CN109106975B - 一种具有智能抗菌和长效生物分子释放功能的快速自修复凝胶的制备方法和应用 - Google Patents

一种具有智能抗菌和长效生物分子释放功能的快速自修复凝胶的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种具有智能抗菌和长效生物分子释放功能的快速自修复凝胶的制备方法和应用，将乙二胺四乙酸二钠溶液与硝酸铁溶液混合均匀后，加入到透明质酸溶液中，在室温下混合均匀后，静置，得到自修复凝胶。仅仅通过配位作用便可实现水凝胶的产生，本发明反应周期短，反应条件极易满足，产率高，无副产物，易于实现工业化生产，且能有效提高工作效率。自修复水凝胶可作为被感染组织再生应用的新型生物活性材料，可作为修复炎症皮肤的凝胶贴片。

Description

一种具有智能抗菌和长效生物分子释放功能的快速自修复凝 胶的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及高分子材料技术与生物医用材料领域，具体涉及一种具有智能抗菌和长效生物分子释放功能的快速自修复凝胶的制备方法和应用。
背景技术
水凝胶是一种亲水性3D网络结构聚合物，具有良好的生物相容性、高含水量和可调节的结构性状，从而广泛应用于生物医学领域。该凝胶不仅可以将生物活性分子(例如药物、蛋白质或抗体)嵌入前体溶液中实现靶递送之外，还能够提供与胞外基质相似的环境，其中多孔结构允许营养物、代谢物的交换和细胞迁移，从而促进组织再生。
然而，水凝胶在植入过程中很容易受到微生物的侵袭，可能导致体内的感染和炎症反应，这是组织工程中的一大难题。为了提高水凝胶材料的抗微生物性质，近年来不同研究机构也做了相关的研究，例如将抗菌物质(抗生素/银纳米颗粒)通过物理负载和/或化学反应将抗微生物成分装载在水凝胶网络上。但是，尽管在水凝胶上装载或接枝抗菌物质有利于抑制感染，但持续的抗菌过程还是会出现一些负面问题：例如对正常组织的毒副作用、诱导细菌具有越来越高的耐药性、有效时间很有限、合成步骤复杂等，尤其对哺乳动物细胞的不良作用更为明显。因此，设计一种对正常组织安全无毒，但能由感染部位的细菌触发其抗菌过程的智能水凝胶，对生物医学工程的发展意义重大。
此外，机体内植入的水凝胶在身体日常运动过程中将不可避免的受到持续机械外力的影响，从而导致凝胶变形甚至破损。该过程不仅增加了微生物入侵引起感染的风险，而且凝胶诱导组织再生的性能也将由于结构破坏而极大地削弱。针对以上问题，利用动态可逆的超分子相互作用构筑的水凝胶由于其具有优良的自愈能力因而被广泛关注。各种超分子化学包括氢键、主客体相互作用、静电相互作用和金属—配体配位作用等为自修复水凝胶的构筑提供了可行的途径。然而，同时具有按需抗菌特性以精准抑制细菌生长和自修复特性以确保结构/功能完整性的多功能水凝胶却未被研究发现，这也成为了生物组织工程中亟待解决的一大问题。
发明内容
针对以上现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种具有智能抗菌和长效生物分子释放功能的快速自修复凝胶的制备方法和应用，该方法简单且条件温和，易于工业化生产，制备的凝胶对健康组织无毒副作用、仅能由感染部位细菌触发抗菌过程并且能够快速自修复，此外，能够有效实现细菌感染的缺损组织的再生。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种具有智能抗菌和长效生物分子释放功能的快速自修复凝胶的制备方法，将乙二胺四乙酸二钠溶液与硝酸铁溶液混合均匀后，加入到透明质酸溶液中，在室温下混合均匀后，静置，得到自修复凝胶。
本发明进一步的改进在于，乙二胺四乙酸二钠溶液是将乙二胺四乙酸二钠加入到水中制得，乙二胺四乙酸二钠溶液的浓度为20～30mg/mL；
硝酸铁溶液是将硝酸铁颗粒加入到水中制得，硝酸铁溶液的浓度为20～40mg/mL；
透明质酸溶液是将透明质酸粉末加入到水中制得，透明质酸溶液的浓度为30mg/mL。
本发明进一步的改进在于，透明质酸的分子量为10～100万分子。
本发明进一步的改进在于，透明质酸、硝酸铁、乙二胺四乙酸二钠的摩尔比为(3.2～4.8):2:1。
本发明进一步的改进在于，混合均匀是通过在300-600r/min下搅拌3～10min实现的。
本发明进一步的改进在于，静置的时间为5～24h。
一种自修复凝胶在制备用于修复皮肤的凝胶贴片中的应用。
本发明进一步的改进在于，将血小板衍生生长因子溶解于PBS缓冲液中，得到浓度为0.66ug/mL的血小板衍生生长因子溶液；将自修复凝胶冷冻干燥后在室温下于血小板衍生生长因子溶液中浸渍并温育12小时，使水凝胶吸附血小板衍生生长因子，制得凝胶贴片。
一种自修复凝胶在制备抗菌LB琼脂板中的应用。
本发明进一步的改进在于，在LB琼脂板表面覆盖一层厚度为2mm的自修复凝胶，得到抗菌LB琼脂板。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
1.本发明采用的凝胶基质是透明质酸，其来源广泛，生物相容性良好，在生物体内可降解，且降解产物没有毒性，适用于医学生物领域中，本发明以透明质酸做基底，利用三价铁离子和羧基的配位作用，通过控制其摩尔比和反应时间来制备凝胶，得到的类似细胞尺寸的凝胶孔洞分布均匀，直径在10um左右，有很好的负载药物的能力，能为细胞粘附生长提供适宜场所。
2.本发明巧妙的利用三价铁离子被细菌内还原酶还原成二价铁离子，后二价铁离子在细菌内通过芬顿氧化作用生成羟基自由基，羟基自由基具有强氧化性，极易氧化细菌中的蛋白质和核酸，从而杀灭细菌，这种方法不仅避免了细菌的耐药性，而且能够有效降解细菌形成的生物层，从而同时实现细菌的杀灭和细菌粘附的抑制。
3.本发明凝胶材料对健康组织没有毒副作用、仅能由感染部位细菌分泌特有的酶来触发抑菌过程、外力破坏后可以快速自我修复、凝胶的多孔结构可模拟细胞外基质结构并负载大量的生物活性分子，因此能够实现对有细菌感染的缺损组织的有效修复。
4.本发明实验过程简单易于操作，反应周期短、产率高、原料基本没有损失且对实验条件宽容。
5.本发明在操作过程中不产生有机废液，符合绿色环保的制备条件。
6.本发明无需用到大型昂贵的仪器设备，生产成本低。
附图说明
图1是实施例3提供的多孔结构的水凝胶图，其中，a为低放大倍数下的凝胶形貌图，b为中放大倍数下的凝胶形貌图，c为高放大倍数下的凝胶形貌图，d图为能量色散X射线光谱法测得的元素分布图。
图2是实施例13和实施例14中提供的水凝胶的自修复实验的修复后的效果图。
图3是实施例16、实施例17和实施例18中提供的水凝胶在不同酸碱性环境下的PDGF-BB释放曲线。
图4是实施例19、实施例20和实施例21中提供的水凝胶在不同环境中在透明质酸酶作用下的Fe3+的释放曲线。
图5是实施例22中水凝胶对两种细菌的抑菌实验效果图，其中，a为大肠杆菌、b为金黄色葡萄球菌。
图6是实施例22中水凝胶对细菌抑制对数减少图。
图7是实施例24提供的小鼠伤口愈合情况图。
图8是实施例24提供的小鼠创伤面愈合率统计图。
图9是实施例24提供的CD31阳性微血管分布的效果图。
图10是实施例24提供的CD31阳性微血管的血管密度统计图。
图11是实施例24提供的再生皮肤组织的分布图。
图12是实施例24提供的再生皮肤组织的病例指数图。
图13是实施例24提供的TNF-a、IL-6、IL-1β基因表达对比图。
图14是实施例2-4提供的水凝胶在不同频率下的流变测试图。
图15是实施例2-4提供的水凝胶在不同应变下的流变测试图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但不限于此。
本发明涉及一步法制备多孔结构的水凝胶及以此为基础的生物医用材料的构筑和应用。
一种具有按需抗菌活性和持续生物分子释放的可实现快速自修复的凝胶的制备方法，将乙二胺四乙酸二钠(EDTA)加入到水中制得乙二胺四乙酸二钠溶液、同时将硝酸铁加入到水中制得硝酸铁溶液，将乙二胺四乙酸二钠溶液与硝酸铁溶液混合搅拌3～10min后，加入到透明质酸(HA)溶液中，在室温下搅拌3～10min，静置10～24h后，得到可自修复凝胶。
所述的乙二胺四乙酸二钠溶液的质量浓度为20～30mg/mL，硝酸铁溶液的浓度为20～40mg/mL，透明质酸溶液的质量浓度为30mg/mL；
所述的透明质酸分子量为10～100wDa，透明质酸、硝酸铁、乙二胺四乙酸二钠的摩尔比为(3.2～4.8):1，具体可以为3.2:2:1、4:2:1或4.8:2:1。
本发明制得的自修复多孔凝胶的孔洞分布均匀，直径在10um左右，有很好的负载药物的能力。
下面通过具体实施例进行详细说明。
实施例1
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液。称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。
取300uL 31.92mg/mL的硝酸铁溶液与150uL 29.40mg/mL的EDTA溶液在100-300r/min下搅拌3min混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)100wDa的HA溶液中，在室温300～600r/min下搅拌3min，混合均匀后，静置12h后可以水凝胶。
此条件下得到的水凝胶成胶效果较差，凝胶强度低且结构不稳定。
实施例2
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液。称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。
取400uL 31.92mg/mL的硝酸铁溶液与200uL 29.40mg/mL的EDTA溶液在100-300r/min下搅拌3min混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)100wDa的HA溶液中，在室温300～600r/min下搅拌3min，搅拌均匀后，静置12h后可以水凝胶。
此条件下得到的水凝胶成胶效果较好，孔洞结构明显，孔径分布不均匀。
实施例3
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液。称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。
取500uL 31.92mg/mL的硝酸铁溶液与250uL 29.40mg/mL的EDTA溶液在100-300r/min下搅拌3min混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)100wDa的HA溶液中，在室温300～600r/min下搅拌3min，搅拌均匀后，静置12h后可以水凝胶。
参见图1，此条件下得到的水凝胶成胶效果好，孔洞结构明显，孔径分布均匀，孔径为10um左右。
实施例4
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液。称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。
取600uL 31.92mg/mL的硝酸铁溶液与300uL 29.40mg/mL的EDTA溶液在100-300r/min下搅拌3min混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)100wDa的HA溶液中，在室温300～600r/min下搅拌3min，搅拌均匀后，静置12h后可以水凝胶。
此条件下得到的水凝胶成胶效果较好，孔洞结构明显，孔径分布不均匀。
实施例5
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液。称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。
取500uL 31.92mg/mL的硝酸铁溶液与250uL 29.40mg/mL的EDTA溶液在100-300r/min下搅拌3min混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)10wDa的HA溶液中，在室温300～600r/min下搅拌3min，搅拌均匀后，静置12h后得到水凝胶。
实施例6
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液。称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。
取600uL 31.92mg/mL的硝酸铁溶液与300uL 29.40mg/mL的EDTA溶液在100-300r/min下搅拌3min混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)10wDa的HA溶液中，在室温300～600r/min下搅拌3min，搅拌均匀后，静置12h后得到水凝胶。
实施例7
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液。称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。
取500uL 31.92mg/mL的硝酸铁溶液与250uL 29.40mg/mL的EDTA溶液在100-300r/min下搅拌3min混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)10wDa的HA溶液中，在室温300～600r/min下搅拌3min，搅拌均匀后，静置5h后可得水凝胶。
实施例8
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液。称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。
取600uL 31.92mg/mL的硝酸铁溶液与300uL 29.40mg/mL的EDTA溶液在100-300r/min下搅拌3min混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)100wDa的HA溶液中，在室温300～600r/min下搅拌3min，搅拌均匀后，静置5h后可以水凝胶。
此条件下得到的水凝胶成胶，孔洞结构明显，孔径分布不均匀，强度较弱。
实施例9
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液。称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。
取500uL 31.92mg/mL的硝酸铁溶液与250uL 29.40mg/mL的EDTA溶液在100-300r/min下搅拌3min混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)100wDa的HA溶液中，在室温300～600r/min下搅拌3min，搅拌均匀后，静置10h后可以水凝胶。
此条件下得到的水凝胶成胶，孔洞结构明显，孔径分布不均匀，强度较好。
实施例10
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液。称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。
取600uL 31.92mg/mL的硝酸铁溶液与300uL 29.40mg/mL的EDTA溶液在100-300r/min下搅拌3min混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)100wDa的HA溶液中，在室温300～600r/min下搅拌3min，搅拌均匀后，静置10h后可得水凝胶。
实施例11
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液。称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。
取500uL 31.92mg/mL的硝酸铁溶液与250uL 29.40mg/mL的EDTA溶液在100-300r/min下搅拌3min混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)100wDa的HA溶液中，在室温300～600r/min下搅拌3min，搅拌均匀后，静置24h后可得水凝胶。
实施例12
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液。称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。
取600uL 31.92mg/mL的硝酸铁溶液与300uL 29.40mg/mL的EDTA溶液在100-300r/min下搅拌3min混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)100wDa的HA溶液中，在室温300～600r/min下搅拌3min，搅拌均匀后，静置24h后可得水凝胶。
实施例13水凝胶的自修复性测试：
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液两份，分别加入红、蓝墨水各3滴，称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。取500uL31.92mg/mL的硝酸铁溶液与250uL 29.40mg/mL的EDTA溶液混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)100wDa已经用红蓝墨水染色的HA溶液中，在室温下搅拌3min，搅拌均匀后，静置12h后得到不同颜色水凝胶。
取上述方法制得的红色、蓝色、黄色凝胶各三块，用手术刀切割成两半，后错位拼接，放置观察自修复情况，1min之后，划痕消失，实现自修复。
实施例14水凝胶的自修复性测试：
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液两份，分别加入红、蓝墨水各3滴，称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。取500uL31.92mg/mL的硝酸铁溶液与250uL 29.40mg/mL的EDTA溶液混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)100wDa已经用红蓝墨水染色的HA溶液中，在室温下搅拌3min，搅拌均匀后，静置12h后得到不同颜色水凝胶。
取上述方法制得的红色、蓝色、黄色凝胶各三块，叠加后放置，观察自修复情况，由于接触面够大，在放置2h后，粒子在各凝胶间交换，使凝胶颜色趋于均匀，说明自修复情况良好。情况如图2所示。
实施例15
称取30mg的HA溶于1mL去离子水中，配制成3％(m/v)的HA溶液。称取29.40mg的EDTA溶于1mL去离子水中，配制成29.40mg/mL的EDTA溶液。称取31.92mg的硝酸铁溶于1mL去离子水中，配制成31.92mg/mL的硝酸铁溶液。取500uL 31.92mg/mL的硝酸铁溶液与250uL29.40mg/mL的EDTA溶液混合均匀后；将上述溶液加入到1mL 3％(m/v)100wDa的HA溶液中，在室温下搅拌3min，搅拌均匀后，静置12h后得到水凝胶。
取0.33ug PDGF-BB溶解于500ul PBS缓冲液中得到浓度为0.66ug/mL的PDGF-BB溶液，然后将干燥后的水凝胶在室温下在PDGF-BB溶液中温育12小时，使水凝胶充分吸附PDGF-BB，即得到装载有PDGF-BB的水凝胶。
实施例16水凝胶的药物释放能力测试：
取实施例15中的水凝胶浸泡在10mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在第0，1，3……240小时，取出100uL，测上清液的释放量由Elisa试剂盒测量，再取100uL新鲜的pH＝7.4的PBS加入。图3的测试结果表明，在第240小时，水凝胶释放了PDGF-BB总量的88％。这说明此法制备的水凝胶具有长效释放能力。
实施例17水凝胶的药物释放能力测试：
取实施例15的水凝胶浸泡在10mL pH＝6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在第0，1，3……240小时，取出100uL，测上清液的释放量由Elisa试剂盒测量，再取100uL新鲜的pH＝6.8的PBS加入。图3的测试结果表明，在第12小时，水凝胶释放了PDGF-BB总量的95％以上。这说明此酸性条件的水凝胶不具有长效释放能力。
实施例18水凝胶的药物释放能力测试：
取实施例15的水凝胶浸泡在10mL pH＝8.5的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在第0，1，3……240小时，取出100uL，测上清液的释放量由Elisa试剂盒测量，再取100uL新鲜的pH＝8.5的PBS加入。图3的测试结果表明，在第24小时时，水凝胶释放了PDGF-BB总量的90％以上。这说明此酸性条件的水凝胶不具有长效释放的功能。
实施例19水凝胶的铁离子释放能力测试：
加透明质酸酶：取4mg透明质酸酶(HAase)在37℃溶于1L pH＝7.4的PBS缓冲液中，取10mL上述缓冲液在37℃水浴预热，后取实施例3中的凝胶片浸入到上述溶液中，在第0，1，2……7天，取50uL上清液，离心，并用50uL的上述缓冲液补充，通过原子吸收光谱法测量收集量以定量分析释放的Fe3+。
不加透明质酸酶：取10mL pH＝7.4的PBS缓冲液在37℃水浴预热，后取实施例3中的凝胶片浸入到上述溶液中，在第0，1，2……7天，取50uL上清液，离心，并用50uL的pH＝7.4的PBS缓冲液补充，通过原子吸收光谱法测量收集量以定量分析释放的Fe3+，将加透明质酸酶的与不加透明质酸酶的作对比，详见图4，图4的测试结果表明，在第7天时，在HAase存在的条件下，Fe3+的释放量达到90％以上；而没有HAase时，Fe3+的释放量仅有10％左右。这说明37℃pH＝7.4且有HAase存在的条件下，Fe3+可以实现长效释放。
实施例20水凝胶的铁离子释放能力测试：
加透明质酸酶：取4mg透明质酸酶(HAase)在37℃溶于1L pH＝6.8的PBS缓冲液中，取10mL上述缓冲液在37℃水浴预热，然后取实施例3中的凝胶片浸入到上述溶液中，在第0，1，2……7天，取50uL上清液，离心，并用50uL的上述缓冲液补充，通过原子吸收光谱法测量收集量以定量分析释放的Fe3+。
不加透明质酸酶：取10mL pH＝6.8的PBS缓冲液在37℃水浴预热，后取实施例3中的凝胶片浸入到上述溶液中，在第0，1，2……7天，取50uL上清液，离心，并用50uL的pH＝6.8的PBS缓冲液补充，通过原子吸收光谱法测量收集量以定量分析释放的Fe3+，将加透明质酸酶的与不加透明质酸酶的作对比，详见图4，图4的测试结果表明，在第2天时，在HAase存在的条件下，Fe3+的释放量达到90％以上；而没有HAase时，Fe3+的释放量可达30％左右。这说明37℃pH＝6.8且有HAase存在的条件下，Fe3+不能实现长效释放。
实施例21水凝胶的铁离子释放能力测试：
加透明质酸酶：取4mg透明质酸酶(HAase)在37℃溶于1L pH＝8.5的PBS缓冲液中，取10mL上述缓冲液在37℃水浴预热，后取实施例3中的凝胶片浸入到上述溶液中，在第0，1，2……7天，取50uL上清液，离心，并用50uL的上述缓冲液补充，通过原子吸收光谱法测量收集量以定量分析释放的Fe3+。
不加透明质酸酶：取10mL pH＝8.5的PBS缓冲液在37℃水浴预热，后取实施例3中的凝胶片浸入到上述溶液中，在第0，1，2……7天，取50uL上清液，离心，并用50uL的pH＝8.5的PBS缓冲液补充，通过原子吸收光谱法测量收集量以定量分析释放的Fe3+，将加透明质酸酶的与不加透明质酸酶的作对比，详见图4，图4的测试结果表明，在第3天时，在HAase存在的条件下，Fe3+的释放量达到90％以上；而没有HAase时，Fe3+的释放量可达30％左右。这说明37℃pH＝8.5且有HAase存在的条件下，Fe3+不能实现长效释放。
实施例22
本发明使用两种类型的细菌分别是金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，通过拍照和菌落计数法评估水凝胶的抗微生物活性。首先将细菌以109CFU mL-1的浓度悬浮于PBS中，然后各取100uL分别涂布在LB肉汤(对照组)和水凝胶覆盖的LB肉汤的表面上，12小时后，将样品放入1mL PBS中，剧烈摇动分离所有细菌，接着将悬浮液涂布在覆盖一层厚度为2mm的自修复凝胶的LB琼脂板上，将该LB琼脂平板在37℃温育24小时并记录集落的数量。结果如图5和图6所示，表明水凝胶对大肠杆菌(对数减少＝2.193)和金黄色葡萄球菌(对数减少＝2.564)表现出高抗菌活性，这表明对不同细菌具有强的抗菌性能。
实施例23
取实施例3中的凝胶切割成直径约为50dm的凝胶片，备用；取实施例15中的凝胶也切割成直径约为50dm的凝胶片，备用。
实施例24
取实施例23中的凝胶贴片处理小鼠的伤口，拍照记录小鼠的伤口愈合情况，并计算愈合率，结果如图7-图13所示。图7和图8表明，用实施例15凝胶贴片处理过的小鼠伤口愈合情况最好，即在PDGF-BB与铁离子的共同作用下，小鼠伤口愈合效果最好。
在处理小鼠伤口7天后，检测其对微血管再生的作用，检测结果如图9、图10所示，在载有PDGF的水凝胶组中出现大量微血管，其高于纯水凝胶组和未处理组的水平，同时纯水凝胶组也促进了一部分新血管形成，表明有效抑制细菌水平对于建立良好的血液供应也是重要的。
为了证明负载PDGF的HA-Fe-EDTA水凝胶用于感染皮肤再生的设计性能，本发明主要集中在炎症控制上，检测结果如图11、图12和图13所示，在纯水凝胶组和负载PDGF-BB的水凝胶组中10天后炎症细胞显着减少。在高放大倍数下，有一些新生的皮肤附属物，通过对组织RNA的检测和分析，发现应用HA-Fe-EDTA显着下调促炎症相关基因，这表明炎症已被有效地抑制，且免疫微环境提高了皮肤再生的成功率。
本发明制得的水凝胶可以实现Fe3+的按需释放和生长因子的持续释放以协同促进伤口愈合，同时抑制周围的细菌，用于感染组织再生的应用。
实施例25
分别取实例2-4的凝胶片各一片(实施例2-4依次对应图14中的Fe3+:COOH＝0.4:1-0.6:1的曲线)，利用流变仪进行力学性能的测试，在应变保持1％不变的情况下，测试不同凝胶在不同角频率下的性能，通过比较弹性模量和粘性模量的大小来判断凝胶的性能。由图14可以看出，在不同角频率下，实施例3对应凝胶的弹性模量高达1000Pa，而相应的实例4对应的凝胶弹性模量仅为100Pa，而实例6对应的更低，由此可见当Fe3+:COOH＝0.5:1即实施例3中的凝胶力学性能最好。
实施例26
分别取实例2-4的凝胶片各一片(实施例2-4依次对应图15中的Fe3+:COOH＝0.4:1-0.6:1的曲线)，利用流变仪进行力学性能的测试，在应变角频率1％不变的情况下，测试不同凝胶在不同应变下的性能，通过比较弹性模量和粘性模量的大小来判断凝胶的性能。由图15可以看出，在不同角频率下，实施例3对应凝胶的弹性模量高达200Pa，而相应的实例4、6对应的凝胶弹性模量仅为70Pa，由此可见当Fe3+:COOH＝0.5:1即实施例3中的凝胶力学性能也最好。
本发明构筑的凝胶具有以下多种优异性能：1)该凝胶的多孔结构不仅能够模拟细胞外基质的物理结构，为细胞生长分化提供适宜的场所，而且可以大量负载生物活性物质，并实现长效缓释，从而诱导缺损组织再生；2)在受到外力破坏时，该凝胶可以在极短时间内实现自修复；3)该凝胶具有良好的生物相容性，并能够根据需要智能的抑制生物体的细菌感染并消除相应的炎症。

Claims (9)

1.一种自修复凝胶在制备用于修复皮肤的凝胶贴片中的应用，其中，自修复凝胶的制备方法为：将乙二胺四乙酸二钠溶液与硝酸铁溶液混合均匀后，加入到透明质酸溶液中，在室温下混合均匀后，静置，得到自修复凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种自修复凝胶在制备用于修复皮肤的凝胶贴片中的应用，其特征在于，乙二胺四乙酸二钠溶液是将乙二胺四乙酸二钠加入到水中制得，乙二胺四乙酸二钠溶液的浓度为20～30mg/mL；
硝酸铁溶液是将硝酸铁颗粒加入到水中制得，硝酸铁溶液的浓度为20～40mg/mL；
透明质酸溶液是将透明质酸粉末加入到水中制得，透明质酸溶液的浓度为30mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种自修复凝胶在制备用于修复皮肤的凝胶贴片中的应用，其特征在于，透明质酸的分子量为10～100万。
4.根据权利要求1所述的一种自修复凝胶在制备用于修复皮肤的凝胶贴片中的应用，其特征在于，透明质酸、硝酸铁、乙二胺四乙酸二钠的摩尔比为(3.2～4.8):2:1。
5.根据权利要求1所述的一种自修复凝胶在制备用于修复皮肤的凝胶贴片中的应用，其特征在于，混合均匀是通过在300-600r/min下搅拌3～10min实现的。
6.根据权利要求1所述的一种自修复凝胶在制备用于修复皮肤的凝胶贴片中的应用，其特征在于，静置的时间为5～24h。
7.根据权利要求1所述的一种自修复凝胶在制备用于修复皮肤的凝胶贴片中的应用，其特征在于，将血小板衍生生长因子溶解于PBS缓冲液中，得到浓度为0.66ug/mL的血小板衍生生长因子溶液；将自修复凝胶冷冻干燥后在室温下于血小板衍生生长因子溶液中浸渍并温育12小时，使水凝胶吸附血小板衍生生长因子，制得凝胶贴片。
8.一种自修复凝胶在制备抗菌LB琼脂板中的应用，其中，自修复凝胶的制备方法为：将乙二胺四乙酸二钠溶液与硝酸铁溶液混合均匀后，加入到透明质酸溶液中，在室温下混合均匀后，静置，得到自修复凝胶。
9.根据权利要求8所述的一种自修复凝胶在制备抗菌LB琼脂板中的应用，其特征在于，在LB琼脂板表面覆盖一层厚度为2mm的自修复凝胶，得到抗菌LB琼脂板。
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