CN109161529B - 一种用于细胞培养的聚吡咯薄膜基底制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种配制聚吡咯溶液用于细胞培养的聚吡咯薄膜基底制备方法，通过如下技术方案实现：搭建减压蒸馏装置提纯吡咯单体，二甲基亚砜作为有机溶剂与吡咯单体、催化剂、氧化剂反应得到聚吡咯溶液，旋涂法制备聚吡咯薄膜基底，真空干燥、灭菌后用于细胞培养。本发明使用二甲基亚砜作为有机溶剂，增加了聚吡咯薄膜基底的亲水性和细胞膜离子通透性。旋涂法操作简单，基底厚度可通过旋涂的次数调节。制备的聚吡咯薄膜基底安全无毒、结构均匀，具有良好的导电性和稳定性，与细胞间的相互作用促进了神经细胞突触的分化与生长，有利于细胞间电信号传递和受损神经细胞的修复。

Description

一种用于细胞培养的聚吡咯薄膜基底制备方法

技术领域

本发明涉及一种配制聚吡咯溶液，用于细胞培养的聚吡咯薄膜基底制备方法，属于纳米材料制备技术领域。

背景技术

纳米科技是二十一世纪科技产业革命的重要内容之一，是一门包括物理学、化学、生物学、材料科学和电子学在内高度交叉的综合性学科。它不仅包含以观测、分析和研究为主线的基础学科，同时还有以纳米工程与加工学为主线的技术科学，是一个融前沿科学和高技术于一体的完整体系。纳米技术在生物医药领域的应用具有巨大潜力，大量的基础研究成果预示其在药物传递、生物成像和生物传感等方面具有巨大优势。纳米材料学作为纳米科技的分支，因其在理论上的重要意义以及应用上的巨大潜力而成为科学研究的前沿和热点，其中聚吡咯是目前研究最多的导电高分子材料，因在传感器、电磁屏蔽材料、电极材料、催化剂、药物载体以及防腐蚀等领域具有极其广阔的应用前景而引起了人们的广泛关注。

聚吡咯作为一种多功能性高分子材料，不同于传统的医用高分子，具有极高的表面能，其导电率可在2～3年内保持稳定。由于其易合成、具有良好的机械性能和生物相容性以及较高的环境稳定性，被广泛研究并应用于各大生物医学领域，包括组织工程、药物释放、生物器件以及神经电极涂层等。由于这些独特的物理化学性质，聚吡咯在湿度传感器、金属防腐、电磁屏蔽材料、二次电池电极材料、组织细胞培养、神经修复再生等研究领域占据着举足轻重的地位。

现阶段聚吡咯薄膜基底的制备方法有很多种，但还存在尚未解决的问题，限制了其实际应用。例如，采用界面聚合法制备聚吡咯薄膜的实验中，聚吡咯薄膜与液相接触一侧表面粗糙度逐渐增大，与气相接触一侧的表面光滑无明显变化，导致得到的聚吡咯薄膜粗糙不平，薄膜表面致密性不均匀(陈欣.纳米结构的聚吡咯纤维和薄膜的可控制备研究[D].天津大学,2016.)；在纯钛表面采用恒电流聚合法制备聚吡咯涂层时，钛表面的聚吡咯颗粒呈结节样、菜花样等结构不均匀颗粒([1]段嫄嫄,贾骏,张少锋,等.纯钛表面聚吡咯涂层的制备及其对成骨细胞生长的影响[J].稀有金属材料与工程,2007,36(1):91-95.)。因此，为避免制备的聚吡咯薄膜基底因表面结构不均匀对实验结果造成偏差，配制聚吡咯溶液的过程和制备聚吡咯薄膜基底的方法变得尤为重要。二甲基亚砜是一种两亲性非质子型溶剂，具有特殊的溶媒效应，还能够降低细胞冰点，减轻自由基对细胞的损害，在化学反应中起到反应溶剂、反应试剂的双重作用，对化学反应具有加速、催化作用([2]陈秀仁,张怀有,田锡义.二甲基亚砜的性质和应用[J].辽宁化工,2000(1):31-35.)，避免了聚吡咯胶束粒子间相互碰撞融合生成团聚颗粒。聚吡咯溶于二甲基亚砜后产生油相液体在催化剂和氧化剂的作用下形成的聚吡咯溶液，浓度适当对细胞无毒性伤害。二甲基亚砜具有极强的通透性，诱导细胞膜产生瞬时水通道包围疏水性脂质分子，形成亲水性通道，增强了细胞膜离子通透性，引起Na⁺和K⁺等扩散([3]方志聪,戚智.二甲基亚砜对生物膜的作用机理[J].生物物理学报,2012,28(8):638-643.)。二甲基亚砜极强的通透性增加了聚吡咯薄膜基底的亲水性，旋涂后得到的聚吡咯薄膜基底颗粒分布均匀、亲水性增强、稳定性良好，为细胞的生长和粘附提供了非常适宜的体外环境，为细胞之间的电信号传导提供了有力的支撑。同时，聚吡咯薄膜基底良好的生物相容性为成骨细胞、心肌细胞等模拟了一种良好的体内微环境，聚吡咯薄膜基底与细胞骨架相互作用释放的膜表面蛋白促进了细胞的分化和再生。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于细胞培养的聚吡咯薄膜基底制备方法，采用氧化聚合法配制聚吡咯溶液，旋涂法制备聚吡咯薄膜基底，烘干灭菌后用于细胞培养。通过简单的化学反应和旋涂工艺制备出的聚吡咯薄膜基底具有良好的亲水性、导电性和稳定性。本发明属于纳米材料制备技术领域，为聚吡咯薄膜基底的制备提供一种高效、简单、低成本的制备方法。

本发明技术解决方案：一种用于细胞培养的聚吡咯薄膜基底制备方法，其特征在于：二甲基亚砜在配制聚吡咯溶液中起到了反应试剂和反应溶剂的双重作用，得到的聚吡咯溶液浓度适当无毒性，聚吡咯结构未被破坏，旋涂后得到的聚吡咯薄膜基底性质稳定，具有良好的亲水性和导电性，促进了神经细胞的生长和分化、诱导神经细胞表面蛋白分泌增多，加快神经细胞间的电信号传递和受损神经细胞的修复。

主要包括以下步骤：

(1)减压蒸馏：搭建减压蒸馏装置，将吡咯试剂放入蒸馏瓶中，磁力搅拌并在60-80℃恒温加热，蒸馏出的吡咯单体通过冷凝管流入收集瓶，待全部的吡咯单体提纯完毕后，取出放入试管内备用。

(2)聚吡咯合成：以过硫酸铵或三氯化铁为氧化剂，在烧杯中配制4-10ml过硫酸铵水溶液，称取十二烷基苯磺酸钠0.05-0.10g放入过硫酸铵水溶液/三氯化铁水溶液中，超声溶解得到澄清混合液，取40-50μl吡咯单体溶于3-6ml二甲基亚砜溶剂，混合均匀倒入混合液中，密封并置于干燥避光处反应，合成聚吡咯溶液。

(3)旋涂：盖玻片放入装有无水乙醇的烧杯中，将装有盖玻片的烧杯放入超声机内超声30-60min，清洗后的盖玻片吹干后作为衬底放置在匀胶机吸盘上，将步骤(2)合成的聚吡咯溶液，每次抽取20-30μl滴加在盖玻片上，以1500-2500rmp转速旋涂20-30s，使聚吡咯溶液均匀旋涂在盖玻片表面，旋涂后的聚吡咯颗粒在盖玻片上具有良好的附着性，且分散均匀。

(4)真空干燥：将步骤(3)得到的聚吡咯基底放入真空干燥箱内，温度设定为60-90℃，打开油泵和真空阀，待温度达到预定值、真空抽取完毕后，关闭油泵和真空阀，真空干燥4-6h后取出，得到聚吡咯薄膜基底。

(5)灭菌聚吡咯薄膜基底：将步骤(4)得到的聚吡咯薄膜基底放入100-120℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20-40min，放入60-80℃烘干箱内烘干30min，烘干完成后取出聚吡咯薄膜基底放入培养皿中进行细胞培养。

所述的吡咯为分析纯，经减压蒸馏装置提纯后，变为无色透明的纯净吡咯单体，提纯后的吡咯单体始终处于密封状态，置于4℃冰箱内存放备用。

所述的聚吡咯溶液配置中，过硫酸铵/三氯化铁为氧化剂，十二烷基苯磺酸钠为催化剂，摩尔比为1:2-1.5:2。

所述的聚吡咯溶液配置中，加入吡咯单体的体积为40-50μl，二甲基亚砜有机溶剂的体积为3-6ml，得到的聚吡咯薄膜基底有良好的亲水性和稳定性，接触角范围在10°-25°，存储时间不小于24个月。

所述的聚吡咯溶液反应过程，反应时间为36-48h，反应温度为15-20℃。

所述的旋涂法，聚吡咯薄膜的厚度范围在20-30nm，聚吡咯薄膜基底接触角范围在10°-25°，聚吡咯薄膜基底的厚度和接触角与旋涂转速和旋涂时间线性相关。

所述的真空干燥过程中，温度为60-90℃，真空烘干时间为4-6h。

所述的真空干燥过程结束后，原子力显微镜在导电模式下得到聚吡咯薄膜基底电流范围在1-5nA，聚吡咯薄膜基底的电流强弱与旋涂厚度线性相关。

所述的真空干燥过程结束后，使用原子力显微镜在接触模式下对聚吡咯薄膜基底扫描成像，得到的图像表面颗粒分布均匀，颗粒的粒径范围在0.4-1.2μm，聚吡咯颗粒的粒径大小与旋涂次数线性相关。

本发明与现有方法相比有以下优点：

(1)本发明解决了现有技术制作的聚吡咯薄膜致密性不均匀、聚吡咯颗粒易团聚等问题，避免了复杂繁琐的操作步骤，提供了一种高效、便捷、形貌规整、厚度可控的基底制备技术，以促进相关纳米材料制备技术的发展。

(2)配制的聚吡咯溶液浓度适当无毒性，避免了因聚吡咯浓度过高对细胞造成的毒性损伤等问题，加入的二甲基亚砜有机溶剂提高了聚吡咯溶液的反应速率，增加了聚吡咯薄膜基底的亲水性和细胞膜离子透过性，促进神经细胞分化再生，加快神经细胞间的电信号传输，有利于受损神经细胞的修复。

(3)采用的氧化聚合方法和旋涂法，设备简单，使用材料成本低廉、原料易得，用时短，无需采用电化学方法处理，使用的化学药品无刺激性气味，制备的聚吡咯薄膜基底安全无毒，具有良好的导电性和稳定性。

(4)反应条件温和，制备的聚吡咯薄膜基底表面颗粒分布均匀性质稳定，可存储2～3年。

(5)制备的聚吡咯薄膜基底大小和厚度可通过衬底尺寸和旋涂次数进行控制。

(6)制备的聚吡咯薄膜基底电流强弱可通过旋涂次数进行控制。

附图说明

图1为本发明的制备流程图；

图2为本发明的实验装置示意图；

图3为不同旋涂次数条件下制备的聚吡咯薄膜基底表面形貌图；其中(a)为旋涂两次后得到的聚吡咯薄膜基底形貌图，(b)为旋涂四次后得到的聚吡咯薄膜基底形貌图；

图4为不同旋涂次数条件下聚吡咯薄膜基底的导电形貌图；(a)为使用本原原子力显微镜在导电模式下得到的旋涂两次聚吡咯薄膜基底导电形貌图，(b)为旋涂四次聚吡咯薄膜基底导电形貌图；

图5为聚吡咯薄膜基底与盖玻片基底培养细胞图，(a)-(b)为JPK原子力显微镜扫描聚吡咯薄膜基底培养的细胞图像，(c)-(d)为扫描普通盖玻片基底培养的细胞图像。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明进行详细的说明。

实施例1：

如图1所示，本发明采用简单的氧化聚合法和旋涂方法制备了聚吡咯溶液和聚吡咯薄膜基底，包括以下步骤：

(1)减压蒸馏：搭建减压蒸馏装置，连接好进水口与出水口，打开油泵，将吡咯试剂放入蒸馏瓶中，磁力搅拌并60℃恒温加热，蒸馏出的吡咯单体为无色油状液体，通过冷凝管流入收集瓶，待全部的吡咯单体提纯完毕后关闭油泵，收集吡咯单体于干净试管内，封口膜密封放入4℃冰箱存储备用。

(2)聚吡咯合成：称取0.068g过硫酸铵粉末溶于5ml纯水中，配制过硫酸铵水溶液，称取十二烷基苯磺酸钠0.08g放入烧杯中，混合后摇匀直到混合液澄清；将提纯后的吡咯单体取50μl溶于4ml二甲基亚砜溶剂，然后倒入混合液中混合均匀，使用锡纸密封烧杯口并置于通风橱内反应48h合成聚吡咯溶液，反应时间段内温度控制大约在18℃。

(3)旋涂：将尺寸为20×20mm盖玻片放入装有无水乙醇的烧杯中，将装有盖玻片的烧杯使用保鲜膜密封后放入超声机内超声30min；酒精清洗匀胶机三次，将清洗后的盖玻片吹干作为衬底放置在匀胶机吸盘上，将步骤(2)合成的聚吡咯溶液，移液枪每次抽取20μl滴加在盖玻片中心，以2000rmp的转速旋涂30s，使聚吡咯溶液均匀旋涂在盖玻片表面；旋涂两次和四次的聚吡咯薄膜基底用于实验研究。

(4)真空干燥：打开真空干燥箱，将步骤(3)得到的聚吡咯薄膜基底放入，设定温度为80℃，打开油泵抽真空，真空抽取完成、温度达到预定值后关闭油泵和真空阀，烘干4h后打开放气阀，待真空干燥箱内外压强平稳后将箱体门打开，取出聚吡咯薄膜基底，放入样品盒内备用。使用JPK原子力显微镜对旋涂两次和四次的聚吡咯薄膜基底在接触模式下扫描成像，得到的图像表面颗粒分布均匀，且旋涂两次的聚吡咯薄膜基底,表面颗粒的粒径在0.9-1.2μm,旋涂四次的聚吡咯薄膜基底,表面颗粒的粒径在0.4-0.6μm。存储24个月的聚吡咯薄膜基底稳定性良好，表面颗粒分布均匀且粒径大小不超过1.2um，接触角不大于25°。使用本原原子力显微镜在导电模式下得到旋涂一次的聚吡咯薄膜基底电流大小在1-2nA，接触角在20±2°，旋涂两次的聚吡咯薄膜基底电流大小在2-3nA，接触角在15±2°。

(5)灭菌聚吡咯薄膜基底：将步骤(4)得到的聚吡咯薄膜基底放入高压蒸汽灭菌锅中120℃灭菌30min，放入60℃烘干箱内烘干30min，取出放入细胞培养皿中进行细胞培养。细胞在聚吡咯薄膜基底上培养48h后，采用MTT比色法对神经细胞做毒性实验测试，实验结果显示不同厚度的聚吡咯薄膜基底培养的神经细胞，吸光度值在0.8-1.1左右，细胞存活率在正常值内，聚吡咯薄膜基底有良好的生物相容性，对细胞无损害。存储24个月的聚吡咯薄膜基底高温灭菌后培养神经细胞，细胞生长状态良好且吸光度值仍在正常值范围内。

实施例2：

如图1所示，本发明采用简单的氧化聚合法和旋涂方法制备了聚吡咯溶液和聚吡咯薄膜基底，包括以下步骤：

(1)减压蒸馏：搭建减压蒸馏装置，连接好进水口与出水口，打开油泵，将吡咯试剂放入蒸馏瓶中，磁力搅拌并80℃恒温加热，蒸馏出的吡咯单体为无色油状液体，通过冷凝管流入收集瓶，待全部的吡咯单体提纯完毕后关闭油泵，收集吡咯单体于干净试管内，封口膜密封放入4℃冰箱存储备用。

(2)聚吡咯合成：称取0.034g过硫酸铵粉末溶于4ml纯水中，配制过硫酸铵水溶液，称取十二烷基苯磺酸钠0.05g放入烧杯中，混合后摇匀直到混合液澄清；将提纯后的吡咯单体取40μl溶于3ml二甲基亚砜溶剂，然后倒入混合液中混合均匀，使用锡纸密封烧杯口并置于通风橱内反应48h合成聚吡咯溶液，反应时间段内温度控制大约在18℃。

(3)旋涂：将尺寸为20×20mm盖玻片放入装有无水乙醇的烧杯中，将装有盖玻片的烧杯使用保鲜膜密封后放入超声机内超声30min；酒精清洗匀胶机三次，将清洗后的盖玻片吹干作为衬底放置在匀胶机吸盘上，将步骤(2)合成的聚吡咯溶液，移液枪每次抽取30μl滴加在盖玻片中心，以1500rmp的转速旋涂30s，使聚吡咯溶液均匀旋涂在盖玻片表面；旋涂两次和四次的聚吡咯薄膜基底用于实验研究。

(4)真空干燥：打开真空干燥箱，将步骤(3)得到的聚吡咯薄膜基底放入，设定温度为90℃，打开油泵抽真空，真空抽取完成、温度达到预定值后关闭油泵和真空阀，烘干6h后打开放气阀，待真空干燥箱内外压强平稳后将箱体门打开，取出聚吡咯薄膜基底，放入样品盒内备用。使用JPK原子力显微镜对旋涂两次和四次的聚吡咯薄膜基底在接触模式下扫描成像，得到的图像表面颗粒分布均匀，且旋涂两次的聚吡咯薄膜基底,表面颗粒的粒径在0.9-1.1μm,旋涂四次的聚吡咯薄膜基底,表面颗粒的粒径在0.4-0.5μm。存储24个月的聚吡咯薄膜基底稳定性良好，表面颗粒分布均匀且粒径大小不超过1.2um，接触角不大于25°。使用本原原子力显微镜在导电模式下得到旋涂一次的聚吡咯薄膜基底电流大小在1-2nA，接触角在20±2°，旋涂两次的聚吡咯薄膜基底电流大小在2-3nA，接触角在15±2°。

(5)灭菌聚吡咯薄膜基底：将步骤(4)得到的聚吡咯薄膜基底放入高压蒸汽灭菌锅中100℃灭菌40min，放入80℃烘干箱内烘干30min，取出放入细胞培养皿中进行细胞培养。细胞在聚吡咯薄膜基底上培养48h后，采用MTT比色法对神经细胞做毒性实验测试，实验结果显示不同厚度的聚吡咯薄膜基底培养的神经细胞，吸光度值在0.8-1.1左右，细胞存活率在正常值内，聚吡咯薄膜基底有良好的生物相容性，对细胞无损害。存储24个月的聚吡咯薄膜基底高温灭菌后培养神经细胞，细胞生长状态良好且吸光度值仍在正常值范围内。

实施例3：

如图1所示，本发明采用简单的氧化聚合法和旋涂方法制备了聚吡咯溶液和聚吡咯薄膜基底，包括以下步骤：

(1)减压蒸馏：搭建减压蒸馏装置，连接好进水口与出水口，打开油泵，将吡咯试剂放入蒸馏瓶中，磁力搅拌并80℃恒温加热，蒸馏出的吡咯单体为无色油状液体，通过冷凝管流入收集瓶，待全部的吡咯单体提纯完毕后关闭油泵，收集吡咯单体于干净试管内，封口膜密封放入4℃冰箱存储备用。

(2)聚吡咯合成：称取0.136g过硫酸铵粉末溶于10ml纯水中，配制过硫酸铵水溶液，称取十二烷基苯磺酸钠0.10g放入烧杯中，混合后摇匀直到混合液澄清；将提纯后的吡咯单体取50μl溶于6ml二甲基亚砜溶剂，然后倒入混合液中混合均匀，使用锡纸密封烧杯口并置于通风橱内反应36h合成聚吡咯溶液，反应时间段内温度控制大约在18℃。

(3)旋涂：将尺寸为20×20mm盖玻片放入装有无水乙醇的烧杯中，将装有盖玻片的烧杯使用保鲜膜密封后放入超声机内超声30min；酒精清洗匀胶机三次，将清洗后的盖玻片吹干作为衬底放置在匀胶机吸盘上，将步骤(2)合成的聚吡咯溶液，移液枪每次抽取30μl滴加在盖玻片中心，以2500rmp的转速旋涂20s，使聚吡咯溶液均匀旋涂在盖玻片表面；旋涂两次和四次的聚吡咯薄膜基底用于实验研究。

(4)真空干燥：打开真空干燥箱，将步骤(3)得到的聚吡咯薄膜基底放入，设定温度为90℃，打开油泵抽真空，真空抽取完成、温度达到预定值后关闭油泵和真空阀，烘干6h后打开放气阀，待真空干燥箱内外压强平稳后将箱体门打开，取出聚吡咯薄膜基底，放入样品盒内备用。使用JPK原子力显微镜对旋涂两次和四次的聚吡咯薄膜基底在接触模式下扫描成像，得到的图像表面颗粒分布均匀，且旋涂两次的聚吡咯薄膜基底,表面颗粒的粒径在0.8-1.1μm,旋涂四次的聚吡咯薄膜基底,表面颗粒的粒径在0.5-0.6μm。存储24个月的聚吡咯薄膜基底稳定性良好，表面颗粒分布均匀且粒径大小不超过1.2um，接触角不大于25°。使用本原原子力显微镜在导电模式下得到旋涂一次的聚吡咯薄膜基底电流大小在1-2nA，接触角在20±2°，旋涂两次的聚吡咯薄膜基底电流大小在2-3nA，接触角在15±2°。

(5)灭菌聚吡咯薄膜基底：将步骤(4)得到的聚吡咯薄膜基底放入高压蒸汽灭菌锅中120℃灭菌40min，放入80℃烘干箱内烘干30min，取出放入细胞培养皿中进行细胞培养。细胞在聚吡咯薄膜基底上培养48h后，采用MTT比色法对神经细胞做毒性实验测试，实验结果显示不同厚度的聚吡咯薄膜基底培养的神经细胞，吸光度值在0.8-1.1左右，细胞存活率在正常值内，聚吡咯薄膜基底有良好的生物相容性，对细胞无损害。存储24个月的聚吡咯薄膜基底高温灭菌后培养神经细胞，细胞生长状态良好且吸光度值仍在正常值范围内。

如图2所示，为本发明的实验装置示意图，数字1-8为各反应中涉及到的具体步骤，其中数字1-5标注部分为减压蒸馏装置示意图，主要由蒸馏瓶、磁力搅拌器、冷凝管、收集瓶等组成，为使系统密闭性好，磨口仪器的所有接口部分都必须用真空油脂润涂好，瓶口夹和固定夹同时使用按照图中的顺序固定好蒸馏瓶和收集瓶，检查仪器安装完整不漏气后，加入待提纯的吡咯试剂1，关好蒸馏瓶上的活塞，开动油泵，当压力稳定后，开始加热至80℃，冷凝管3的作用为降低蒸馏过程中的温度，进水口4和出水口2应该和橡胶管连接紧密。待全部的吡咯单体提纯完毕后，关闭磁力搅拌器，蒸馏瓶冷却后再慢慢开启收集瓶上的活塞,平衡内外压力后关闭油泵，取出收集瓶内提纯后的吡咯单体5密封放入试管内。6代表提纯吡咯单体后采用氧化聚合反应合成的聚吡咯溶液，7为以超声清洗后的盖玻片作为衬底，放于匀胶机吸盘上，旋涂法制备聚吡咯薄膜基底的过程，8表示高温消毒后的聚吡咯薄膜基底放入培养皿内用于细胞培养的过程。

如图3所示，在不同旋涂次数条件下，使用JPK原子力显微镜扫描聚吡咯薄膜基底的形貌图，旋涂过程中每次旋涂吸取的聚吡咯溶液体积为30μl，旋涂时间为30s。(a)为旋涂两次后得到的聚吡咯薄膜基底形貌图，(b)为旋涂四次后得到的聚吡咯薄膜基底形貌图。随着旋涂次数的增加，聚吡咯颗粒的粒径减小，分布密度增加，均一性增强。

如图4中(a)-(b)为使用本原原子力显微镜在导电模式下得到的旋涂两次和旋涂四次聚吡咯薄膜基底导电形貌图。导电原子力显微镜是在纳米尺度上分析样品电学特性的重要检测技术。在接触模式下，采用导电探针，并在样品和探针之间加一个偏压，在成像的同时检测探针和样品之间的电流，在导电原子力显微镜模式下，通过进行扫描，图4(a)-(b)颗粒处为针尖与聚吡咯薄膜基底上测得的电流信号，随着旋涂次数的增加，聚吡咯薄膜基底电流强度逐渐增大，电流值的范围在1-5nA。

如图5中(a)-(d)为使用JPK原子力显微镜扫描神经细胞图像。(a)-(b)图为JPK原子力显微镜扫描聚吡咯薄膜基底培养的神经细胞图像，(c)-(d)图为扫描普通盖玻片基底培养的神经细胞图像。聚吡咯薄膜基底培养的神经细胞不仅生长状态良好，而且表面突起丰富，突触生长更快。

总之，本发明利用二甲基亚砜作为有机溶剂，不仅提高了聚吡咯溶液的反应速率还增加了聚吡咯薄膜基底的亲水性和细胞膜离子通透性，避免了聚吡咯颗粒胶束粒子间相互碰撞融合生成团聚颗粒。旋涂法制备聚吡咯薄膜基底，无需采用电化学方法处理，使用的化学药品无刺激性气味，制备的聚吡咯薄膜基底安全无毒，具有良好的导电性和稳定性。聚吡咯薄膜基底与细胞间的相互作用促进了神经细胞分化与再生，有利于细胞间电信号传递和受损神经细胞的修复。

Claims (9)

1.一种用于细胞培养的聚吡咯薄膜基底制备方法，其特征在于：二甲基亚砜做为有机溶剂与吡咯单体混合均匀后加入催化剂、氧化剂反应得到聚吡咯溶液，旋涂法制备聚吡咯薄膜基底、烘干灭菌后用于细胞培养，其制备方法包括以下步骤：

(1)减压蒸馏：搭建减压蒸馏装置，将吡咯试剂放入蒸馏瓶中，磁力搅拌在60-80℃中恒温加热，蒸馏出的吡咯单体通过冷凝管流入收集瓶，待全部的吡咯单体提纯完毕后，取出放入试管内备用；

(2)聚吡咯合成：以过硫酸铵或三氯化铁为氧化剂，在烧杯中配制4-10ml过硫酸铵水溶液，称取十二烷基苯磺酸钠0.05g-0.10g放入过硫酸铵水溶液/三氯化铁水溶液中，超声溶解得到澄清混合液，取40-50μl吡咯单体溶于3-6ml二甲基亚砜有机溶剂，摇匀倒入混合液中，密封并置于干燥避光处反应，合成聚吡咯溶液；

(3)旋涂：盖玻片超声清洗后作为衬底，放置在匀胶机吸盘上，将步骤(2)合成的聚吡咯溶液，每次抽取20-30μl滴加在盖玻片上，以1500-2500rmp转速涂旋20-30s，使聚吡咯溶液中含有的聚吡咯颗粒被均匀旋涂在盖玻片表面，旋涂后的聚吡咯颗粒在盖玻片上具有良好的附着性，且分散均匀；

(4)真空干燥：将步骤(3)得到的聚吡咯基底放入真空干燥箱内干燥，得到聚吡咯薄膜基底；

(5)灭菌聚吡咯薄膜基底：将步骤(4)得到的聚吡咯薄膜基底放入100-120℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌20-40min，灭菌完成后放入60-80℃烘干箱内烘干30min，烘干后的聚吡咯薄膜基底放入培养皿中进行细胞培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，减压蒸馏过程结束后，提纯后的吡咯单体始终处于密封状态，置于4℃冰箱内存放备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，过硫酸铵/三氯化铁和十二烷基苯磺酸钠的摩尔比为1:2-1.5:2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，加入吡咯单体的体积为40-50μl，二甲基亚砜有机溶剂的体积为3-6ml，所述步骤(5)中得到的聚吡咯薄膜基底有良好的亲水性和稳定性，接触角范围在10°-25°，存储时间不小于24个月。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，合成聚吡咯溶液的反应时间在36-48h，反应温度为15-20℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，聚吡咯薄膜的厚度范围在20-30nm，聚吡咯薄膜基底接触角范围在10°-25°，聚吡咯薄膜基底的厚度和接触角与旋涂转速和旋涂时间线性相关。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，真空干燥时，温度设定为60-90℃，干燥时间为4-6h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中，原子力显微镜在导电模式下得到聚吡咯薄膜基底电流范围在1-5nA，聚吡咯薄膜基底的电流强弱与旋涂厚度线性相关。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中，使用原子力显微镜对聚吡咯薄膜基底在接触模式下扫描成像，得到的图像表面颗粒分布均匀，颗粒的粒径范围在0.4-1.2μm，聚吡咯颗粒的粒径大小与旋涂次数线性相关。

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