检测试剂盒，其特征在于：
K+可以有助于G-四连体的形成，Mg2+可以促使G-四连体进一步自组装成丝状的G-wire。
5.根据权利要求1所述的一种基于G-wire纳米结构的共振光检测试剂盒及检测miRNA-122的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将浓度和体积都是2μM、100μL的DNA1、DNA2在离心管中混合得到双链DNA(dsDNA)；
(2)将100μL的miRNA-122溶液加入到混合物中，摇匀后，在37℃下反应40分钟。
(3)将200mM MgCl2和200mM KCl加入到溶液中，然后在4℃下孵育2小时。
(4)进行低聚物溶液共振光散射强度的测定。
6.根据权利要求5所述的检测步骤，其特征在于：
记录的共振光散射光谱通过同步扫描获得，扫描在220.0nm-700.0nm范围内进行，发射波长等于激发波长(λem＝λex)，发射和激发的狭缝宽度均为3.0nm。并且，增强的共振光强度(ΔIRLS)是通过ΔIRLS＝IRLS-IRLS0获得的，其中IRLS和IRLS0分别是存在和不存在目标miRNA溶液时的系统的共振光强度。
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