CN109153710A - 改善的TGF-β超家族蛋白的纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了纯化TGF‑β超家族蛋白，包括成骨蛋白，如骨形态发生蛋白(BMP)的方法。

Description

改善的TGF-β超家族蛋白的纯化
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年10月23日提交的第62/245,727号美国临时申请的权益，其通过引用在此整体并入。
领域
本发明总体上涉及用于转化生长因子-β(TGF-β)超家族蛋白的蛋白纯化方法。具体地，本发明涉及这样的蛋白，包括骨形态发生蛋白(BMP)的纯化方法。
背景
转化生长因子β(TGF-β)超家族蛋白是调节各种细胞功能，包括细胞增殖、迁移、分化和凋亡的多功能蛋白的大家族。骨形态发生蛋白(BMP)包括TGF-β超家族成员内的子家族，其充当调节特别是骨、软骨和结缔组织生长的信号转导配体。使用含有相应DNA的表达载体转化的细胞可在细胞培养物(例如酵母、大肠杆菌和哺乳动物细胞)中产生高水平的重组BMP。必须从宿主细胞培养基分离和纯化由宿主细胞分泌的BMP。通常，培养基包含营养物(例如维生素、氨基酸、辅因子、矿物质等)、生长因子/补充物、各种其他宿主细胞物质(例如核酸、膜组分等)和另外的不需要的宿主细胞蛋白。细胞培养基还可以含有各种不希望的BMP基因产物，包括缺乏翻译后修饰的产物形式和非常类似于全长目标产物的蛋白水解降解形式的BMP。
一般而言，由于BMP在常规缓冲系统中的不溶性以及其在生理pH下聚集和沉淀的趋势，因此BMP难以纯化(Ruppert等人,1996Eur.J.Biochem.1996,237(1):295-302)。实际上，Steckert等人(Therapeutic Proteins,Methods in Molecular Biology,Volume 308,2005,pp 301-318)已经证明rhBMP-2将作为pH和盐的函数可逆地自缔合。BMP纯化通常依赖于使用离液剂和其他强蛋白变性剂，如去污剂和水溶性有机物，以在纯化过程期间保持蛋白溶解性。
历史上，肝素和肝素样亲和树脂已被用于捕获和纯化BMP。例如，含有10个碱性残基的BMP-2的N-末端序列是已知的肝素结合位点(Ruppert等人，1996)。肝素和BMP之间的非共价可逆相互作用在对生长因子结构和功能的影响最小的情况下确保结合发生。传统的肝素树脂由于其不能用高浓度的NaOH，即标准消毒方法处理，和与肝素配体浸出的可能性有关的安全问题而受到限制。肝素树脂的替代物包括Cellufine Sulfate(JNCCorporation)，即一种在纤维素骨架上用硫酸酯官能化的树脂，它在某些情况下充当肝素类似物，用于纯化肝素结合蛋白。由于Cellufine Sulfate的低(3kDa)排阻限制，大分子仅吸附到珠的外部，导致因存在于珠内部的配体不可用而容量有限。
常规疏水相互作用色谱(HIC)基于蛋白通过蛋白表面上的疏水区域与化学连接到树脂的疏水基团(例如苯基、辛基或丁基)之间的非共价相互作用的吸附分离分子。在典型的HIC过程中，将蛋白溶液施加到高盐缓冲液的介质，其降低溶剂化并暴露蛋白分子上的疏水区域以促进与介质上的疏水配体的相互作用。分子越疏水，促进结合所需的盐越少，并且通常通过降低盐浓度从介质洗脱蛋白。最常见的，将降低盐浓度的梯度施用到HIC介质以按照疏水性增加的顺序从介质洗脱样品。样品洗脱也可以通过向洗脱缓冲液添加水溶性有机改性剂或去污剂来辅助。
概述
一方面，本发明涉及从流体(例如，细胞培养物上清液、体液或包含这样的蛋白的任何其他流体)纯化TGF-β蛋白家族的蛋白(多种蛋白)，包括例如骨形态发生蛋白(BMP)的方法，所述方法包括以下步骤：使包含BMP的流体在BMP可溶于流体内的条件下与疏水性相互作用色谱介质接触，其中所述流体包含至少一种浓度高于预定阈值的盐，从而促进BMP与所述疏水性相互作用色谱介质的缔合；使所述疏水性相互作用色谱介质与包含提高BMP的溶解度的第一试剂的第一流动相接触，所述第一流动相具有与初始流体的盐浓度相似的盐浓度；使所述疏水性相互作用色谱介质与缺乏提高BMP的溶解度的第一试剂的第二流动相接触，从而增加BMP与所述色谱介质之间的缔合；使疏水性相互作用色谱介质与具有相对于所述流体、所述第一流动相和所述第二流动相中的一种或多种不相似的盐浓度的第三流动相接触，从而降低第二非-BMP与疏水性相互作用色谱介质的缔合；和通过使疏水性相互作用色谱介质与包含不同于所述第一试剂的第二试剂的洗脱流动相接触，从疏水性相互作用色谱介质洗脱BMP，所述第二试剂提高BMP的溶解度并破坏与疏水性相互作用色谱介质的缔合。第二试剂的浓度可以随时间变化。供选择地，第二试剂的浓度可以随时间恒定。疏水性相互作用色谱介质可以不用肽亲和配体官能化。提高BMP的溶解度的第一试剂可以是尿素。尿素可以以5-8M的浓度存在于第一流动相中。第一流动相可以包含50mM甘氨酸和2M氯化钠。尿素可以以至少3M的浓度存在于流体中。流体可以包含至少1M氯化钠。提高BMP的溶解度的第二试剂可以是己二醇。流体可以包含来自离子交换色谱介质的洗脱液。产物BMP的产率可以为至少60％。BMP的纯度可以为至少90％。
另一方面，本发明涉及从样品纯化TGF-β蛋白家族的蛋白(多种蛋白)，包括例如骨形态发生蛋白(BMP)的方法，所述方法包括以下步骤：在使得至少一部分BMP结合于类亲和色谱介质的条件下用包含BMP的溶液负载类亲和色谱介质；从类亲和色谱介质洗脱至少一部分BMP；在使得至少一部分BMP结合于疏水性相互作用色谱介质的条件下用来自类亲和色谱介质的含BMP的洗脱液负载疏水性相互作用色谱介质；从疏水性相互作用色谱介质洗脱至少一部分BMP；在使得至少一部分BMP结合于阳离子交换介质的条件下，用来自疏水性相互作用色谱介质的含BMP的洗脱液负载阳离子交换介质；从阳离子交换介质洗脱至少一部分BMP；和在适合的缓冲液中浓缩BMP。
另一方面，本发明涉及从流体纯化TGF-β蛋白家族的蛋白(多种蛋白)，包括例如骨形态发生蛋白(BMP)的方法，所述方法包括以下步骤：将包含BMP的流体负载到疏水性相互作用介质上，其中所述流体包括尿素和第一浓度的第一盐，并且其中所述BMP在呈流体的溶液中；用第一溶液洗涤疏水性相互作用介质，其中第一溶液中的盐的浓度低于第一浓度，所述第一溶液不包含尿素，并且所述BMP在第一溶液中比在流体中更不可溶；和用不包含第一盐或尿素的第二溶液洗脱BMP。尿素可以以至少3M的浓度存在于流体中。流体可以包含至少1M氯化钠。第二溶液可以提高BMP的溶解度。第二溶液可以包含己二醇。
另一方面，本发明涉及从流体第一溶液纯化TGF-β蛋白家族的蛋白(多种蛋白)，包括例如骨形态发生蛋白(BMP)的方法，所述方法包括以下步骤：使疏水性相互作用色谱介质与第一溶液接触，其中所述第一溶液的特征在于其中的BMP的第一溶解度；使疏水性相互作用色谱介质与第二溶液接触，所述第二溶液的特征在于BMP的第二溶解度低于所述第一溶解度；和使疏水性相互作用色谱介质与第三溶液接触，所述第三溶液的特征在于BMP的第三溶解度高于所述第二溶解度。
附图简述
通过附图说明了本发明的某些实施方案。将理解的是，附图不一定按比例绘制，并且可以省略对于理解本发明而言不必要的或使得其他细节难以察觉的细节。将理解的是，本发明不一定限于本文说明的具体实施方案。
图1提供了根据本发明的一个实施方案的BMP纯化过程的概述。
图2描绘了根据本发明的一个实施方案的来自类亲和色谱纯化的色谱图。
图3描绘了根据本发明的另一个实施方案的疏水性相互作用色谱纯化的色谱图。
图4描绘了根据本发明的又一个实施方案的阳离子交换色谱纯化的色谱图。
优选实施方案的详述
BMP的表达可通过将合适的基因插入表达载体，用表达载体转化合适的哺乳动物细胞并选择表达BMP的细胞来实现。各种哺乳动物细胞系可用于表达BMP，如CHO(中国仓鼠卵巢)、COS、BHK、Balb/c 3T3、293和本领域已知的类似细胞系。这些细胞可以在本领域已知的任何合适的培养基中生长。
以下实例描述了从细胞培养基分离和纯化设计的BMP，如美国专利8,952,131中所述的，该专利通过引用整体并入。然而，将理解的是，本发明可以以类似的结果用于TGF-β蛋白家族的其他蛋白成员，特别是骨形态发生蛋白，包括BMP-1至BMP-15，及其重组体、同二聚体、异二聚体、突变体和/或嵌合形式。以下概述的步骤仅用于说明的目的，并不意在限制本发明的范围。
图1提供了本发明的纯化过程的概述。尽管优选实施方案包括所述步骤的顺序，但应该理解的是，许多变化和修改都在本发明的范围内。例如，如果需要，可以重新配置步骤的顺序，并且可以省略步骤。
收获步骤
从合适的细胞表达系统分泌后，带正电的BMP蛋白倾向于与宿主细胞的带负电的外表面紧密结合。可以将硫酸葡聚糖添加到培养基以破坏该结合，而不破坏BMP和/或干扰宿主细胞，使得另外的不需要的细胞组分释放到培养质中。然后通过深度过滤或供选择的离心，在用5％v/v 1.1M 4-吗啉乙烷磺酸(2-[N-吗啉代]乙磺酸)(MES)将pH调节至pH 6.7后，将培养基与培养的细胞分离。
类亲和捕获(步骤-1)
在第一纯化步骤中，将培养基负载到“类亲和”基质上以除去硫酸葡聚糖，清除宿主细胞蛋白和其它不想要的残留产物并浓缩BMP。如通过引用将其在此整体并入的第20030036629号美国专利申请中所述的，Matrex Sulfate(JNC Corporation)可用作用于从条件化细胞培养基初始纯化BMP，如重组人BMP-2(rhBMP-2)的类亲和介质。Cellufine Sulfate包括由用硫酸葡聚糖官能化的球形纤维素珠构成的树脂，其同时充当离子交换介质和肝素类似物，所述肝素类似物可以结合包括BMP的靶蛋白中的肝素结合位点。这样的多功能介质(在下文中称为“类亲和”或“伪亲和”)还可以在适宜的pH值(包括但不限于pH 6.7)下与存在于培养基内的硫酸葡聚糖竞争结合BMP。适当洗涤后，可以使用添加到50mM TRIS加0.5M NaCl的0.5M L-精氨酸洗脱结合的BMP。
尽管Cellufine Sulfate可用于从条件化细胞培养基有效地捕获BMP，但它需要储存在高度易燃的乙醇中，不能用浓度高于0.1M的NaOH灭菌，并且具有相对低的压力容限。本发明的类亲和捕获步骤优选使用耐用的CaptoTM DeVirS树脂(GE Healthcare，Marlborough，MA)或具有类亲和官能性的类似介质。CaptoTM DeVirS包括与高度交联的琼脂糖基础基质连接的硫酸葡聚糖，提供相对于肝素或Cellufine树脂的明显优势，包括碱稳定性提高、不需要乙醇储存、更高的流速(600cm/hr相比150cm/hr)和更高容量(6mg/ml相比0.4mg/ml)。
参考图2，在示例性类亲和纯化步骤中，来自收获步骤的滴定介质可以以≤10cm/min的线性流动速率负载到平衡介质上。然后将介质洗涤三次。第一次洗涤可以包括一体积的50mM(MES)，pH 5.6；第二次洗涤可以包括一体积的50mM MES、6M尿素，pH 5.6；并且第三次洗涤可以包括一体积的50mM MES、6M尿素、0.5M NaCl，pH 5.6。然后可以使用50mM MES、6M尿素、1M NaCl，pH 5.6进行介质的等度洗脱。然后将洗脱液酸化至3％v/v乙酸。令人惊讶的是，洗脱步骤后的BMP产率为88.4％，通过反相色谱证实纯度为60-75％。
疏水相互作用色谱(步骤-2)
疏水相互作用色谱(HIC)基于蛋白与结合到色谱基质的疏水性配体之间的可逆相互作用。大多数蛋白和较小程度的亲水性分子(例如DNA和碳水化合物)在其表面上或表面附近包括疏水区域。在存在高盐浓度和/或高离子强度缓冲液的情况下，蛋白的疏水区域与固体支持物上的相应疏水区域之间的相互作用得到增强。与大多数涉及逐渐增加盐浓度的洗脱程序不同，从HIC介质洗脱涉及降低盐浓度，使得疏水相互作用逆转并且蛋白从介质解吸附。因此，HIC是从类亲和介质高盐等度洗脱后很好的纯化步骤。
虽然可以使用常规HIC纯化方法进行纯化，但是BMP家族成员的异常溶解度性质以及其可逆地聚集和沉淀的倾向提供了以“混合模式”进行HIC纯化的机会，该混合模式利用多种相互作用以实现分离。与常规方案不同，本发明的HIC步骤除了由BMP分子自身的固有溶解度性质驱动的次级相互作用之外，还同时利用BMP分子和HIC树脂之间的常规相互作用。尽管不希望受任何理论的束缚，但相信通过利用提高或抑制溶解度的试剂，可以以提高HIC纯化过程的有效性的方式，在BMP分子结合到HIC介质的同时操纵BMP分子的溶解度性质。第7,754,689号美国专利(“’689专利”，其在此通过引用整体并入)描述了一种纯化方法，其使用由共价固定在色谱介质上的BMP或BMP衍生肽组成的特种树脂，利用BMP的自缔合性质。如本文所述，这些BMP衍生的特种树脂不是必需的，并且可以使用标准的市售HIC树脂来应用类似的原理。与‘689专利另外的区别在于本发明的HIC步骤将BMP与可溶状态的树脂结合，而‘689专利要求BMP在促进聚集和沉淀的条件下被负载，这可导致回收率差。为了实现结合，将BMP负载到含有高浓度盐(例如1-2M NaCl)和提高BMP溶解度的试剂(例如6-8M尿素)的溶液中。第一次洗涤包含相同浓度的盐和增溶剂，以冲洗残余负载溶液并洗掉任何未结合的污染物。初始洗涤后，通过第二次洗涤去除增溶剂以将BMP转变成不溶相，以使BMP在不存在盐的情况下保持与介质结合。为了实现此目的，第二次洗涤包含相同浓度的盐，但是增溶剂减少或完全消除。随后用不含盐的溶液洗涤介质以从介质释放游离可溶的非BMP污染物。然后使用使聚集的BMP返回到可溶相的溶液(例如20-50％己二醇)从介质洗脱结合的BMP。
参考图3，在示例性HIC纯化步骤中，来自类亲和捕获步骤的酸化洗脱液可用3MNaCl、6M尿素以1:1稀释，无菌过滤并负载到苯基6FF(GE Healthcare)HIC介质上。在BMP保持结合的同时，杂质例如宿主细胞蛋白和其他残留污染物(例如宿主细胞蛋白、细胞培养基组分、DNA等)可以从介质洗掉。第一次洗涤可以包括一体积的50mM甘氨酸、2M NaCl、6M尿素，pH 3.0；第二次洗涤可以包括50mM甘氨酸、2M NaCl，pH 3.0；而第三次洗涤可以包括50mM甘氨酸，pH 3.0。然后可以使用50mM甘氨酸、50％己二醇(2-甲基-2,4-戊二醇，MPD)，pH3.0(20柱体积，(CV))进行介质的梯度洗脱。然后在进行阳离子交换精制步骤之前将洗脱液无菌过滤。HIC柱步骤后的BMP产率为60-75％，通过反相色谱确认纯度为93-99％。因此，本发明提供了与常规HIC方案大致相同的BMP产率，但纯度(通过反相色谱测量的)明显高于常规HIC方案。
在另一个实施方案中，可以进行“混合模式”方法的混合形式，其包括与上述相同的初始负载和洗涤步骤，但是使得蛋白洗脱通过根据常规HIC方案操纵盐浓度来进行。简言之，将BMP负载到含有高浓度盐(例如1-2M NaCl)和提高BMP溶解度的试剂(例如6-8M尿素)的溶液中。第一次洗涤包含相同浓度的盐和增溶剂，以冲洗残余负载溶液并洗掉任何未结合的污染物。初始洗涤后，通过第二次洗涤(例如，含有相同浓度的盐，但不含增溶剂)将增溶剂去除以使BMP转变成不溶相，使得BMP在不存在盐的情况下保持结合到介质。随后用不含盐的溶液洗涤介质以从介质释放游离可溶的非BMP污染物。然后，通过恢复初始盐浓度的两次连续的洗涤，随后再次引入增溶剂，使BMP恢复至可溶状态，同时保持与介质结合。然后根据常规HIC方案通过以梯度或逐步方式降低盐浓度从介质洗脱结合的BMP，允许使用者将“混合模式HIC”纯化引入围绕标准HIC方案设计的纯化方法中。
举例来说，在“混合模式”HIC纯化方法的混合形式中，来自类亲和捕获步骤的酸化洗脱液可以用3M NaCl、6M尿素以1:1稀释，无菌过滤并负载到苯基6FF(GE Healthcare)HIC介质。在BMP保持结合的同时，杂质例如宿主细胞蛋白和其他残留污染物(例如宿主细胞蛋白、细胞培养基组分、DNA等)可以从介质洗掉。第一次洗涤可以包括一体积的50mM甘氨酸、2M NaCl、6M尿素，pH 3.0；第二次洗涤可以包括50mM甘氨酸、2M NaCl，pH 3.0；第三次洗涤可以包括50mM甘氨酸，pH 3.0；第四次洗涤可以类似于第二次洗涤并且包括50mM甘氨酸、2MNaCl，pH 3.0；第五次洗涤可以类似于第一次洗涤并且包括50mM甘氨酸、2M NaCl、6M尿素，pH 3.0。通过以梯度或逐步方式将介质转变成50mM甘氨酸、6M尿素，pH 3.0，可以实现洗脱。
应该理解，除NaCl之外的各种盐可以通过促进疏水性相互作用而与HIC树脂相容。可用于增强BMP的疏水部分对于HIC树脂的可用性的盐的非限制性实例可包括Na2SO4、K2SO4、(NH4)2SO4、Na2HPO4、KCl、LiCL、KSCN和CH3COONH4。还应该理解，除了己二醇(MPD)之外的各种增溶剂可用于从疏水性相互作用介质洗脱BMP。合适的增溶剂的非限制性实例可包括离液剂(例如尿素、精氨酸、胍-HCl)、去污剂(例如CHAPS、Triton-X100、聚山梨醇酯-80等)和水溶性有机溶剂(例如MPD、乙腈、醇、二醇等)。
如本领域技术人员将理解的，上述任何一种盐可以引入到目前公开的HIC步骤中的条件可以凭经验确定而无需过度实验。例如，Hofmeister系列基于它们“盐析”(即降低溶解度；沉淀)或“盐溶”(即增加溶解度；溶解)蛋白的能力提供了离子分类。Hofmeister系列的第一盐增强了疏水性相互作用并增加了溶剂的表面张力，使得非极性分子“盐析”。后来的Hofmeister系列盐减弱了疏水性相互作用并提高了溶解度，使得非极性分子“盐溶”。对于给定的HIC树脂和/或靶蛋白可能有效的盐(多种盐)可以首先参考Hofmeister系列进行确定。然后可以在HIC树脂上滴定所选择的盐(多种盐)以更准确地描绘靶蛋白的结合、洗涤和洗脱动力学。例如，2M NaCl已被确定为用于BMP的HIC纯化的有益盐浓度。
在一个实施方案中，第一步可包括测试Hofmeister系列中的盐在促进结合并确定BMP完全结合到HIC介质的那些盐的浓度(例如摩尔浓度或克/升)方面的有效性。类似地，第二步可以包括确定BMP不结合到HIC介质时Hofmeister系列盐的浓度。然后第三步可以包括选择特定的Hofmeister系列盐，并通过用连续的等份的缓冲液冲洗负载BMP的HIC介质来确定BMP开始洗脱时特定盐的浓度，每一等份具有比先前的等份逐渐降低的盐浓度。从已知BMP结合到HIC介质时的盐浓度(即2.0M NaCl)开始，并以0.1M增量递增地接近已知BMP不结合HIC介质时的盐浓度(即1.0M NaCl)，将确定BMP从HIC介质洗脱时的盐浓度(例如，BMP在约1.4-1.5M NaCl下洗脱)。供选择地，可以使用递减的盐梯度，从已知BMP结合HIC介质时的盐浓度开始，并将浓度降至低于已知BMP不结合HIC介质时的盐浓度。
阳离子交换精制(步骤-3)
在上述苯基6FF HIC过程之后，优选使用阳离子交换色谱介质来除去MPD或其他增溶剂，进一步清除洗脱液的DNA、宿主细胞蛋白质、内毒素和其他非蛋白污染物，并浓缩BMP。参考图4，在示例性阳离子交换精制步骤中，来自苯基6FF HIC介质的洗脱液可以被负载到CaptoTM S Impact(GE Life Sciences，Marlborough，MA)阳离子交换色谱介质上，然后洗涤以去除杂质。第一次洗涤可以包括一体积的50mM甘氨酸，pH 3.0；第二次洗涤可以包括50mM甘氨酸、6M尿素，pH 3.0；而第三次洗涤可以包括50mM Tris、6M尿素、0.15M NaCl，pH 7.0。然后可以使用50mM Tris、6M尿素、0.4M NaCl，pH 7.0(20CV)进行介质的梯度洗脱。第三柱步骤后的BMP产率为70-99％，通过反相色谱确认纯度为93-99％。
超滤/渗滤
本发明的纯化方法中的另外的步骤可以包括超滤/渗滤(UF/DF)步骤，其中切向流动过滤系统用于缓冲液交换和BMP的浓缩。包含特定分子量截留的过滤膜装置可用于保留大分子量蛋白(例如BMP)，同时去除较低分子量的组分。通过以与渗透溶液流出滤膜相同的速率连续向渗余物添加新的缓冲液，原始缓冲液组分逐渐被稀释掉。例如，来自阳离子交换步骤的洗脱液可以负载到10kDa 超滤膜(Sartorius，AG)上并用5-7渗滤体积的50mM甘氨酸、6M尿素，pH3.0渗滤，直到已经实现将>99％的缓冲液交换为50mM甘氨酸、6M尿素，pH 3.0。其随后可以接着使用与第一次缓冲液交换类似的程序，进一步将缓冲液交换为50mM乙酸。一旦初始缓冲液交换阶段完成，BMP通常浓缩约5倍以实现4-6mg/mL BMP的浓度。一旦蛋白质被浓缩，进行第二次缓冲液交换以将BMP置于其最终制剂缓冲液(例如25mM谷氨酸、2％甘氨酸、1％蔗糖，pH4.0)中。这是通过用另外7-9个渗滤体积的制剂缓冲液进行渗滤来实现的，然后将渗余物排出并通过用0.5-1滞留体积的制剂缓冲液冲洗系统来回收残余蛋白质。令人惊讶的是，UF/DF步骤后的BMP产率为90-98％。
在一个实施方案中，UF/DF步骤可以任选地在病毒过滤步骤之前。例如，来自阳离子交换步骤的洗脱液可以负载到Pro Solution(EMD Millipore)病毒过滤装置上，用药用水(WPU)漂洗，用3％v/v乙酸缓冲液平衡，并在恒定流动下过滤。病毒过滤步骤后的BMP产率为95-100％，通过反相色谱验证纯度为92-99％。
在UF/DF步骤之后，浓缩的BMP可以在恒定流动下使用例如SartoporePES过滤器单元经历最终过滤步骤。该最终过滤步骤后的BMP产率为95-100％。
虽然本发明的实施方案和示例性数据具体提及了用于纯化BMP的方法，但应理解的是，本发明可以以相等或相似的结果应用于显示相似溶解度和/或自聚集特征的TGF-β超家族的其他成员。可使用本文公开的方法进行纯化的BMP的实例包括但决不限于BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12、BMP-13及其重组体、同二聚体、异二聚体、突变体和/或嵌合形式。
如本文所使用的短语“和/或”应该理解为意指如此结合的要素中的“任一个或两个”，即在一些情况下结合存在且在其它情况下分离存在的要素。除非明确地相反指示，否则除了由“和/或”从句特别注明的要素之外，其他要素可以任选地存在，无论与那些特别注明的要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当与诸如“包括”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的提及在一个实施方案中可以指代A而无B(任选地包括除了B以外的要素)；在另一个实施方案中，指代B而无A(任选地包括除了A以外的要素)；在又一个实施方案中，指代A和B二者(任选地包括其他要素)；等等。
术语“基本上由……组成”是指排除有助于功能的其他材料，除非在本文另有定义。尽管如此，这些其他材料可能以痕量共同或单独存在。
如本说明书中所使用的，术语“基本上”或“大约”是指加或减10％(例如按重量计或按体积计)，并且在一些实施方案中，加或减5％。在整个说明书中对“一个实例”、“实例”、“一个实施方案”或“实施方案”的提及意味着结合该实例描述的具体特征、结构或特性被包括在本技术的至少一个实例中。因此，贯穿本说明书在各个地方出现的短语“在一个实例中”、“在实例中”、“一个实施方案”或“实施方案”不一定都指代相同的实例。此外，具体特征、结构、程序、步骤或特性可以以任何合适的方式组合在本技术的一个或多个实例中。本文提供的标题仅仅是为了方便，并不意在限制或解释所要求保护的技术的范围或含义。
以上已经描述了本发明的某些实施方案。然而，明确指出的是，本发明不限于那些实施方案，而是意在将对本文明确描述的内容的添加和修改也包括在本发明的范围内。此外，应该理解，本文描述的各种实施方案的特征不是相互排斥的，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以以各种组合和排列的形式存在，即使这些组合或排列没有在本文明确作出表述。事实上，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员将想到本文描述的内容的变型、修改和其他实施方式。因此，本发明不仅仅由前面的说明性描述来限定。

Claims (20)

1.一种从流体纯化骨形态发生蛋白(BMP)的方法，所述方法包括以下步骤：
使包含BMP的流体在BMP可溶于流体内的条件下与疏水性相互作用色谱介质接触，其中所述流体包含至少一种浓度高于预定阈值的盐，从而促进BMP与疏水性相互作用色谱介质的缔合；
使疏水性相互作用色谱介质与包含提高BMP的溶解度的第一试剂的第一流动相接触，所述第一流动相具有与初始流体的盐浓度相似的盐浓度；
使疏水性相互作用色谱介质与缺乏提高BMP的溶解度的第一试剂的第二流动相接触，从而增加BMP与色谱介质之间的缔合；
使疏水性相互作用色谱介质与具有相对于所述流体、第一流动相和第二流动相中的一种或多种不相似的盐浓度的第三流动相接触，从而降低第二非-BMP与疏水性相互作用色谱介质的缔合；和
通过使疏水性相互作用色谱介质与包含不同于第一试剂的第二试剂的洗脱流动相接触，从疏水性相互作用色谱介质洗脱BMP，所述第二试剂提高BMP的溶解度并破坏与疏水性相互作用色谱介质的缔合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二试剂的浓度随时间变化。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二试剂的浓度随时间恒定。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水性相互作用色谱介质未用肽亲和配体官能化。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述提高BMP的溶解度的第一试剂是尿素。
6.根据权利要求5所述的方法，其中尿素以5-8M的浓度存在于第一流动相中。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一流动相包含50mM甘氨酸和2M氯化钠。
8.根据权利要求5所述的方法，其中尿素以至少3M的浓度存在于流体中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述流体包含至少1M氯化钠。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述提高BMP的溶解度的第二试剂是己二醇。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述流体包含来自离子交换色谱介质的洗脱液。
12.根据权利要求1所述的方法，其中产物BMP的产率为至少60％。
13.根据权利要求1所述的方法，其中BMP的纯度为至少90％。
14.一种从样品纯化骨形态发生蛋白(BMP)的方法，所述方法包括以下步骤：
在使得至少一部分BMP结合于类亲和色谱介质的条件下用包含BMP的溶液负载类亲和色谱介质；
从类亲和色谱介质洗脱至少一部分BMP；
在使得至少一部分BMP结合于疏水性相互作用色谱介质的条件下用来自类亲和色谱介质的含BMP的洗脱液负载疏水性相互作用色谱介质；
从疏水性相互作用色谱介质洗脱至少一部分BMP；
在使得至少一部分BMP结合于阳离子交换介质的条件下，用来自疏水性相互作用色谱介质的含BMP的洗脱液负载阳离子交换介质；
从阳离子交换介质洗脱至少一部分BMP；和
在适合的缓冲液中浓缩BMP。
15.一种从流体纯化骨形态发生蛋白(BMP)的方法，所述方法包括以下步骤：
将包含BMP的流体负载到疏水性相互作用介质上，其中所述流体包含尿素和第一浓度的第一盐，并且其中BMP在呈流体的溶液中；
用第一溶液洗涤疏水性相互作用介质，其中第一溶液中的盐的浓度低于第一浓度，第一溶液不包含尿素，并且BMP在第一溶液中比在流体中更不可溶；和
用不包含第一盐或尿素的第二溶液洗脱BMP。
16.根据权利要求15所述的方法，其中尿素以至少3M的浓度存在于流体中。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述流体包含至少1M氯化钠。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述第二溶液提高BMP的溶解度。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第二溶液包含己二醇。
20.一种从第一溶液纯化骨形态发生蛋白(BMP)的方法，所述方法包括以下步骤：
使疏水性相互作用色谱介质与第一溶液接触，其中所述第一溶液的特征在于其中的BMP的第一溶解度；
使疏水性相互作用色谱介质与第二溶液接触，所述第二溶液的特征在于BMP的第二溶解度低于第一溶解度；和
使疏水性相互作用色谱介质与第三溶液接触，所述第三溶液的特征在于BMP的第三溶解度高于第二溶解度。
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