CN1091153C - 一种制备甲壳质微球载体的方法 - Google Patents

Abstract

一种制备甲壳质微球载体的方法，属于生物化工领域，用于细胞包埋、微生物固定化、细菌固定化发酵、动物细胞贴壁培养、微型缓释及色谱公析等方面。本发明的特征是向甲壳质粉中加入碱液和还原剂，生成脱乙酰甲壳质，再与酸反应生成可溶性盐，用该产物的水溶液在有机溶剂中分散、固化成形，生产出甲壳质微球载体，球径范围0.001～10mm。具有良好的生物亲和性、多孔性、稳定性等优点。

Description

一种制备甲壳质微球载体的方法

本发明涉及一种多糖类微球载体的制备方法，属于生物化工领域。

甲壳质是一切甲壳质类动物及一些微生物所产生的一种天然大分子，水生动物中虾、蟹壳是甲壳质的主要来源，制备出的甲壳质微球产品，可用于细胞包埋、微生物固定化、细菌的固定化发酵、动物细胞的贴壁培养、微型缓释及色谱分析等。具有广泛的用途。近些年来，随着生物、医学和细胞培养工程科学研究的迅猛发展，对甲壳质微球产品的需求及制备方法提出了更高的要求。

日本公开特许公报昭60-208302中公开了一种甲壳质成形体的制备方法，即采用酸降解后的低粘度小分子甲壳质为材料，限定脱乙酰度在50％以下，使用以氯化锂及N-甲基吡咯烷酮为助溶剂的甲壳质溶液，采用自然滴入或喷雾进入甲醇的方法形成颗粒体。该方法的缺点是：因使用的助剂为稀有物质，价格昂贵，因而成本高，过程中因采用自然滴入或喷雾甲醇的方式，所以颗粒大小不易控制，所得载体不规则，不均匀，更重要的是，该方法只适合于低粘度小分子甲壳质材料，适用面窄。

本发明的目的在于提供一种工艺简单，成本低，效率高，旦工艺过程易于控制，不仅适合于低分子甲壳质材料，而且适合于天然高分子甲壳质材料的微球载体的制备方法，采用这一种方法制备出的微球载体，生物亲和性好，更适合于工业、医药及科研方面的需要。

申请人在制备甲壳质微球的工艺中考虑到：甲壳质在一般溶剂中不易溶解、无明显带电荷基因、分子量不易控制，如果部分脱除分子的乙酰基，游离出一定比例的亚氨基，处理后的材料可溶于弱酸或形成其可溶性盐直接使用，这样可最大限度地保持其分子结构的天然状态，具有多孔性，无溶剂残留，功能多，性能稳定，用途广等特点，具体方案是这样实现的：

1、向甲壳质粉中加入碱液和还原剂，加热煮沸使其脱乙酰基，加还原剂的目的是为了保护甲壳胺的半缩醛羟基不受破坏，然后反应物用水冲洗到PH中性后加入有机酸配制成溶液，过滤除去不溶物，再加入碱调节PH，使其沉淀，并冲洗到中性。

生产工艺1中使用的甲壳质是指任何来源的甲壳质材料，碱液可以是氢氧化钠或氢氧化钾溶液，浓度为20～60％，用量可以是甲壳质粉的5～40倍，还原剂可以是硫代硫酸钠，亚硫酸钠、亚硫酸钾、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、硼氢化钠、硼氢化钾等。其用量可以是甲壳胺的1/50～1/5000使用的有机酸可以是柠檬酸、苹果酸、甲酸、乙酸、草酸、乳酸、安息香酸、苯甲酸，浓度为0.1～10％，用量可以是甲壳胺的10～1000倍，碱是使PH达到7～14的碱溶液。

2、将第一步所得的脱乙酰甲壳质加入有机酸溶液倒入分散器中，溶解后加入表面活性剂、分散剂搅拌分散；生产工艺2中使用的有机酸可以是工艺1中所使用的有机酸，其用量可以是甲壳质的10～200倍，所加入的活性剂可以是十二烷基磺酸钠、十二烷基磺酸、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基苯磺酸、T-10、T-8、T-6、SPAN、6501、硬脂酸钠、软脂酸钠、季胺盐或其混合物，用量是甲壳胺溶液的1～20％，所加入的分散剂可以是苯、甲苯、二甲苯、正己烷，环己烷、液状石蜡、石油醚、矿物油，用量是甲壳胺溶液的0.1～100倍。

3、搅拌中加入固化剂，固化成形。固化剂可以是甲醛、乙醛、乙二醛、戊二醛、丙烯醛或其混合物，用量是甲壳胺溶液的1/5～1/1000。固化过程中可以加助剂，也可以不加，助剂可选用次氯酸、次氯酸钠、二氧化氯，双氧水、过氧化钠。其用量是甲壳胺溶液的1/1000～1/10000。

4、持续搅拌控制分散时间及分散速度及至达到要求，搅拌可使微珠一直保持分散状态。分散时间决定着成形体固化的程度，一般需2小时以上，时间短产品的强度不够，时间过长影响其色泽。分散的速度决定着产品的粒度，速度越快，粒度越小，速度慢，粒度大，其控制方法可采用显微镜取样观察，根据对产品的规格的要求调节。

5、固化完成后，分散即可停止，原有的水油混合物变为油相和固相，静置短时间即可完成分层，倒出或过滤出油相，洗涤固相至PH值中性即是湿产品，可以直接使用或筛分后使用，长时间保存要加防腐剂，但用前要洗净。

6、干品是微球作为商品长期保存的最佳状态，其干燥方法是向湿的产品中加入有机溶剂脱水然后烘干。

干燥过程中所使用的有机溶剂是一般易挥发性的有机溶剂可以是甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯，其用量是被干燥物的1～5倍。烘干应本着速度快、不变形，并保持材料的天然结构的原则进行，如选用乙醇做有机溶剂，应在80～85℃烘干较快。而乙醚因其沸点低，可以选择36～45℃烘干。

本工艺第一步所得到的脱乙酰甲壳质，也可以与无机酸反应得到一种可溶性甲壳胺或称甲壳胺盐，若采用可溶性甲壳胺工艺2则不必向分散器中加有机酸，而直接加入水，使其溶解，待溶液透明后，加入活性剂和分散剂搅拌分散制备成形后所得微珠要用水冲洗至无酸根离子。

本发明的优点是：在天然高分子材料甲壳质的基础上，经过化学改造，使其分子上游离出一定比例的亚氨基，分子中的亚氨基可使材料在水相中水合而带正电荷，因此制备出的产品更富有生物相容性；采用了液相分散方法，产品外形规则，颗粒均匀，微球产品球径范围0.001～10mm，生产易于控制，使用偶联形固化剂，区别于自然滴入或喷入甲醇的方法用本方法制备出的产品，不是靠分子的自然凝固成型，而是利用分子之间的化学交联，使微球的机械强度增大，稳定性好。甲壳胺微球载体是一种动物细胞高密度培养的优良材料。

实施例1

取100g甲壳质粉加入300mL 45％浓度的NaOH和0.01g亚硫酸氢化钠，煮沸2小时，抽滤除碱液，洗涤干净；用3.1％的冰乙酸溶液配制成2.9％溶液100mL，加入500mL三角烧瓶中，加液体石蜡烛300mL，用电动搅拌机搅拌2500rpm，加入戊二醛0.1mL，搅拌3小时，静置一分钟，倒出液体石蜡水洗至PH中性，乙醇脱水，81℃烘干筛选，即得本品1.7g，干珠直径为90～120μm。

实施例2

同实施例1中所述的方法制备出甲壳氨10g，与含有1mL 12N HCL的50mL 95％的异丙醇溶液反应30分钟，抽滤后烘干，取2g加到250mL三角烧瓶中，加50mL水溶解，加石油醚160mL，搅拌2700rpm，加甲醛5mL，加次氯酸1mL，搅拌4小时，静置1分钟滤出石油醚，水洗至用AgNO₃溶液检验无氯离子，甲醇脱水，75℃烘干，即得本品1.07g，干珠直径为70～100μm。

Claims (1)

1.一种制备甲壳质微球载体的方法，它的步骤是：向甲壳质粉中加入试剂，生成其衍生物，加入溶剂，再加入分散剂和表面活性剂，搅拌分散；最后加入固化剂，固化成型即得湿产品，干燥即得，其特征是搅拌中加入的固化剂是有机醛，如甲醛、乙醛、乙二醛、戊二醛、丙烯醛或其混合物，其用量是甲壳胺溶液的1/5至1/1000，再加入挥发性的亲水性有机溶剂，按照浓度由低到高的次序逐级脱水干燥，亲水性有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯，其用量是被干燥物的1-5倍，然后用相应溶剂沸点的温度快速烘干。