CN109071603B

CN109071603B - 呈现黑色素生成促进活性的肽及其的用途

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Publication number: CN109071603B
Application number: CN201780008060.XA
Authority: CN
Inventors: 郑镕池; 金银美; 李应智; J·D·金
Original assignee: Caregen Co Ltd
Current assignee: Caregen Co Ltd
Priority date: 2016-02-18
Filing date: 2017-02-13
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2037-02-13
Also published as: JP6868724B2; ES2796401T3; WO2017142264A1; US20190119321A1; JP2019508488A; CN109071603A; EP3495383A1; EP3418292A4; JP6672483B2; EP3418292B1; KR20170097832A; US10526373B2; JP2020105198A; EP3495383B1; EP3418292A1; KR101841748B1; ES2943393T3

Abstract

本发明提供呈现黑色素生成促进活性的肽。本发明的肽通过使酪氨酸酶的活性及表达增加且使参与黑色素形成的因子的表达增加，来在黑色素生成中呈现优秀的效果。本发明的肽可以作为黑色素减退症的预防、改善及治疗用途利用。上述的本发明的肽的优秀的活性及稳定性可非常有利地适用于医药、医药外品及化妆品。

Description

呈现黑色素生成促进活性的肽及其的用途

技术领域

本发明涉及呈现黑色素生成促进活性的肽、包含上述肽作为有效成分的黑色素减退症的预防和/或治疗用药剂学组合物、包含上述肽作为有效成分的黑色素减退症的预防和/或改善用化妆品组合物及上述肽的黑色素减退症的预防、改善和/或治疗用途。

背景技术

皮肤细胞作为防御机制对紫外线或环境污染及除此之外的外部因子的刺激从存在于表皮基底层的黑素细胞(melanocyte)的黑素体(melanosome)中生成黑色素。黑色素为确定动物的皮肤、眼珠及头发的颜色的重要的因素。众所周知，减退症为皮肤癌的危险因子。东方人对形成过量的黑色素敏感，从而抑制黑色素生成的与美白相关的研究进行得多。但是，近来与通过抑制黑色素生成来呈现的白癜风(Vitiligo)相关的需求也增加，从而还进行对此的研究。

白癜风为由黑色素细胞的凋亡或坏死引起的多种大小及形态的白色斑呈现在皮肤的后天性脱色素疾病。作为发生在全球约1％的人口的比较常见的疾病，没有基于人种或地区的差异。发病年龄在10～30岁中最多，在95％的情况下，发生在40岁以前，30％的患者有家族史。

对于白癜风生成的原因尚未确切的报告，但是提出自身免疫说、神经体液说、黑色素细胞自身破坏说等多种学说。自身免疫说为如下学说：因与黑色素细胞类抗原相关的自身抗体的表达，导致黑色素细胞的破坏或功能异常或由细胞毒性淋巴细胞或激活的淋巴细胞分泌的淋巴因子黑色素细胞被破坏。神经体液说作因儿茶酚胺生物合成的异常和单胺氧化酶的增加等造成与应激相关的过氧化氢，由此黑色素被破坏的学说，白癜风可根据神经节发生或神经损伤或还可以应激之后发病。黑色素细胞自身破坏说为如下学说：作为在黑色素形成过程中生成的中间代谢物质或最终代谢物质的苯酚复合物蓄积在黑色素细胞内，从而破坏细胞。除此之外，还提出固有细胞缺陷(inherent cellular defect)、遗传因素、细胞凋亡、钙代谢异常等多种因子。

黑色素从黑色素生成细胞(melanocytes)合成，通过紫外线照射或吸收毒性物质和化学物质，来在保护皮肤中起到重要的作用。因而，在不正常的发生黑色素合成的人中，与全部皮肤变成白色相比，部分变成白色，从而存在产生斑点的外形上的问题，进一步成为问题的是对外部刺激敏感。

作为在黑色素合成中重要的酶的酪氨酸酶(tyrosinase)、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1，tyrosinase related protein-1)、酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2，tyrosinaserelated protein-2)在氧化反应中作为催化剂起到作用(Pigment Cell Res.14(6)：43744)。

酪氨酸酶起到将酪氨酸(tyrosine)氧化为多巴(DOPA，L-3，4-二羟基苯基丙氨酸(L-3，4-dihydroxyphenylalanine))，将多巴氧化为多巴醌(quinone)的作用，酪氨酸酶相关蛋白-1作为二羟基吲哚羧酸氧化酶(dihydroxyindole carboxylic acid oxidase)参与将5，6-二羟基吲哚-2-羧酸(5，6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid；DHICA)转换为吲哚-5，6-醌-2-羧酸(indol-5，6-quinone-2-carboxylic acid)。并且，酪氨酸酶相关蛋白-1起到稳定酪氨酸酶且调节活性的作用。酪氨酸酶相关蛋白-2作为多巴铬互变异构酶(tautomerase)，通过将多巴铬转换为5，6-二羟基吲哚-2-羧酸，来形成形成黑色素细胞的真黑色素(eumelanon)和苯丙氨酸(pheomelanon)，并根据它们的比率确定皮肤、头发、眼珠的颜色等。

黑色素合成因自外箱照射和促黑素细胞激素(MSH，α-melanocyte stimulatinghormone)激活。众所周知，α-促黑素细胞激素(α-MSH)利用肽激素通过紫外线生成，并且在包括脑下垂体及皮肤的各种细胞中制备。

α-促黑素细胞激素通过旁分泌(paracrine)作用于黑色素生成细胞的黑皮素受体(MCR，melanocortin receptor)，来调节作为转录因子的小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor)的活性，从而调节在黑色素合成中起到重要的作用的酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1(DHICA oxidase)、酪氨酸酶相关蛋白-2(DOPAchrometautomerase)等的活性(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.273，No.31，Issue of July 31，pp.195609565，1998)。

据报道，若黑色素形成细胞由紫外线(UV)或α-促黑素细胞激素受到刺激，则分别由p38或蛋白激酶A(PKA，protein kinase A)酪氨酸酶激活。但是，据报道在两种途径中，尤其，α-促黑素细胞激素→环磷腺苷(cAMP)→蛋白激酶A在黑色素合成中起到重要的作用，环磷腺苷的增加促进环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-responsive element bindingprotein)的磷酸化，环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-responsive element bindingprotein)的磷酸化促进作为转录因子的小眼畸形相关转录因子的表达，作为转录因子的小眼畸形相关转录因子的表达提高酪氨酸酶的活性，并使酪氨酸酶信使核糖核酸(mRNA)的表达增加(Nucleic Acids Res.30(14)：3096106，Pigment Cell Melanoma Res 21(6)：66576)。

另一方面，包括韩国的东方人希望具有白色皮肤，因此多进行与抑制黑色素生成的美白成分相关的研究。但是从皮肤的黑色素生成细胞合成黑色素，通过紫外线照射或吸收毒性物质和化学物质，来在保护皮肤中起到重要的作用。在不呈现黑色素的正常合成的情况下，皮肤对外部刺激敏感且在外形上看起来也非正常，因此需要治疗为黑色素合成正常，并还进行与此相关的研究。但是，到目前为止未充分地进行与促进黑色素合成相关的技术开发。

本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术领域的水平及本发明的内容。

发明内容

技术问题

本发明人努力开发可促进黑色素生成的肽，其结果，确认由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽呈现优秀的黑色素生成促进活性，并阐明它们可有效地使用于黑色素减退症的预防及治疗，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供由序列1或序列2的氨基酸序列组成的呈现黑色素生成促进活性的肽。

本发明的再一目的在于，提供黑色素减退症的预防和/或治疗用药剂学组合物，包含选自由序列1的氨基酸序列组成的肽及由序列2的氨基酸序列组成的肽中的一种以上的肽作为有效成分。

本发明的另一目的在于，提供黑色素减退症的预防和/或改善用化妆品组合物，包含选自由序列1的氨基酸序列组成的肽及由序列2的氨基酸序列组成的肽中的一种以上的肽作为有效成分。

根据以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图更加明确本发明的其他目的及优点。

解决问题的方案

本发明的一实施方式涉及由序列1或序列2的氨基酸序列组成的呈现黑色素生成促进活性的肽。

本发明人努力开发可促进黑色素生成的肽，其结果，确认由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽呈现优秀的黑色素生成促进活性，并阐明它们可有效地使用于黑色素减退症的预防和/或治疗，从而完成了本发明。

本发明的肽可包含序列1或序列2的氨基酸序列，例如，可由序列1或序列2的氨基酸序列组成。

本发明的肽为本发明人通过与基因及蛋白质表达变化等相关的实验，从本发明热保留的肽文库中筛选黑色素形成促进功效优秀的肽，作为本发明的肽提供共两种。

在本说明书中，“肽”是指由肽键氨基酸残基相互结合而形成的线型分子。可通过本领域的公知的化学合成方法，尤其固相合成技术(solid-phase synthesis techniques；Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85：2149-54(1963)；Stewart，et al.，Solid PhasePeptide Synthesis，2nd.ed.，Pierce Chem.Co.：Rockford，111(1984))或液相合成技术(US授权专利第5516891号)制备本发明的肽。

作为本发明的肽选定氨基酸序列的一部分部位，为了增加其活性，可诱导肽的N-末端和/或C-末端变形。

例如，上述C-末端变形可以为肽的C-末端变形为羟基(-OH)、氨基(-NH₂)、叠氮化合物(-NHNH₂)等，但不限定于此。

并且，上述N-末端变形可以为肽的N-末端结合有选自乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基及硬脂酰基及聚乙二醇(PEG)中的一种以上的保护基，但不限定于此。上述保护基起到从生物体内的蛋白质切割酶的攻击保护本发明的肽的作用。

上述肽的N-末端和/或C-末端变形起到大大地对肽的稳定性进行改善的作用，通过这种变形，本发明的肽可使生物体内给药时的半衰期增加，从而具有高半衰期。

在本说明书中术语“稳定性”是不仅指体内稳定性而且还指储存稳定性(例如，常温储存稳定性)。

根据本发明的一实施方式，本发明的肽在黑色素形成细胞中使黑色素生成增加，使作为调节黑色素合成的酶的酪氨酸酶的活性及表达增加，使作为参与黑色素形成因子的小眼畸形相关转录因子(MITF)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)的表达增加，使环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化增加。

这种结果是指本发明的肽增加黑色素生成，从而具有缓解白癜风的效果。因此，本发明的肽可作为黑色素减退症的预防、改善和/或治疗用途利用。

在本发明中黑色素减退症可以为白癜风、白化病、脱色素痣、白色糠疹、花斑癣、炎症后脱色、斑状硬皮病、部分性白化病、特发性点状色素减少症和/或点状白化病，但不限定于此。

本发明的再一实施方式涉及黑色素减退症的预防和/或治疗用药剂学组合物，包含选自由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽中的一种以上的肽作为有效成分。

本发明的组合物包含上述的本发明的肽作为有效成分，因而为了避免本说明书过于复杂，省略它们之间的共同的记载内容。

在本发明的组合物制备成药剂学组合物的情况下，可包含上述的本发明的肽的药剂学有效量(pharmaceutically effective amount)。

并且，上述药剂学组合物还可包含在药剂学上接受的载体，但不限定于此。

在本说明书中，术语“药剂学有效量”是指在实现上述的肽的功效或活性中充分的量。

包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体作为制剂时通常所使用的物质，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和/或矿物油等，但并不限定于此。

本发明的药剂学组合物除了上述成分之外还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保鲜剂等。

优选地，本发明的药剂学组合物以非口服的方式给药，例如，可通过皮肤局部给药进行给药。

本发明药剂学组合物的适合的给药量由制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病理状态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应反应性等因素多样，普通熟练的医生可容易地确定及处方对期望的治疗或预防有效的给药量。根据本发明的优选实例，本发明的药剂学组合物的1日给药量为0.001～1000mg/Kg。

本发明的药剂学组合物通过本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位容量的形态制备或内入于多容量容器内来制备。此时，剂型为油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液的形态，或可以为浸膏剂、粉剂、颗粒剂、片剂、凝胶(例如，水凝胶)的形态，还可包含分散剂或稳定剂。

本发明的另一实施方式涉及黑色素减退症的预防和/或改善用化妆品组合物，包含选自由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽中的一种以上的肽作为有效成分。

在本发明的组合物制备成化妆品组合物的情况下，可包含上述的本发明的肽的化妆品有效量(cosmetically effective amount)。

并且，上述化妆品组合物还可包含在化妆品上接受的载体，但不限定于此。

在本说明书中，术语“化妆品有效量”是指在实现上述的本发明的组合物的功效中充分的量。

本发明的化妆品组合物可制备成本发明所属领域中通常制备的任何剂型，例如，可剂型化为溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、乳霜、乳液、粉、肥皂、含有表面活性剂的洁面剂、油、粉状粉底、乳浊液粉底、蜡粉底和/或喷雾剂的剂型等，但不限定于此。详细地，可制备成柔肤化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜、洁面霜、洗面奶、卸妆水、面膜、喷雾剂和/或粉的剂型。

上述化妆品组合物的剂型为糊剂、乳霜或凝胶的情况下，可利用动物性油、植物性油、蜡、石蜡、淀粉、胺黄树胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石和/或氧化锌等作为载体成分，但不限定于此。

上述化妆品组合物的剂型为粉或喷雾剂的情况下，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉作为载体成分，尤其，在喷雾剂的情况下，还可包含氯氟烃、丙烷/丁烷和/或二甲醚等的推进剂，但不限定于此。

上述化妆品组合物的剂型为溶液或乳浊液的情况下，利用溶剂、增溶剂或乳化剂作为载体成分，例如有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇和/或山梨糖醇的脂肪酸酯。

上述化妆品组合物的剂型为悬浮液的情况下，作为载体成分可利用液体稀释剂，如水、乙醇或丙二醇等；悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇，聚氧乙烯山梨醇酯和/或聚氧乙烯脱水山梨醇酯等；微晶纤维素；偏氢氧化铝；膨润土；琼脂和/或胺黄树胶等，但不限定于此。

在上述化妆品组合物的剂型为含有表面活性剂的洁面剂的情况下，可利用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物性油、羊毛脂衍生物和/或乙氧基化甘油脂肪酸酯等作为载体成分，但不限定于此。

包含于本发明的化妆品组合物的成分除了作为有效成分的肽类和载体成分之外，包含通常利用于化妆品组合物的多种成分，例如，可包含抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料及香料等的通常的助剂，但不限定于此。

发明的效果

本发明涉及呈现黑色素生成促进活性的肽、包含上述肽作为有效成分的黑色素减退症的预防和/或治疗用药剂学组合物、包含上述肽作为有效成分的黑色素减退症的预防和/或改善用化妆品组合物及上述肽的黑色素减退症的预防、改善和/或治疗用途，本发明的肽通过使酪氨酸酶的活性及表达增加且使参与黑色素形成的因子的表达增加，来在黑色素生成中呈现优秀的效果，由优秀的活性及稳定性可非常有利地适用于医药、医药外品及化妆品。

附图说明

图1a为对由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的黑色素形成增加效果进行确认的结果。

图1b为对由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的黑色素形成增加效果进行确认的结果。

图2a为对由本发明一实施例的由序列1的氨基酸序列组成的肽酪氨酸酶的活性增加进行确认的结果。

图2b为对由本发明一实施例的由序列2的氨基酸序列组成的肽酪氨酸酶的活性增加进行确认的结果。

图3a为对由本发明一实施例的由序列1的氨基酸序列组成的肽小眼畸形相关转录因子、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1的信使核糖核酸(mRNA)的表达增加进行确认的结果。

图3b为对由本发明一实施例的由序列2的氨基酸序列组成的肽小眼畸形相关转录因子、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1的信使核糖核酸的表达增加进行确认的结果。

图4a为对由本发明一实施例的由序列1的氨基酸序列组成的肽小眼畸形相关转录因子、酪氨酸酶的蛋白质表达增加进行确认的结果。

图4b为对由本发明一实施例的由序列2的氨基酸序列组成的肽酪氨酸酶的蛋白质表达增加进行确认的结果。

图5为对基于本发明一实施例的由序列1的氨基酸序列组成的肽的环磷腺苷效应元件结合蛋白的磷酸化增加进行确认的结果。

最佳实施方式

提供由序列1或序列2的氨基酸序列组成的呈现黑色素促进活性的肽。

具体实施方式

以下，通过实施例更加详细说明本发明。这种实施例只用于更加详细说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

实施例

合成例1：肽的合成

将700mg的氯三苯甲基氯树脂(Chloro trityl chloride resin；CTL resin，Novabiochem Cat No.01-64-0021)放入反应容器中，并放入10ml的二氯甲烷(MC)来搅拌了3分钟。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(DMF)来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的二氯甲烷溶液放入反应器中，并放入200mmole的Fmoc-Asp(OtBu)-OH(Bachem，Swiss)及400mmole的二异丙基乙胺(DIEA)后，搅拌并均匀溶解，搅拌1小时并进行反应。反应后清洗，将甲醇和二异丙基乙胺(2：1)溶解于二氯甲烷(DCM，dechloromethane)中，反应10分钟，并用过量的二氯甲烷/二甲基甲酰胺(1：1)进行清洗。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(DMF)来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的脱保护溶液(20％的哌啶(Piperidine)/二甲基甲酰胺)放入反应容器中，并在常温条件下搅拌10分钟后，去除了溶液。放入同量的脱保护溶液，并重新维持10分钟反应后，去除溶液，并分别以3分钟的方式用二甲基甲酰胺清洗2次、用二氯甲烷清洗1次、用二甲基甲酰胺清洗1次，来制备了Asp(OtBu)-CTL Resin树脂。在新的反应器中放入10ml的二甲基甲酰胺溶液，并加入200mmole的Fmoc-Glu(OtBu)-OH(Bachem，Swiss)、200mmole的羟基苯并三唑(HoBt)及200mmole的苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(Bop)后，搅拌来均匀溶解。在反应器中，经过2次以分馏的方式放入400mmole的N，N-二异丙基乙胺(DIEA)后，搅拌至所有固体溶解为止至少5分钟。将溶解的氨基酸混合溶液放入具有脱保护的树脂的反应容器中，在常温条件下搅拌1小时并进行反应。去除反应液，并用二甲基甲酰胺溶液每次搅拌5分钟，并搅拌3次后去除。取少量的反应树脂，并利用凯撒测试(Nihydrin test)检查了反应程度。使用脱保护溶液，以与上述方法相同的方法进行2次脱保护反应，来制备了Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-CTL Resin树脂。使用二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分清洗，并重新执行一次凯撒测试，接着以与上述方法相同的方法执行了以下氨基酸附着实验。根据选定的氨基酸序列，按Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Trp-OH及Fmoc-Arg(Pbf)-OH的顺序进行连锁反应。利用脱保护溶液使Fmoc-保护基以10分钟的方式反应2次后，清洗干净并去除。利用二甲基甲酰胺、二氯甲烷及甲醇，分别将放入乙酸酐和N，N-二异丙基乙胺、羟基苯并三唑(HoBt)乙酰化1小时后制备的肽基树脂清洗3次，使氮气慢慢流入来干燥后，在五氧化二磷(Phosphorus pentoxide，P₂O₅)条件下，减压成真空状态，来完全干燥后，放入30ml的泄漏溶液[95％的三氟乙酸(TFA，Trifluroacetic acid)、2.5％的蒸馏水、2.5％的苯甲硫醚(Thioanisole)]，接着，在常温条件下微动一下，并维持2小时反应。通过过滤对树脂进行过滤，并利用少量的溶液清洗树脂后，与母液进行混合。利用减压蒸馏至剩有总容积的一半左右的容积，并加入50ml的凉的醚诱导沉淀后，进行离心分离来收集沉淀，并利用更凉的醚清洗2次。去除母液，并在氮条件下充分干燥，来合成了0.65g的纯化前的Arg-Trp-Arg-Arg-Lys-Ile-Glu-Asn肽(收率：92.0％)。当利用分子量测定仪测定时，可得到的分子量为1157.3(理论值：1157.33)。并且，还与上述相同的方法进行了由序列2的氨基酸写形成的肽的合成。

表1

实施例1：黑色素形成阵列

在37℃的培养器下，在6-孔培养用平板中，将黑色素形成细胞(B16F10细胞株)培养24小时后，去除各个板的培养基，并更换为新的培养基后，按浓度处理肽。培养72小时后去除培养液，并摘除细胞后，转移到1.5ml的管，来在13000rpm下进行3分钟的离心分析，并去除上清液，通过回收细胞聚合体，来观察黑色素。针对于细胞聚合体，放入每次150μl的2M的NaOH，并在60℃的温度下，将细胞内黑色素溶解30分钟。针对于溶解在在96-孔平板的各个孔而获得的上清液，以100μl的方式放入，来在490nm条件下测定吸光度，并在图1a及图1b示出。

如从图1a及图1b可确认，当对小鼠黑色素细胞株B16F10处理由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽时，在小鼠黑色素细胞株B16F10中，确认了黑色素形成的增加。

实施例2：酪氨酸酶活性试验

将黑素瘤细胞株(B16F10)在6-孔培养用平板中培养24小时，并按浓度处理肽来培养了72小时。将6-孔培养用平板放在冰上，并利用凉的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后，放入300μL的含有1％的TritonX-100的0.1M的磷酸钠缓冲液(pH6.8，溶解缓冲液)，并将细胞收集到1.5mL的管，来将在-270℃的温度下进行速冻后解冻的反应重复5次来破坏细胞膜。在13000rpm下进行20分钟的离心分离后，将上清液收集到另一个1.5mL的管中，并对这些试样的蛋白质进行定量。稀释至试样的蛋白质浓度相同，以3个孔的方式接种在96孔培养用平板上，并加入20μL的10mM的L-多巴(L-dopa)，在37℃的温度下培养1小时后，在475nm下测定了吸光度。

如从图2a及图2b可确认，当对小鼠黑色素细胞株B16F10处理由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽时，细胞内酪氨酸酶的活性增加。

实施例3：黑色素生成相关的基因的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

将黑色素形成细胞(B16F10细胞株)在6-孔培养用平板中培养24小时后，按浓度处理肽。提取培养72小时的细胞的核糖核酸(RNA)后，制备了互补脱氧核糖核酸(cDNA)。利用作为参与黑色素形成的因子的与小眼畸形相关转录因子及酪氨酸酶相关的各个特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)，来观察各个基因的表达变化，并在图3a及图3b示出其结果。

表2

序列号	引物的命名	序列表(5’-3’)
			3	小眼畸形相关转录因子_F	CCAGCCTGGCGATCATGTCAT
4	小眼畸形相关转录因子_R	GGTCTGGACAGGAGTTGCTG
			5	酪氨酸酶_F(tyrosinase_F)	GGCCAGCTTTCAGGCAGAGG
6	酪氨酸酶_R(tyrosinase_R)	TGGTGCTTCATGGGCAAAAT
			7	酪氨酸酶相关蛋白1_F	TCTGTGAAGGTGTGCAGGAG
8	酪氨酸酶相关蛋白1_R	CCGAAACAGAGTGGAAGGTT

如从图3a及图3b可确认，当对小鼠黑色素细胞株B16F10处理由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽时，作为参与黑色素形成过程的转录因子的小眼畸形相关转录因子、酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白1的信使核糖核酸的表达增加。

实施例4：与黑色素生成相关的蛋白质免疫印迹

将黑色素形成细胞(B16F10细胞株)在6-孔培养用平板中培养24小时后，按浓度处理本肽。培养72小时后，溶解细胞，并利用特异性抗体(2种均为美国桑塔克鲁兹生物技术公司(Santacruz biotechnology，USA))对作为参与黑色素形成的因子的小眼畸形相关转录因子及酪氨酸酶的表达通过免疫印迹确认，并在图4a及图4b示出其结果。

如从图4a可确认，当对小鼠黑色素细胞株B16F10处理由序列1的氨基酸序列组成的肽时，作为参与黑色素形成过程的转录因子的小眼畸形相关转录因子及作为酶的酪氨酸酶的蛋白质表达增加。

并且，如从图4b可确认，当对小鼠黑色素细胞株B16F10处理由序列2的氨基酸序列组成的肽时，参与黑色素形成过程的酪氨酸酶的蛋白质表达增加。

实施例5：与黑色素生成相关的蛋白质活性试验

将黑色素形成细胞(B16F10细胞株)在6-孔培养用平板中培养24小时后，按浓度处理本肽。培养72小时后，溶解细胞，并利用特异性抗体(美国细胞信号技术(Cell SignalingTechnology，USA))对作为参与黑色素形成的信号传递物质的环磷腺苷效应元件结合蛋白的通过免疫印迹进行确认，并在图5示出。

如从图5可确认，当对小鼠黑色素细胞株B16F10处理由序列1的氨基酸序列组成的肽时，作为参与黑色素形成过程的因子的磷腺苷效应元件结合蛋白的磷酸化水平增加。

以上，详细说明了本发明的特定部分，但可以明确的是，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，这些具体说明只属于一个实例，本发明的范围不局限于此。因此，本发明的实质性范围由所附的发明要求保护范围和其等同技术方案来定义。

产业上的可利用性

序列表

<110> CAREGEN CO., LTD.

<120> 呈现黑色素生成促进活性的肽及其的用途

<130> PP170016

<160> 8

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽1

<400> 1

Arg Trp Arg Arg Lys Ile Glu Asn

1 5

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2

<400> 2

Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> MITF正向引物

<400> 3

ccagcctggc gatcatgtca t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> MITF反向引物

<400> 4

ggtctggaca ggagttgctg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 酪氨酸酶正向引物

<400> 5

ggccagcttt caggcagagg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 酪氨酸酶反向引物

<400> 6

tggtgcttca tgggcaaaat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> TRP1正向引物

<400> 7

tctgtgaagg tgtgcaggag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> TRP1反向引物

<400> 8

ccgaaacaga gtggaaggtt 20

Claims

1.一种肽，呈现黑色素生成促进活性，其由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的肽用于制造使酪氨酸酶的活性增加的组合物的用途。

3.根据权利要求1所述的肽用于制造使选自小眼畸形相关转录因子及酪氨酸酶相关蛋白1中的黑色素合成相关因子的表达增加的组合物的用途。

4.根据权利要求1所述的肽用于制造使酪氨酸酶的表达增加的组合物的用途。

5.根据权利要求1所述的肽用于制造使环磷腺苷效应元件结合蛋白的磷酸化增加的组合物的用途。

6.一种黑色素减退症的预防或治疗用药剂学组合物，其包含选自由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽及由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽中的一种以上的肽作为有效成分。

7.根据权利要求6所述的药剂学组合物，其中所述黑色素减退症为白癜风、白化病、脱色素痣、白色糠疹、花斑癣、炎症后脱色、斑状硬皮病、部分白皮症、特发性点状色素减少症或点状白皮症。

8.一种黑色素减退症的预防或改善用化妆品组合物，其包含选自由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽及由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽中的一种以上的肽作为有效成分。

9.根据权利要求8所述的化妆品组合物，其中所述黑色素减退症为白癜风、白化病、脱色素痣、白色糠疹、花斑癣、炎症后脱色、斑状硬皮病、部分白皮症、特发性点状色素减少症或点状白皮症。

10.由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽用于制造黑色素减退症的预防或治疗用药剂学组合物的用途。

11.由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽用于制造黑色素减退症的预防或改善用化妆品组合物的用途。